(41)-第6.4章免疫電泳技術(shù)

第六章第四部分免疫電泳技術(shù)大家好！本節(jié)課我要跟大家一起分享的內(nèi)容是免疫電泳技術(shù)。在上次課中，我們學(xué)習(xí)了凝膠內(nèi)免疫沉淀試驗(yàn)的前兩個(gè)分類：?jiǎn)蜗蛎庖邤U(kuò)散試驗(yàn)和雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)。本次課我們將重點(diǎn)介紹一下第3個(gè)凝膠內(nèi)免疫沉淀試驗(yàn)：免疫電泳技術(shù)。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字）1953年，Grabar和Williams首次將凝膠擴(kuò)散置于直流電場(chǎng)中進(jìn)行，讓電流來加速抗原與抗體的擴(kuò)散并規(guī)定其運(yùn)行方向，由此建立了免疫電泳技術(shù)。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字）該技術(shù)有三大特點(diǎn)：第一是加快了沉淀反應(yīng)的速度，第二是抗原抗體的擴(kuò)散方向固定集中，提高了靈敏度；第三是可先利用蛋白組分所帶電荷的不同而將其進(jìn)行分離，再分別與抗體反應(yīng)。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字）隨著免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，免疫電泳技術(shù)可分為對(duì)流免疫電泳、火箭免疫電泳、免疫電泳、免疫固定電泳、交叉免疫電泳和自動(dòng)化免疫電泳等多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，并且已經(jīng)廣泛被應(yīng)用于科學(xué)研究和臨床實(shí)驗(yàn)診斷領(lǐng)域。下面我們首先來學(xué)習(xí)一下對(duì)流免疫電泳。對(duì)流免疫電泳(counterimmunoelectrophoresis，CIEP)的原理是將雙向免疫擴(kuò)散與電泳相結(jié)合的定向加速的免疫擴(kuò)散技術(shù)。在堿性緩沖液中，蛋白質(zhì)抗原帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極泳動(dòng)，而作為抗體的IgG因其分子量大，暴露的極性基團(tuán)較少，解離也少，在電場(chǎng)中也緩慢向正極，但電滲作用使其向負(fù)極移動(dòng)的速度超過了IgG向正極移動(dòng)的速度，因此抗體向負(fù)極移動(dòng)。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的圖片）實(shí)驗(yàn)時(shí)，在瓊脂板上打兩排孔，左側(cè)陰極端各孔加入待測(cè)抗原，右側(cè)陽極端孔內(nèi)放入相應(yīng)抗體，通電后在電場(chǎng)中做定向?qū)α饕苿?dòng)加速沉淀的形成，帶負(fù)電荷的抗原向正極抗體側(cè)泳動(dòng)，而抗體藉以電滲作用向負(fù)極抗原側(cè)移動(dòng)，在抗原和抗體間形成肉眼可見的沉淀線，當(dāng)抗原過量時(shí)沉淀線接近抗體側(cè)。比如這張圖就展示了對(duì)流免疫電泳的結(jié)果：所謂對(duì)流，只是部分IgG的電滲作用所致。為什么這樣說呢？我們前面已經(jīng)學(xué)過，IgG有多種亞型，對(duì)于IgG1和IgG2來說，所帶負(fù)電荷較少，受電滲的作用力大于電泳，而對(duì)于IgG3和IgG4來說，它們的性質(zhì)與一般蛋白質(zhì)相同，故是向正極涌動(dòng)，所以說對(duì)流只是IgG1和IgG2的電滲作用所致。本實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)便、快速，靈敏度比雙向免疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)提高了8-16倍，可測(cè)定的蛋白質(zhì)濃度最低限度可達(dá)μg/ml水平。該方法常用于抗原或抗體的性質(zhì)、效價(jià)和純度測(cè)定，但不適合于抗原為免疫球蛋白或抗原抗體遷移率接近的情況，否則會(huì)導(dǎo)致抗原和抗體朝同一個(gè)方向涌動(dòng)。剛才介紹了對(duì)流免疫電泳，接下來我們一起來學(xué)習(xí)一下火箭免疫電泳。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字）火箭免疫電泳(rocketimmunoelectrophoresis，RIE)技術(shù)是將單向免疫擴(kuò)散與電泳相結(jié)合的一種定向加速的免疫擴(kuò)散試驗(yàn)。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的圖片）它是將抗體混于瓊脂糖中，電泳時(shí)抗體不移動(dòng)，在含抗體的瓊脂板一端打一排抗原孔，加入待測(cè)標(biāo)本后，將抗原置負(fù)極端，用橫距2～3mA／cm的電流強(qiáng)度進(jìn)行電泳。抗原泳向正極，在抗原抗體比例恰當(dāng)處發(fā)生結(jié)合沉淀。隨著泳動(dòng)抗原的減少，抗原泳動(dòng)的基底區(qū)越來越窄，抗原抗體復(fù)合物形成的沉淀線逐漸變窄，形成一個(gè)狀如火箭的沉淀峰。這張圖展示的就是火箭免疫電泳的結(jié)果：在實(shí)驗(yàn)中抗體濃度保持不變，峰的高度與抗原量呈正比，用已知濃度標(biāo)準(zhǔn)抗原作對(duì)照，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)沉淀峰的高度從標(biāo)準(zhǔn)曲線中計(jì)算出待測(cè)抗原的濃度。反過來，如果在瓊脂糖中固定抗原，也可用于抗體濃度的測(cè)定?；鸺庖唠娪局荒軠y(cè)定μg/ml以上的物質(zhì)含量，低于此水平則難以形成可見的沉淀峰。如果想提高靈敏度，可結(jié)合放射自顯影技術(shù)進(jìn)行，用125I標(biāo)記抗原或抗體，通過放射顯影進(jìn)行檢測(cè)，其靈敏度可達(dá)ng/ml水平。常用于IgA、IgG等蛋白的定量測(cè)定。影響火箭電泳的因素很多，操作時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：1、所用瓊脂應(yīng)是無電滲或電滲很小2、電泳終點(diǎn)時(shí)間的確定。3、待測(cè)標(biāo)本數(shù)量多時(shí)，應(yīng)將電泳板先置電泳槽并開啟電源。4、做IgG定量時(shí)，可先進(jìn)行甲?；＝酉聛?，我們一起來學(xué)習(xí)一下第3種免疫電泳技術(shù)：免疫電泳。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字）免疫電泳(immunoelectrophoresis，IEP)技術(shù)，又稱免疫區(qū)帶電泳-免疫雙擴(kuò)散試驗(yàn)，是區(qū)帶電泳與雙向免疫擴(kuò)散相結(jié)合的一種免疫化學(xué)分析技術(shù)。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的圖片）它的原理是先利用區(qū)帶電泳技術(shù)將不同電荷和分子量的蛋白質(zhì)抗原在瓊脂內(nèi)分離開，然后再與電泳方向平行的兩側(cè)開槽并加入抗血清，置室溫或37℃使兩者擴(kuò)散，各區(qū)帶蛋白在相應(yīng)位置與抗體反應(yīng)形成弧形沉淀線?？乖吭蕉?，則反應(yīng)沉淀線越接近抗體槽，形成較粗的沉淀弧線，反之，則形成的沉淀線較細(xì)。將沉淀弧的位置、形態(tài)與已知標(biāo)準(zhǔn)抗原、抗體生成的沉淀弧進(jìn)行比較，可分析待測(cè)樣品中所含成分的種類與性質(zhì)。如：多發(fā)性骨髓瘤患者血清在免疫電泳后，可觀察到異常的M蛋白沉淀弧，其他類型的免疫球蛋白形成的沉淀弧比對(duì)照沉淀弧要明顯細(xì)且短。下面這張圖展示的就是免疫電泳的操作流程：先進(jìn)行電泳，再在槽內(nèi)加入抗血清，抗血清會(huì)與凝膠內(nèi)的抗原形成沉淀線。免疫電泳是一種定性實(shí)驗(yàn)，目前大量應(yīng)用于純化抗原和抗體成分的分析以及正常和異常體液蛋白的識(shí)別與鑒定等方面。接下來，我們一起來學(xué)習(xí)一下第4種免疫電泳技術(shù)：免疫固定電泳。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字）免疫固定電泳(immunofixationelectrophoresis，IFE)是一項(xiàng)很有價(jià)值的區(qū)帶電泳和免疫沉淀反應(yīng)相結(jié)合的技術(shù)。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的圖片）免疫固定電泳的原理是先將血清蛋白質(zhì)在瓊脂糖凝膠介質(zhì)上經(jīng)電泳分離后，將固定劑和抗血清加于已分離的蛋白質(zhì)泳道上或?qū)⒁鸭涌寡宓臑V紙貼于其上，經(jīng)孵育后，固定劑和抗血清在凝膠內(nèi)滲透并擴(kuò)散，抗原與抗體直接發(fā)生沉淀反應(yīng)，洗脫游離的抗體，形成的抗原抗體復(fù)合物則保留在凝膠中。經(jīng)漂洗和染色，參考泳道和抗原抗體沉淀區(qū)帶被著色，根據(jù)電泳移動(dòng)距離分離單克隆組分，可對(duì)各類免疫球蛋白及其輕鏈進(jìn)行分型。比如，這張圖中，左圖顯示該患者的IgGκ型輕鏈蛋白明顯增多,中間這張圖顯示該患者的IgGλ型輕鏈蛋白明顯增多，右圖為正常人血清中的免疫球蛋白含量及分布情況。免疫固定電泳具有多種優(yōu)點(diǎn)，比如分辨率強(qiáng)、敏感度高、操作周期短，結(jié)果易于分析等，現(xiàn)最常用于M蛋白的鑒定與分型，也已在醫(yī)學(xué)研究、法醫(yī)學(xué)、基因診斷和臨床實(shí)驗(yàn)室中得到了廣泛的應(yīng)用。接下來，我們一起來了解一下另外兩種免疫電泳技術(shù)：交叉免疫電泳和自動(dòng)化免疫電泳。（在介紹此標(biāo)紅部分內(nèi)容時(shí)插入下面的文字）交叉免疫電泳是將區(qū)帶電泳和火箭免疫電泳相結(jié)合的免疫電泳分析技術(shù)，是一種有效的抗原蛋白定量分析技術(shù)，它一次性可對(duì)多種抗原進(jìn)行定量，分辨率比較高，適用于比較各種蛋白組分。近年來，伴隨著自動(dòng)化免疫電泳儀的推出，使免疫電泳技術(shù)的操作變得更加簡(jiǎn)單、快速，只需人工加標(biāo)本、固定劑和抗血清，其余步驟均實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，而且做出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有分