動物生物技術(shù)(課件)

動物生物技術(shù)

動物科技學(xué)院

1超級細(xì)菌用抗生素使得細(xì)菌的抗藥性越來越強(qiáng)，還指耐甲氧苯青霉素金黃色葡萄球菌，是皮膚細(xì)菌的一種英國科學(xué)家發(fā)明了一種電子鼻，它能夠嗅出患者是否感染了抗藥性極強(qiáng)的“超級細(xì)菌”，準(zhǔn)確率很高。通常的培養(yǎng)基檢測，需要2到3天才能確定“超級細(xì)菌”的存在。比利時布魯塞爾大學(xué)附屬醫(yī)院宣布，在這家醫(yī)院接受治療的一名巴基斯坦裔比利時男子因?yàn)楦腥玖恕俺壊【?，?010年6月底不治身亡21、緒論2、分子生物學(xué)基礎(chǔ)3、動物基因工程基礎(chǔ)4、動物細(xì)胞工程5、動物胚胎工程6、動物細(xì)胞核移植7、干細(xì)胞技術(shù)8、轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)9、基因敲除和RNA干涉10、動物分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)11、動物分子診斷及免疫技術(shù)12、動物營養(yǎng)生物技術(shù)3第一章緒論一、動物生物技術(shù)概述二、動物生物技術(shù)的發(fā)展歷程及其應(yīng)用三、動物生物技術(shù)發(fā)展趨勢四、前景五、生物技術(shù)與中國六、面臨問題41982年，國際合作及發(fā)展組織對生物技術(shù)這一名詞進(jìn)行了重新定義：生物技術(shù)是應(yīng)用自然科學(xué)及工程學(xué)的原理，依靠微生物、動物、植物體作為反應(yīng)器將物料進(jìn)行加工以提供產(chǎn)品來為社會服務(wù)的技術(shù)。5動物生物技術(shù)：以動物為主要研究對象，采用基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵（微生物）工程等現(xiàn)代生物技術(shù)對動物品質(zhì)和性狀進(jìn)行改造的生物技術(shù)，包括獲得新型生物制品或飼料添加劑，培育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆的畜禽品種，是生物技術(shù)的重要組成部分。6

基因工程(DNA重組技術(shù))細(xì)胞工程(細(xì)胞雜交技術(shù)、細(xì)胞組織培養(yǎng)和體細(xì)胞雜交技術(shù))酶工程微生物工程蛋白質(zhì)工程生物技術(shù)7基因工程

應(yīng)用人工方法把不同生物的遺傳物質(zhì)從細(xì)胞中分離出來，在體外進(jìn)行切割和拼接，并將重組后的DNA導(dǎo)入某種宿主或個體，從而改變它們的遺傳特征，育成新的品種或使新的遺傳信息在新的宿主細(xì)胞或個體中大量表達(dá)，以獲得基因產(chǎn)物（多肽或蛋白質(zhì)）

細(xì)胞工程：

指以細(xì)胞為基本單位，在體外條件下進(jìn)行培育、繁殖，或人為地使細(xì)胞某些生物學(xué)特征按照人們的意愿改良和創(chuàng)造新品種，加速繁殖動植物個體，獲得某種有用的物質(zhì)的技術(shù)。8單細(xì)胞藻類培養(yǎng)

細(xì)胞工程一些單細(xì)胞低等植物如單細(xì)胞藻類的大規(guī)模培養(yǎng)成為細(xì)胞工程的重要組成部分獲得蛋白質(zhì)資源、營養(yǎng)食品、精細(xì)化工產(chǎn)品等等9高等植物細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞工程高等植物細(xì)胞具有全能性。從高等植物的幼胚、根、莖、葉、花和果實(shí)等不同器官的組織中分離的單個細(xì)胞，經(jīng)過特殊培養(yǎng)形成愈傷組織，并可進(jìn)一步誘導(dǎo)生成完整的植株10利用動物細(xì)胞工程生產(chǎn)一些藥品，如紅細(xì)胞生成素、抗血友病因子、組織纖溶酶原激活物（tPA）等等

細(xì)胞工程動物細(xì)胞培養(yǎng)11細(xì)胞融合、細(xì)胞重組、雜交瘤技術(shù)

細(xì)胞工程細(xì)胞融合是將不同種類的兩種細(xì)胞經(jīng)過特殊處理后放在一起，在某些促融因子作用下發(fā)生融合，形成雜種細(xì)胞細(xì)胞重組是把不同種類的細(xì)胞的部件重新組合裝配，包括核的移植、葉綠體移植、核糖體重建及線粒體裝配等雜交瘤技術(shù)是通過細(xì)胞融合產(chǎn)生特異雜交瘤細(xì)胞12酶工程：

指利用酶、細(xì)胞器或細(xì)胞所具有的催化功能，或?qū)γ高M(jìn)行修飾改造，并借助生物反應(yīng)器和工藝過程來生產(chǎn)人類所需產(chǎn)品的一種技術(shù)。13發(fā)酵工程：

利用微生物生長速度快、生長條件簡單以及代謝過程中的特殊性等特點(diǎn)，在合適的條件下，通過現(xiàn)代化工程技術(shù)手段，利用微生物特定功能生產(chǎn)出人類所需產(chǎn)品的一種技術(shù)。14蛋白質(zhì)工程

指在基因工程的基礎(chǔ)上，結(jié)合蛋白質(zhì)晶體學(xué)、計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和蛋白質(zhì)化學(xué)等多學(xué)科知識，通過基因的人工定向改造等手段，從而達(dá)到對蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾、改造、拼接以產(chǎn)生能滿足人類需要的新型蛋白質(zhì)的一種技術(shù)15幾點(diǎn)說明——任何一個高等動物的細(xì)胞或個體都有兩套獨(dú)立的遺傳系統(tǒng)：一套是我們所熟知的由細(xì)胞核里的全部基因所組成的遺傳系統(tǒng)，這是主要的遺傳系統(tǒng)，負(fù)責(zé)生物體結(jié)構(gòu)和細(xì)胞絕大部分的生命活動；另一套是由細(xì)胞質(zhì)里的線粒體和葉綠體的DNA所組成的細(xì)胞質(zhì)遺傳系統(tǒng)，植物的細(xì)胞質(zhì)遺傳系統(tǒng)有線粒體和葉綠體兩種，動物的細(xì)胞質(zhì)遺傳系統(tǒng)只有線粒體一種。

（1）多利并不是與母體完全一樣的克隆16細(xì)胞質(zhì)遺傳系統(tǒng)與細(xì)胞核遺傳系統(tǒng)有著密切的關(guān)系，但線粒體和葉綠體DNA上的基因是細(xì)胞核的染色體上所沒有的，因此，細(xì)胞質(zhì)遺傳系統(tǒng)的功能不能由細(xì)胞核遺傳系統(tǒng)來代行。由于動物的精子不為后代提供細(xì)胞質(zhì)，所以高等動物的線粒體是通過母系的細(xì)胞質(zhì)來遺傳的，即其后代的所有線粒體都來自于母親，與父親無關(guān)。多利的細(xì)胞核來自芬蘭母羊，但線粒體DNA分析確認(rèn)了多利的線粒體來自蘇格蘭黑面母羊，由于線粒體在細(xì)胞生命活動中具有極其重要的功能，與許多生理活動密切相關(guān)，因此多利在生理上與其母體也會有明顯的差異。17多利的誕生顯示了用生物技術(shù)復(fù)制與母體完全一樣的個體的可能性：如果接受體細(xì)胞的去核卵與體細(xì)胞是來自于同一個個體，則所得的復(fù)制體的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核里的基因都與母體是完全一樣的，這樣的克隆才是母體真實(shí)的復(fù)制品。女性有可能用自身的體細(xì)胞和自身的去核卵細(xì)胞克隆出與自己的遺傳組成、生理特征完全一樣的個體；而克隆技術(shù)不可能用男性的體細(xì)胞復(fù)制出與原來個體在遺傳上完全相同的克隆。18（2）即使是女性，也不可能復(fù)制出

與自身心理完全一樣的個體心理的形成不僅與個人的遺傳相關(guān)，而且與個人的社會經(jīng)歷和社會環(huán)境密切相關(guān)。（因此，對于人這種以心智和社會性為其本質(zhì)特征的生物，用克隆技術(shù)復(fù)制不會有任何進(jìn)步的意義。）19（3）通過體細(xì)胞克隆所得到的生物體與通過正常兩性生殖產(chǎn)生的生物體在生存能力上可能會存在差別動物的體細(xì)胞的最多分裂次數(shù)是有限制的，而且每一次分裂都會在其染色體上留下年齡的標(biāo)記，這種母體的真實(shí)復(fù)制品的生理年齡也可能與它的實(shí)際出生年齡會不一致，即克隆動物個體可能會出現(xiàn)早衰現(xiàn)象,對多利所進(jìn)行的生理監(jiān)測似乎也表明正是如此。20克隆羊的意義——理論意義：證明已分化的高等動物的體細(xì)胞仍然具有潛在的遺傳表達(dá)全能性，也證明了用現(xiàn)代生物技術(shù)復(fù)制或克隆高等動物甚至人類的可能性。12生肖已經(jīng)克隆了一半21三、趨勢：基因操作技術(shù)日新月異；基因工程藥物和疫苗研究和開發(fā)突飛猛進(jìn)；轉(zhuǎn)基因植物和動物取得重大突破；闡明生物體基因組及其編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能是當(dāng)今生命科學(xué)發(fā)展的一個主流方向；基因治療、細(xì)胞核移植克隆、胚胎干細(xì)胞等技術(shù)取得重大研究進(jìn)展；蛋白質(zhì)工程；信息技術(shù)飛速發(fā)展。22最終目標(biāo):生產(chǎn)商業(yè)產(chǎn)品典型的技術(shù)密集型產(chǎn)業(yè)；市場迅速擴(kuò)張；世界各國政府高度重視；生物制藥是現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的支柱；現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)品不斷增加；經(jīng)營現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)品的公司競爭強(qiáng)烈；研究目標(biāo)日趨集中，生產(chǎn)產(chǎn)品更加專一；醫(yī)學(xué)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程最快。23四、現(xiàn)代生物技術(shù)的前景1、對人類生活的影響更加準(zhǔn)確的診斷、預(yù)防或治愈傳染病和遺傳疾病；有效地提高作物的產(chǎn)量，獲得具有抗蟲、抗真菌、抗病毒、抗逆境等優(yōu)良性狀的植物；開發(fā)制造可以生產(chǎn)化學(xué)藥物、生物多聚體、氨基酸、酶類和各種食品添加劑的微生物和動物細(xì)胞；創(chuàng)造帶有更多優(yōu)良性狀的家畜和其他動物；簡化從環(huán)境中清除污染物和廢棄物的程序。242、對人類社會及環(huán)境的影響經(jīng)過基因改造的生物體是否會對其他生物體或環(huán)境造成危害；使用和開發(fā)基因工程生物是否會降低自然界的遺傳多樣性；人是否可以成為基因工程操作的對象；基因診斷的程序會不會侵犯個人隱私；農(nóng)業(yè)生物技術(shù)是否會徹底改變傳統(tǒng)的耕作方式；用現(xiàn)代生物技術(shù)生產(chǎn)的藥物進(jìn)行治療是否會壓抑同樣有效的傳統(tǒng)的治療方式發(fā)展中國家的生物多樣性資源如何得到保護(hù)。等等25中國科學(xué)家參與了人類基因組計(jì)劃中1％人類基因組序列的測定，成為人類基因組計(jì)劃的唯一的發(fā)展中國家；參與了新近啟動的人類基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）的國際項(xiàng)目，承擔(dān)10％的任務(wù)；率先完成了秈稻品種基因組的框架圖以及粳稻品種第四條染色體的精細(xì)序列分析。五、現(xiàn)代生物技術(shù)與中國262008年7月9日，一個值得注意的日子——中國國務(wù)院常務(wù)會議通過，投資240億元人民幣巨資，以期：獲得一批具有重要應(yīng)用價值和自主知識產(chǎn)權(quán)的基因培育一批抗病蟲、抗逆、優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、高效的重大轉(zhuǎn)基因生物新品種轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展從1983年首例轉(zhuǎn)基因植物(煙草和馬鈴薯)培育成功開始，已經(jīng)經(jīng)歷了技術(shù)成熟期(1983—1993年)、以首例轉(zhuǎn)基因作物延熟保鮮番茄在美國批準(zhǔn)上市為標(biāo)志的產(chǎn)業(yè)發(fā)展期(1994—2005年)、從2006年商業(yè)化種植面積超過1億公頃開始的戰(zhàn)略機(jī)遇期(2006—2016年)271、農(nóng)業(yè)生物技術(shù)：

⑴轉(zhuǎn)基因水稻、大豆、小麥、棉花、番茄、煙草等；轉(zhuǎn)基因植物種植面積排在世界第4位，轉(zhuǎn)基因抗蟲棉占棉花種植面積的40％，是轉(zhuǎn)基因植物種植增長率最高的國家；28遺傳標(biāo)記遺傳育種生長激素生產(chǎn)能力轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器體細(xì)胞克隆基因工程疫苗動物胚胎工程動物營養(yǎng)（2）、動物生物技術(shù)動物基因工程育種29優(yōu)點(diǎn)：1、產(chǎn)量高；

2、質(zhì)量好；生物活性最高

3、純化工藝相對簡單；

4、生產(chǎn)成本低。30獲得供器官移植的純種豬需要：

去掉豬抗原性

移入人抗凝血因子

近交20代約需20年克隆技術(shù)使純種豬培育時間大為縮短。31轉(zhuǎn)基因動物研究還存在不少技術(shù)問題：1、基因的內(nèi)在作用了解尚不夠深刻，難以構(gòu)建具有可調(diào)控的高效表達(dá)的轉(zhuǎn)化基因；2、外源DNA在動物細(xì)胞染色體上的整合機(jī)制尚不清楚；3、有效性低；4、病毒基因可能從整合點(diǎn)脫離，成為染色體外的獨(dú)立復(fù)制成分，恢復(fù)病毒特性，從而造成細(xì)胞功能紊亂或死亡；325、動物模型與預(yù)期不符；6、檢測方法限制；7、轉(zhuǎn)基因動物的生產(chǎn)性能不盡人意；8、克隆繁殖出現(xiàn)基因異常比例超過40％。33胚胎工程技術(shù)：冷凍保存技術(shù)胚胎移植體外生產(chǎn)胚胎胚胎克隆性別鑒定34動物營養(yǎng)1、酶制劑纖維素分解酶、植酸酶、戊聚糖酶2、甘露寡糖（替代抗生素）3、氨基酸微量元素螯合物4、合成氨基酸（賴氨酸、蛋氨酸、色氨酸）352、醫(yī)藥生物技術(shù)（1）基因藥物：中國已成功生產(chǎn)了重組乙肝疫苗，人干擾素α1b(rhuIFNα1b)

、人干擾素α2a(rhuIFNα2a)、人干擾素γ(rhuIFNγ)、重組腺病毒－p53抗癌注射液、白細(xì)胞介素2（rhuIL-2）、人紅細(xì)胞生成素（rhuEPO）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）、鏈激酶（rSK）等20種藥物。36（2）基因治療實(shí)驗(yàn)室研究階段臨床試驗(yàn)和應(yīng)用階段肥胖病基因治療、血液替器官代品開發(fā)、人基因轉(zhuǎn)化的豬器官移植61％基因治療病例為惡性腫瘤，24％為艾滋病37六、面臨的問題：創(chuàng)新能力不足而造成的過多的仿制；研究和開發(fā)投入嚴(yán)重不足；生物技術(shù)開發(fā)與產(chǎn)業(yè)化的機(jī)制不很完善；低水平的重復(fù)；專業(yè)和管理頂尖人才緊缺。38第二章

動物生物技術(shù)的分子生物學(xué)基礎(chǔ)39一、遺傳信息傳遞的方向―――中心法則蛋白質(zhì)的生物活性氨基酸順序特定的三維結(jié)構(gòu)的完整性40遺傳信息從基因轉(zhuǎn)變成具有生物活性的功能蛋白質(zhì)是通過兩種“密碼”介導(dǎo)：遺傳密碼，通過遺傳密碼將mRNA多核苷酸順序譯成線性多肽鏈；折疊密碼（foldingcode）,其決定存在于氨基酸順序中一維結(jié)構(gòu)信息向蛋白質(zhì)特定的三維結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變。RNA多肽鏈蛋白質(zhì)41二、DNA的復(fù)制1、DNA復(fù)制從特定的位點(diǎn)開始酵母的自主復(fù)制序列（ARS）

ATTTATPuTTTATAAATAPyAAAT2、半保留復(fù)制3、半不連續(xù)復(fù)制

4、DNA復(fù)制具有高度的忠實(shí)性DNA聚合酶的自我校正功能

5、多種酶和蛋白因子協(xié)同作用DNA復(fù)制的特點(diǎn)：421，復(fù)制起點(diǎn)43θ

復(fù)制或重新起始（denovoinitiation

）或復(fù)制叉式（replicationfork

）

雙鏈環(huán)狀DNA的復(fù)制眼可以形成一種θ結(jié)構(gòu)，形狀像希臘字母θ單向復(fù)制雙向復(fù)制44D環(huán)復(fù)制（Displacementform

）又稱置換式線粒體和葉綠體DNA的復(fù)制方式45

σ復(fù)制或滾環(huán)式復(fù)制（rollingcirclereplication）或共價延伸方式（covalenceelongation）由于復(fù)制時產(chǎn)生的滾環(huán)結(jié)構(gòu)形狀象σ，稱σ復(fù)制

病毒、細(xì)菌因子，如含有單鏈環(huán)狀DNA的φX174、G4、M1346線性DNA雙鏈的復(fù)制單一起點(diǎn)、單向，如：腺病毒單一起點(diǎn)、雙向，如：T7噬菌體多個起點(diǎn)、雙向472、半保留復(fù)制1958年，Meselson和Stahl證明DNA半保留復(fù)制。半保留復(fù)制是遺傳消息能準(zhǔn)確傳代的保證。是物質(zhì)穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)。

StahlMeselson48

3、岡崎片段與半不連續(xù)復(fù)制（okazaki1968年）49（OriCinE.colichromosomalDNA)大腸桿菌的DNA復(fù)制?四個9bp的重復(fù)序列

dnaA結(jié)合位點(diǎn)?三個13bp的重復(fù)序列若干GATC位點(diǎn)50

*

轉(zhuǎn)錄激活*DnaA識別并結(jié)合復(fù)制起點(diǎn)，DnaB－DnaC六聚體與oriC形成預(yù)引發(fā)體

*

DnaG加入形成引發(fā)體（oriC引發(fā)體），合成引物RNA*引物合成后，DNApol組裝到引發(fā)的RNA上，完成復(fù)制體的組裝簡單復(fù)制過程5152復(fù)制終止a、終止序列

E.coli有兩個終止區(qū)域，分別結(jié)合專一性的終止蛋白序列一：terEterDterA

序列二：terFterBterC

每個區(qū)域只對一個方向的復(fù)制叉起作用53b.專一性終止蛋白

E.coli中由tusgene編碼通過抑制DNA螺旋酶而發(fā)揮終止作用ter54554、DNA損傷與修復(fù)光復(fù)活切除修復(fù)重組修復(fù)SOS修復(fù)56phR471aa（一）photoreactivation（光復(fù)活）----TT--------AA--------TT--------AA--------TT--------AA--------TT--------AA----可見光激活可見光（最有效波長400nm）激活生物界廣泛分布（高等哺乳動物除外）的光復(fù)活酶，該酶分解嘧啶二聚體。是一種高度專一的修復(fù)形式，只分解由于UV照射而形成的嘧啶二聚體。57（二）切除修復(fù)（excisionrepair）即在一系列酶的作用下，將DNA分子中受損傷的部分切除掉，并以完整的那一段為模板，合成出切去的部分，從而使DNA恢復(fù)正常。這是一種比較普遍的修復(fù)機(jī)制。細(xì)胞的修復(fù)功能對于保護(hù)遺傳物質(zhì)DNA不受破壞有重要意義。58（三）重組修復(fù)（recombinationrepair）又稱復(fù)制后修復(fù)（post-replicationrepair）受損傷的DNA在進(jìn)行復(fù)制時，跳過損傷部位，在子代DNA鏈與損傷相對應(yīng)部位出現(xiàn)缺口。通過分子間重組，從完整的母鏈上將相應(yīng)的堿基順序片段移至子鏈的缺口處，然后再用合成的多核苷酸來補(bǔ)上母鏈的空缺，此過程即重復(fù)修復(fù)。并非完全校正。59（四）SOS修復(fù)允許子鏈DNA復(fù)制合成時越過親鏈上受損傷的片段而不形成缺口旁路系統(tǒng)是DNA受到嚴(yán)重?fù)p傷、細(xì)胞處于危急狀態(tài)時所誘導(dǎo)的一種DNA修復(fù)方式，修復(fù)結(jié)果只是能維持基因組的完整性，提高細(xì)胞的生成率，但留下的錯誤較多，又稱傾錯性修復(fù)（Error-ProneRepair）60三、原核和真核生物基因結(jié)構(gòu)的特征原核基因：

1、功能相關(guān)的基因大多是以操縱子結(jié)構(gòu)出現(xiàn)；

2、蛋白質(zhì)基因通常以單拷貝的形式存在；3、編碼RNA的基因通常是多拷貝的；4、位于DNA上的各種調(diào)控元件的DNA順序是多種多樣的，為基因表達(dá)調(diào)控的多樣性和精確性提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。61真核基因：1、復(fù)雜的染色體結(jié)構(gòu)：著絲點(diǎn)、端粒，與DNA復(fù)制起點(diǎn)一起構(gòu)成染色體不可缺少的三要素。2、DNA重復(fù)順序重復(fù)序列的存在是真核生物DNA區(qū)別于原核生物DNA的一個重要特征。623、基因的不連續(xù)性（外顯子、內(nèi)含子）４、真核生物基因組中有許多來源相同、結(jié)構(gòu)相似、功能相關(guān)的基因組成為單一的基因簇或基因家族（genefamily）Alu序列家族；5、存在串聯(lián)重復(fù)基因。63四、RNA的轉(zhuǎn)錄和RNA的加工發(fā)生在細(xì)胞核中，以DNA分子為模板，按照堿基互補(bǔ)的原則，合成一條單鏈的RNA即mRNA，DNA分子攜帶的遺傳信息被轉(zhuǎn)移到RNA分子中。其過程與DNA的復(fù)制基本相同。轉(zhuǎn)錄的起始轉(zhuǎn)錄的延伸轉(zhuǎn)錄的終止

1、RNA轉(zhuǎn)錄64RNA聚合酶（RNA-pol）

1、不需要引物，能發(fā)動新鏈，也能延長多核苷酸鏈

2、合成方向5‘→3’，按堿基配對原則（A-U,C-G）

3、要求有完整的DNA雙鏈或單鏈為模板4、需要4種三磷酸核苷酸----ATP,GTP,UTP及CTP為反應(yīng)底物5、能識別DNA鏈上起始點(diǎn)特點(diǎn)：轉(zhuǎn)錄的起始65大腸桿菌RNA聚合酶------a2bb′s

a2bb′+s=a2bb′s核心酶+s=全酶分子量功能a36512決定轉(zhuǎn)錄的基因b150618催化轉(zhuǎn)錄b′155613結(jié)合DNA模板(開鏈)s70263辨認(rèn)起始點(diǎn)66真核生物的RNA聚合酶RNA聚合酶ⅠⅡⅢ別名rRNA聚合酶不均一RNA聚合酶小分子RNA聚合酶定位核仁核質(zhì)核質(zhì)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物tRNAmRNAtRNA.5srRNAα-鵝膏蕈堿的影響不敏感高度敏感中度敏感67σ因子辨認(rèn)起始點(diǎn)RNA聚合酶全酶結(jié)合到起始點(diǎn)

打開雙鏈RNA鏈合成開始σ因子脫落，RNA鏈延長轉(zhuǎn)錄的起始681）與轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)的DNA序列－10區(qū)pribnow框（TATAAT）：RNA聚合酶的牢固結(jié)合位點(diǎn)；－35區(qū)Sextama框（TTGACA）：RNA聚合酶的識別位點(diǎn)。一般來說，對于給定的啟動子，其特異性序列趨于啟動子共有序列時－10與－35區(qū)之間的間距趨于17bp時，啟動子的轉(zhuǎn)錄效率可能就高。天然啟動子中這段距離多為15－20bp.69編碼鏈AACTGTATATTA模板鏈TTGACATATAAT3’5’DNA轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)Pribnow盒子啟動子35

10

+1轉(zhuǎn)錄區(qū)5’3’RNA轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)與新生RNA鏈第一個核甘酸相對應(yīng)DNA鏈上的堿基?！裨松飭幼咏Y(jié)構(gòu)70典型啟動子的結(jié)構(gòu)-35-10轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)16-19bpTTGACATATAAT5-9bp71真核生物的啟動子：①帽子位點(diǎn)及轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)，其堿基大多是A②TATA框：轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游－30區(qū)到－25區(qū)段，框內(nèi)任何堿基的替代突變都使轉(zhuǎn)錄活性降低，是絕大多數(shù)真核基因正確表達(dá)所必需的

③在起始位點(diǎn)的上游－50、－75、－100左右都存在與基因轉(zhuǎn)錄起始有關(guān)的序列：－75區(qū)附近的CAAT框可能控制著轉(zhuǎn)錄起始的頻率④增強(qiáng)子

⑤負(fù)控制序列72真核生物啟動子的結(jié)構(gòu)核心啟動子（corepromoter）上游啟動子元件（upstreampromoterelement，UPE）73上游啟動子元件●包括CAAT盒（CCAAT）和GC盒（GGGCGG）等●作用：控制轉(zhuǎn)錄起始頻率CAAT：-70--80bpGGGCGG：-80--110bp74轉(zhuǎn)錄的延伸在轉(zhuǎn)錄泡上進(jìn)行7553DNA原核生物轉(zhuǎn)錄過程中的羽毛狀現(xiàn)象核糖體RNARNA聚合酶76出現(xiàn)延宕

∞減少DNA序列中的G·C堿基對的含量∞RNA聚合酶沒有校對能力，轉(zhuǎn)錄過程沒有校對機(jī)制

∞轉(zhuǎn)錄的精確性必須依靠RNA聚合酶在選取互補(bǔ)核苷酸或拒絕非互補(bǔ)核苷酸的立體化學(xué)特性真核生物轉(zhuǎn)錄延長過程與原核生物大致相似，但因有核膜相隔，沒有轉(zhuǎn)錄與翻譯同步的現(xiàn)象。77轉(zhuǎn)錄的終止

RNA聚合酶在DNA模板上停頓下來不再前進(jìn)，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA鏈從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物上脫落下來，就是轉(zhuǎn)錄終止。強(qiáng)終止子－內(nèi)部終止子弱終止子－需要ρ因子（rhofactor）又稱為ρ依賴性終止子（Rho-dependentterminator）不依賴Rho(ρ)因子的轉(zhuǎn)錄終止依賴Rho(ρ)因子的轉(zhuǎn)錄終止78ATPA.依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止因子：六聚體蛋白、水解各種核甘三磷酸促使新生RNA鏈從三元轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中解離出來，從而終止轉(zhuǎn)錄。79RNA聚合酶ρ因子附在RNA鏈上ρ因子RNA鏈形成一個發(fā)夾結(jié)構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停止，ρ因子利用ATP能滑行ρ因子發(fā)揮解螺旋酶活性，解開發(fā)夾和RNA-DNA依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止80B.非依賴Rho因子的轉(zhuǎn)錄終止DNA模板上靠近終止處，有些特殊的堿基序列，轉(zhuǎn)錄出RNA后，RNA產(chǎn)物形成特殊的結(jié)構(gòu)來終止轉(zhuǎn)錄。81

終止效率與二重對稱序列和寡聚U的長短有關(guān)，長度效率82莖環(huán)結(jié)構(gòu)使轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)理使RNA聚合酶變構(gòu)，轉(zhuǎn)錄停頓；使轉(zhuǎn)錄復(fù)合物趨于解離，RNA產(chǎn)物釋放。5′pppG5335RNA-pol83原核生物和真核生物初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物都需經(jīng)一定程度的加工才具有活性。原核生物RNA加工、真核生物RNA加工2、RNA加工84原核生物中rRNA前體的加工

甲基化作用專一核酸外切酶30S前體17StRNA25S專一核酸外切酶16SrRNAtRNA23SrRNA5S

rRNA專一核酸外切酶855pppGp…5GpppGp…pppG

ppi鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶5

m7GpppGp…甲基轉(zhuǎn)移酶SAM帽子結(jié)構(gòu)的生成5ppGp…磷酸酶

Pi86帽子結(jié)構(gòu)功能：①能被核糖體小亞基識別，促使mRNA和核糖體的結(jié)合；②m7Gppp結(jié)構(gòu)能有效地封閉mRNA5’末端，以保護(hù)mRNA免受5’核酸外切酶的降解，增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定。87

特異內(nèi)切酶識別AAUAAA及隨后的GUGUGUG并在其間酶切，在3‘端聚合50-200poly(A)I.協(xié)助成熟的mRNA從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)；II.提高mRNA在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性；III.作為核糖體的識別信號，使mRNA得以有效翻譯；

加尾883、RNA剪接剪接：剪接體與處于內(nèi)含子5ˊ端的5ˊ剪接位點(diǎn)和3ˊ端的3ˊ剪接位點(diǎn)相互作用而完成。89剪接體：一類復(fù)雜的核糖核蛋白顆粒，由核小RNA（smallnuclearRNAs,snRNA）和各種蛋白質(zhì)組成。snRNA:分子內(nèi)富含尿嘧啶核苷酸，稱為U1、U2、U4、U5、U6。snRNP:snRNA與特定的蛋白質(zhì)結(jié)合，組成特定的核小RNA蛋白體。完整的剪接體就是通過UsnRNP之間RNA同蛋白質(zhì)、RNA同RNA以及蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用組裝而成。904、RNA的編輯編輯（editing）是指轉(zhuǎn)錄后的RNA在編碼區(qū)發(fā)生堿基的突變、加入或丟失等現(xiàn)象。91尿苷酸的缺失和添加1986.R.Benne在研究錐蟲線粒體mRNA轉(zhuǎn)錄加工時發(fā)現(xiàn)mRNA的多個編碼位置上加入或丟失尿苷酸，1990年在高等動物和病毒中也發(fā)現(xiàn)了編輯現(xiàn)象。92原核生物與真核生物mRNA的特征比較

1、原核生物mRNA的特征●半衰期短●多以多順反子的形式存在

多順反子mRNA：編碼多個蛋白質(zhì)的mRNA。單順反子mRNA：只編碼一個蛋白質(zhì)的mRNA?！?’

端無“帽子”結(jié)構(gòu)，3’

端沒有或只有較短的poly（A）結(jié)構(gòu)。SD序列：mRNA中用于結(jié)合原核生物核糖體的序列。

932、真核生物mRNA的特征●5’

端存在“帽子”結(jié)構(gòu)●多數(shù)mRNA

3’

端具有poly（A）尾巴（組蛋白除外）●以單順反子的形式存在“基因”的分子生物學(xué)定義：產(chǎn)生一條多肽鏈或功能RNA所必需的全部核甘酸序列。94原核生物和真核生物mRNA結(jié)構(gòu)的比較95五、翻譯－蛋白質(zhì)的生物合成1、遺傳密碼：UAA、UGA、UAG＋61個密碼子特點(diǎn)：①通用性；②兼并性；搖擺假說③遺傳密碼使用的偏倚性：蛋白質(zhì)生物合成時對兼并密碼子使用的頻率不同，對于一個給定的氨基酸而言，有的密碼子使用頻率明顯高于其它密碼子?！诨虻幕瘜W(xué)合成過程中，可通過選擇性的使用“高頻”密碼，改善基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)水平。96④

密碼子的不重疊性和閱讀方向。⑤酵母、無脊椎動物、脊椎動物的線粒體以及在支原體中的遺傳密碼出現(xiàn)了一些偏離。UGA→色氨酸AGA、AGG（精氨酸）→終止密碼AUA（異亮氨酸）→甲硫氨酸CUA（亮氨酸）→蘇氨酸

AGA（精氨酸）→絲氨酸972、蛋白質(zhì)生物合成的過程蛋白質(zhì)的生物合成過程是由肽鏈的氨基端到羧基端依次加氨基酸的肽鏈成長過程，每次在已有肽鏈的羧基端加上一個氨基酸。以mRNA為模板，氨基酸經(jīng)活化獲得的氨酰tRNA為原料，GTP、ATP供能，在核糖體中完成。98翻譯過程中，由于每一個氨基酸是嚴(yán)格按照mRNA模板的密碼序列被逐個合成到肽鏈上，因此，mRNA上的遺傳信息被準(zhǔn)確地翻譯成特定的氨基酸序列。細(xì)胞質(zhì)中，翻譯是一個快速過程，一段mRNA可以相繼與多個核糖體相結(jié)合，同時連續(xù)進(jìn)行多條同一種新肽鏈的合成。遺傳信息流由DNARNA蛋白質(zhì)流動。RNA的自我復(fù)制，反轉(zhuǎn)錄99保證蛋白質(zhì)合成正確性的機(jī)制：很多氨基酰tRNA合成酶有兩個活性位點(diǎn)：

Ж一個負(fù)責(zé)氨基酰tRNA的形成

Ж另一個位點(diǎn)負(fù)責(zé)識別連接在tRNA上的氨基酸是否正確。如果發(fā)現(xiàn)連接在tRNA上的氨基酸不正確，則其通過水解去除錯連的氨基酸，從而防止了氨基酸的錯誤摻入。100動力學(xué)校對機(jī)制：氨基酰tRNA上的反密碼子與mRNA上的密碼子的結(jié)合和肽鏈形成不是同時進(jìn)行，而是有一個時間差。只有那些具有正確反密碼子的tRNA才能同它們在mRNA上相應(yīng)的密碼子之間保持足夠長的時間，使新的肽鏈得以形成。如果進(jìn)入的tRNA不正確，由于上述的時間差，在肽鏈沒有形成之前，錯配的tRNA就從核糖體復(fù)合物上除去，從而減少了不正確氨基酸錯誤摻入到新生肽鏈中去的幾率。1013、蛋白翻譯后的修飾和加工及折疊

N－端的Met和fMet(甲酰甲硫氨酸)的去除去除功能蛋白質(zhì)不再需要的肽段對多肽鏈氨基酸側(cè)鏈的各種修飾：磷酰化、甲基化、羥基化、乙酰化、糖基化等硫－硫鍵的形成分子伴侶102新生蛋白質(zhì)經(jīng)蛋白酶切后變成有功能的成熟蛋白質(zhì)1035、蛋白質(zhì)的剪接

1994年P(guān)erler等人對與蛋白質(zhì)剪接有關(guān)的成分進(jìn)行了規(guī)范化的定義和命名：將按正確閱讀框插入到前體蛋白質(zhì)序列中，并在蛋白剪接或成熟過程中切出的蛋白序列稱為蛋白內(nèi)含子（intein）,而處于intein旁側(cè)，相互首尾相連以形成成熟蛋白產(chǎn)物的蛋白質(zhì)序列，稱為蛋白外顯子（extein）.104蛋白質(zhì)剪接是在前體蛋白水平上，而不是在RNA水平上進(jìn)行。蛋白質(zhì)剪接是從前體蛋白內(nèi)切除inteins,并將exteins以肽鏈相連，產(chǎn)生成熟的蛋白質(zhì)的過程，切除inteins,連接exteins二者缺一不可。蛋白質(zhì)剪接的結(jié)果是由一個單一的前體蛋白產(chǎn)生兩個或多個蛋白質(zhì)。105六、基因的表達(dá)調(diào)控1、原核基因表達(dá)調(diào)控操縱子：乳糖操縱子、色氨酸操縱子2、真核基因的表達(dá)調(diào)控（1）轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控（2）轉(zhuǎn)錄后調(diào)控（3）翻譯水平的調(diào)控（4）無功能DNA與真核基因表達(dá)調(diào)控106一、原核基因的表達(dá)調(diào)控1、乳糖操縱子降解物基因活化蛋白(CAP)→特異的結(jié)合在啟動基因上時，能促進(jìn)RNA聚合酶與啟動基因結(jié)合，并促進(jìn)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；游離CAP不能與啟動基因結(jié)合，必須當(dāng)細(xì)胞內(nèi)有足夠的cAMP時，CAP首先與cAMP形成復(fù)合體，才能與啟動基因結(jié)合，而葡萄糖的降解產(chǎn)物能降低cAMP的含量1072、Trp操縱子的阻遏系統(tǒng)低Trp時：阻遏物不結(jié)合操縱基因高Trp時：阻遏物+Trp結(jié)合操縱基因108衰減子：在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)的衰減作用，用于終止和減弱轉(zhuǎn)錄，這種調(diào)節(jié)的作用部位叫衰減子——是一種位于結(jié)構(gòu)基因上游前導(dǎo)區(qū)的終止子。109UUUU……UUUU……調(diào)節(jié)區(qū)結(jié)構(gòu)基因trpROP前導(dǎo)序列衰減子區(qū)域UUUU……前導(dǎo)mRNA1234衰減子結(jié)構(gòu)

第10、11密碼子為trp密碼子終止密碼子14aa前導(dǎo)肽編碼區(qū):

包含序列1形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)能力強(qiáng)弱：序列1/2>序列2/3>序列3/4

trp密碼子

UUUU……110UUUU……34UUUU3’34核糖體前導(dǎo)肽前導(dǎo)mRNA1.當(dāng)色氨酸濃度高時轉(zhuǎn)錄衰減機(jī)制125’

trp密碼子衰減子結(jié)構(gòu)就是終止子可使轉(zhuǎn)錄前導(dǎo)DNAUUUU3’

RNA聚合酶終止111UUUU……342423UUUU……核糖體前導(dǎo)肽前導(dǎo)mRNA15’

trp密碼子

結(jié)構(gòu)基因前導(dǎo)DNA

RNA聚合酶2.當(dāng)色氨酸濃度低時Trp合成酶系相關(guān)結(jié)構(gòu)基因被轉(zhuǎn)錄序列3、4不能形成衰減子結(jié)構(gòu)112細(xì)菌通過弱化作用彌補(bǔ)阻遏作用的不足，因?yàn)樽瓒糇饔弥荒苁罐D(zhuǎn)錄不起始，對于已經(jīng)起始的轉(zhuǎn)錄，只能通過弱化作用使之中途停下來。阻遏作用的信號是細(xì)胞內(nèi)色氨酸的多少；弱化作用的信號則是細(xì)胞內(nèi)載有色氨酸的tRNA的多少。它通過前導(dǎo)肽的翻譯來控制轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行，在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)這兩種作用相輔相成，體現(xiàn)著生物體內(nèi)周密的調(diào)控作用。113原核生物——操縱子，真核生物——？2、真核生物基因的表達(dá)和調(diào)控真核生物基因表達(dá)與調(diào)控的復(fù)雜性：（1）真核生物具有由核膜包被的細(xì)胞核，其基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生在細(xì)胞核中，而翻譯則發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中（2）真核生物基因數(shù)目比原核生物多，大多數(shù)基因除了有不起表達(dá)作用的內(nèi)含子，另外還有更多調(diào)節(jié)基因表達(dá)的非編碼序列，真核生物所轉(zhuǎn)錄的前體mRNA必須經(jīng)過加工成熟后才進(jìn)入表達(dá)階段。114真核生物基因表達(dá)與調(diào)控的復(fù)雜性：(3)真核生物染色質(zhì)由DNA與5種組蛋白結(jié)合組成，它們折疊和纏繞形成核小體，核小體及染色質(zhì)進(jìn)一步折疊纏繞形成超級結(jié)構(gòu)狀態(tài)的細(xì)胞分裂中期染色體。染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)對基因的表達(dá)起總體控制作用。115（4）化學(xué)信號包括某些激素的誘導(dǎo)控制作用。（5）基因組內(nèi)DNA的化學(xué)修飾（6）發(fā)育過程中高度分化的機(jī)制116（1）轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控調(diào)控區(qū)（順式作用因子）：轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的GC盒（GGGCGGG）、CAAT盒（GGCCAATCT）、octamer(八聚體基序)以及增強(qiáng)子序列。蛋白因子（反式作用因子）：通用（或基礎(chǔ)）轉(zhuǎn)錄因子、啟動子特異轉(zhuǎn)錄激活蛋白、輔助激活蛋白因子。

117（2）轉(zhuǎn)錄后調(diào)控轉(zhuǎn)錄衰減：RNA分子轉(zhuǎn)錄提前終止

RNA的可變剪接：由于存在“內(nèi)含子序列的不確定性或多義性”RNA的編輯：校正基因的移碼突變；可以在mRNA上重新構(gòu)建或去除起始密碼區(qū)，控制蛋白質(zhì)合成；可以在基因原來的起始密碼前構(gòu)建新的AUG起始密碼，擴(kuò)充遺傳信息。118（3）翻譯水平的調(diào)控：i、原核和真核細(xì)胞利用不同的策略去確定在mRNA分子上的翻譯起始位點(diǎn)：原核：SD序列真核：由AUG密碼子同mRNA分子的5’端帽子結(jié)構(gòu)的接近程度而決定的

119ii、5’非翻譯區(qū)二級結(jié)構(gòu)對翻譯起始既可表現(xiàn)出負(fù)控制又可表現(xiàn)出正控制效應(yīng)：當(dāng)5’UTR的序列中存在著堿基配對時，就可形成發(fā)夾式或莖環(huán)二級結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)阻止核糖體小亞基的遷移，對翻譯起始具有順式阻抑作用。作用的強(qiáng)弱取決于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性及其在5’UTR的位置

堿基配對區(qū)越長／或G+C含量愈高，發(fā)夾結(jié)構(gòu)就愈穩(wěn)定；當(dāng)發(fā)夾結(jié)構(gòu)位于AUG下游14個核苷酸距離時，增強(qiáng)了原來的起始效率

120iii、起始密碼子（AUG）先導(dǎo)序列的長度影響翻譯起始效率：先導(dǎo)序列長度：mRNA分子中第一AUG到其帽子間的距離。

長度≤12個核苷酸時，即使AUG置于理想旁側(cè)序列中，仍一半以上的核糖體40S亞基滑過第一個AUG，從其下游的AUG啟始翻譯；長度＝20核苷酸，可以防止滑過現(xiàn)象；長度在17－18個核苷酸之間，其翻譯效率與其長度成正比；加長先導(dǎo)序列的長度還可以減弱AUG5’端的二級結(jié)構(gòu)對翻譯的抑制作用。一般而言，一個適當(dāng)長度、無高級結(jié)構(gòu)和上游AUG密碼的5’非翻譯區(qū)對RNA的有效起始是必需的；相反，一個富含高級結(jié)構(gòu)、G＋C含量高或含多個AUG的5’非翻譯區(qū)可對翻譯起始有阻抑作用。121iv、3’非翻譯區(qū)的結(jié)構(gòu)對翻譯起始的影響：3’非翻譯區(qū)含有UA序列，常有幾個相間分布的UUAUUUAU八核苷酸序列組成，去除這段序列可明顯提高mRNA的穩(wěn)定性，推斷UA序列是對翻譯起阻抑作用的元件；阻抑活性隨其在3’非翻譯區(qū)的拷貝數(shù)增加而提高；可能是通過抑制起始階段即80S核糖體復(fù)合體形成之前的第一過程。122v、poly(A)尾對mRNA穩(wěn)定性及翻譯效率有調(diào)控作用：poly(A)通過其結(jié)合蛋白（PABP）與60S大亞基相互作用而實(shí)現(xiàn)其對翻譯起始的促進(jìn)作用。123vi、mRNA／蛋白質(zhì)相互作用與翻譯水平的調(diào)控：負(fù)翻譯調(diào)控：某些mRNA分子的翻譯能被結(jié)合到mRNA5’端的特定的翻譯阻遏蛋白所阻斷5‘AUGstop3’mRNA

COOHH2NAUGstop5’3‘翻譯阻遏蛋白細(xì)胞內(nèi)貯鐵蛋白ferritin的合成

:ferritinmRNA5’端的先導(dǎo)序列（大約30個核苷酸）作為鐵效應(yīng)元件折疊成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，這個元件是一個翻譯阻遏蛋白－順烏頭酸酶的結(jié)合位點(diǎn)。順烏頭酸又是一個鐵結(jié)合蛋白，當(dāng)細(xì)胞暴露到鐵溶液中引起順烏頭酸酶從ferritin的mRNA上解離，從而使ferritinmRNA翻譯起始，使ferritin的合成增加100倍。124（4）無功能DNA與真核基因表達(dá)調(diào)控“無功能基因”（junkDNA）：指基因組中尚未發(fā)現(xiàn)任何功能的DNA，實(shí)際上這些所謂的junkDNA序列對研究包括癌癥在內(nèi)的人類疾病，正?；蚪M的修復(fù)、調(diào)控乃至多細(xì)胞有機(jī)體的進(jìn)化等都是至關(guān)重要的。i、參與基因表達(dá)調(diào)控序列可能就處于所謂的junkDNA中；ii、真核基因組中含有大量的重復(fù)序列（小衛(wèi)星）參與基因組結(jié)構(gòu)的保持；iii、內(nèi)含子。125作業(yè)

一、名詞解釋半保留復(fù)制、半不連續(xù)復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的剪接二、填空1、真核生物的啟動子包括

、

。2、帽子結(jié)構(gòu)一般為

。3、加尾識別信號為

。三、簡答題1、真核基因結(jié)構(gòu)特征。2、原核生物、真核生物mRNA的特征。3、遺傳密碼的特征。4、乳糖操縱子的雙調(diào)控模式。5、衰減子的弱化機(jī)制。126第三章動物基因工程基礎(chǔ)限制性內(nèi)切酶

克隆載體重組基因的導(dǎo)入和篩選獲得真核生物目的基因的方法127基因工程研究的理論依據(jù)不同基因具有相同的物質(zhì)基礎(chǔ)基因是可以切割的基因是可以轉(zhuǎn)移的多肽與基因之間存在對應(yīng)關(guān)系遺傳密碼是通用的基因可以通過復(fù)制把遺傳信息傳遞給下一代128DNA重組技術(shù)要有四個必要條件：工具酶、基因、載體、受體細(xì)胞129DNA限制性內(nèi)切酶可分為三類：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ

Ⅰ、Ⅲ酶在基因工程中基本不用,why?第一節(jié)限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶是從細(xì)菌中分離提純的核酸內(nèi)切酶，可以識別并切開核酸序列特定位點(diǎn)——分子手術(shù)刀Arber、Smith和Nathans因?yàn)樵诎l(fā)現(xiàn)限制性內(nèi)切酶方面開創(chuàng)性工作而共同獲得了1978年的諾貝爾獎。130Ⅰ、Ⅲ限制性內(nèi)切酶在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依賴于ATP的限制性內(nèi)切酶活性。Ⅰ類酶結(jié)合于特定的識別位點(diǎn)，但卻沒有特定的切割位點(diǎn)，酶對其識別位點(diǎn)進(jìn)行隨機(jī)切割，很難形成穩(wěn)定的、特異性切割末端。Ⅲ類酶在識別位點(diǎn)上切割DNA，然后從底物上解離下來。131核酸內(nèi)切限制酶的類型及其主要特性特性I型II型III型限制和修飾活性單一多功能的酶分開的核酸內(nèi)切酶和甲基化酶

具有一種共同亞基的雙功能的酶核酸內(nèi)切限制酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)3種不同的亞基單一的成份

2種不同的亞基

切割位點(diǎn)在距寄主特異性位點(diǎn)至少1000bp的地方可能隨機(jī)地切割位于寄主特異性位點(diǎn)或其附近

距寄主特異性位點(diǎn)3，端24~26bp處甲基化作用的位點(diǎn)寄主特異性的位點(diǎn)寄主特異性的位點(diǎn)寄主特異性的位點(diǎn)識別未甲基化的序列進(jìn)行核酸內(nèi)切酶切割

能

能能序列特異的切割不是是是DNA克隆中的用處無用十分有用用處不大132一、II類限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn)識別特定的核苷酸序列，其長度一般為4、5或6個核苷酸且呈二重對稱，但有少數(shù)酶識別更長的序列或兼并序列；具有特定的酶切位點(diǎn)，產(chǎn)生出特定的酶切末端→5’突出粘末端、3’突出粘末端、平末端；Ⅱ類限制－修飾系統(tǒng)是由兩種酶分子組成的二元系統(tǒng)；限制性內(nèi)切酶、獨(dú)立的甲基化酶。

被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個伸出的核苷酸，它們之間正好互補(bǔ)配對，這樣的切口叫做粘性末端。133二、使用限制性內(nèi)切酶時應(yīng)注意的問題1、仔細(xì)查閱酶的識別序列和切割位點(diǎn)。同裂酶：不同來源但是識別同樣順序和相同切割位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶。同尾酶：有時有兩種限制性內(nèi)切酶識別不同的核苷酸序列，但切割后DNA分子所產(chǎn)生的粘性末端卻相同，這類酶為具不同酶切位點(diǎn)的DNA片段重組提供了方便，但要注意，往往相容的粘性末端再用DNA連接酶連接后，都不能再被其切割了。1342、注意酶反應(yīng)條件，相同反應(yīng)條件的酶可以同時酶解DNA樣品。3、注意說明書中所列出的comments的內(nèi)容，會提供有關(guān)限制性內(nèi)切酶識別序列中位點(diǎn)特異性甲基化的信息以及引起酶產(chǎn)生staractivity的原因。staractivity：指當(dāng)酶的反應(yīng)條件改變時，其在識別序列中的酶切位點(diǎn)發(fā)生改變。產(chǎn)生的原因：反應(yīng)體系中甘油的濃度>12％；酶：DNA比率>25u/μg

；缺少Nacl和存在Mn2＋。1354、注意酶的濃度，酶切時不是酶加得越多越好。一般以在20μl反應(yīng)體積中，37℃，每小時水解1微克DNA的酶量定為一個酶單位。5、注意酶在保溫過程中的活性變化。ACCⅠ在5小時內(nèi)具有全部活力BamHⅠ在第一個小時內(nèi)具有全部活力，在第二小時具有部分活力，而在2小時以后就無活力了。CfoⅠ僅在第一個小時內(nèi)具有全部活力，一個小時以后就沒有活力了。136三、連接酶定義：用于將兩端乃至數(shù)段DNA片段拼接起來的酶。用途：（1）連接帶匹配粘末端的DNA分子；（2）使平末端的雙鏈DNA分子相互連接或與合成的寡核苷酸接頭相連接?！@類反應(yīng)要比粘末端之間連接慢得多，但單價陽離子（150-200mmol/LNacl）或低濃度的聚乙二醇（PEG）可提高連接效率。137DNA連接酶連接的部位：磷酸二酯鍵（梯子的扶手），不是氫鍵（梯子的踏板）138四、修飾酶1、DNA聚合酶：大腸桿菌DNA聚合酶I：3種催化活性klenow大片段酶：2種催化活性T4噬菌體DNA聚合酶：2種催化活性T7噬菌體DNA聚合酶：2種催化活性耐高溫DNA聚合酶（如TaqDNA聚合酶）反轉(zhuǎn)錄酶：3種催化活性末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶等1392、依賴于DNA的RNA聚合酶：SP6噬菌體及T7和T3噬菌體RNA聚合酶用途

:在invitro條件，合成單鏈RNA作為雜交探針1403、T4噬菌體多核苷酸激酶：催化ATP的γ－磷酸基轉(zhuǎn)移至DNA或RNA片段的5’末端。用途：標(biāo)記DNA片段的5’端

，制備雜交探針；基因化學(xué)合成中，寡核苷酸片段5’－磷酸化；用于測序引物的5’標(biāo)記。5’HOOH3’HOOH3’5’5’突出末端5’隱蔽末端5’32POH3’HO32P3’5’γ32PATP1414、堿性磷酸酶：用途：去除DNA片段5’末端的磷酸，以防止在重組中自身環(huán)化，從而提高重組效率；在用［γ－32p］ATP標(biāo)記DNA或RNA的5’末端前，去除DNA或RNA片段的非標(biāo)記的5’磷酸。5’POH3’HOP3’5’5’突出末端5’隱蔽末端OHHO5’HOOH3’3’5’142第二節(jié)克隆載體基因工程載體應(yīng)具備的條件：能自我復(fù)制并能帶動插入的外源基因一起復(fù)制；具有合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)：

在載體上單一的限制性酶切位點(diǎn)越多越好，這樣可以將不同限制性內(nèi)切酶切割后的外源DNA片段方便的插入載體；在細(xì)胞內(nèi)拷貝數(shù)要多，這樣才能使外源基因得以擴(kuò)增；載體的分子量要小，這樣可以容納較大的外源DNA插入片段：在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定性高，這樣可以保證重組體穩(wěn)定傳代而不易丟失；應(yīng)該有一個或多個選擇標(biāo)記。143大腸桿菌表達(dá)載體應(yīng)具備：強(qiáng)的啟動子，一個強(qiáng)的可誘導(dǎo)的啟動子可使外源基因有效的轉(zhuǎn)錄；在啟動子下游區(qū)和ATG（起始密碼子）上游區(qū)有一個好的核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列（SD）；在外源基因插入序列的下游區(qū)要有一個強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄終止序列，保證外源基因的有效轉(zhuǎn)錄和質(zhì)粒的穩(wěn)定性。144一、質(zhì)粒(plasmid)定義：質(zhì)粒是能自主復(fù)制的雙鏈環(huán)狀DNA分子，它們在細(xì)菌中以獨(dú)立于染色體之外的方式存在。AOCSCL145質(zhì)粒載體的基本要求具有復(fù)制起點(diǎn)應(yīng)包含一個可供選擇的標(biāo)記基因具有多克隆位點(diǎn)具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)146F質(zhì)粒：有些攜帶有幫助其自身從一個細(xì)胞轉(zhuǎn)入另一個細(xì)胞的信息的質(zhì)粒。R質(zhì)粒：表達(dá)對一種抗生素的抗性的質(zhì)粒。降解質(zhì)粒：攜帶參與或控制一些不同尋常的代謝途徑的基因的質(zhì)粒。穿梭載體：在大腸桿菌的載體上放上第二個復(fù)制起始位點(diǎn)，使它在另一個宿主細(xì)胞中也能進(jìn)行復(fù)制。1471、質(zhì)粒載體pBR322特點(diǎn)1）大小為4363bp2）含有兩個抗生素基因（抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素）3）有單一的BamHⅠ、HindⅢ和SalⅠ的識別位點(diǎn)（在四環(huán)素抗性基因內(nèi)）、PstⅠ識別位點(diǎn)（在氨芐青霉素抗性基因內(nèi)）

外源片段在BamHⅠ、HindⅢ、PstⅠ位點(diǎn)插入時，可引起抗生素失活來篩選重組體4）帶有一個復(fù)制起始點(diǎn)，可以保證這個質(zhì)粒只在大腸桿菌里行使復(fù)制功能，在大腸桿菌里pBR322以高拷貝數(shù)存在1482、質(zhì)粒載體pUC191）特征大小為2686bp；乳糖操縱子β－半乳糖苷酶帶有pBR322的復(fù)制起始位點(diǎn)，一個氨芐青霉素抗性基因；一個大腸桿菌乳糖操縱子β－半乳糖苷酶基因的調(diào)節(jié)片段（lacZ’）,一個調(diào)節(jié)lacZ’基因表達(dá)的阻遏蛋白的基因lacI；含有多個單克隆位點(diǎn)。1492）pUC19的篩選：培養(yǎng)基中含有異丙基硫代半乳糖苷（IPTG，lac操縱子的一個誘導(dǎo)物）時，lacI的產(chǎn)物就不能與lacZ’的啟動子區(qū)域結(jié)合，質(zhì)粒pUC19的lacZ’就可以轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而翻譯，lacZ蛋白會與染色體DNA編碼的一個蛋白形成具有活性的雜合β－半乳糖苷酶；在底物5－溴－4氯－3吲哚－β－半乳糖苷酶（X-gal）存在下，X-gal會被雜合β－半乳糖苷酶水解成藍(lán)色的產(chǎn)物，沒有插入外源DNA序列的pUC19質(zhì)?？寺【统仕{(lán)色；由于pUC19的單克隆位點(diǎn)的序列是整合在lacZ’之中的，若pUC19質(zhì)粒中插入有目的DNA片段，就會破環(huán)lacZ’的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞無法產(chǎn)生功能性的lacZ蛋白，也就無法形成雜合的β－半乳糖苷酶，因而菌落是白色的。150α－互補(bǔ)原理載體：含有β－半乳糖苷酶基因（LacZ）的調(diào)控序列和N－端146個氨基酸的編碼序列，并在編碼序列中插入了一個MCS受體菌：為β－半乳糖苷酶C端序列編碼互補(bǔ)：宿主和質(zhì)粒編碼的片段雖都沒有酶活性，但它們同時存在時，可形成具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)151穿梭質(zhì)粒:人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇記號，可在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。152二、λ噬菌體①λ噬菌體可以進(jìn)入裂解循環(huán)，20分鐘后就可使宿主細(xì)胞發(fā)生裂解，同時釋放出大約100個噬菌體顆粒。②λ噬菌體也可以進(jìn)入溶源循環(huán)，即注入的DNA整合到大腸桿菌的染色體中，以前噬菌體的形式潛伏起來，永久保留。153③λ噬菌體DNA大約長50kb，其中大約20kb對于整合／切割過程極為關(guān)鍵，稱為整合／切割（I/E）區(qū)域。對于構(gòu)建文庫，可將這20kbDNA片段去掉，強(qiáng)迫重組的λ噬菌體進(jìn)入裂解循環(huán)。整合／切割區(qū)域尾部基因頭部基因粘性末端粘性末端負(fù)責(zé)DNA復(fù)制的基因細(xì)胞裂解基因λ噬菌體的DNA示意圖左臂右臂154④λ噬菌體頭的大小足以裝下50kb單元的線性DNA，DNA<38kb，噬菌體沒有侵染性DNA>52kb,則無法包裝進(jìn)頭部⑤cos位點(diǎn)（cossite）就是保證在超長線性DNA分子上每兩個cos位點(diǎn)之間為50kb,使DNA分子能正確的裝配進(jìn)噬菌體在頭的入口處有一種酶，它能識別雙鏈線性DNA分子上的cos序列，并在cos序列處切斷DNA分子，使適當(dāng)大小的DNA進(jìn)入噬菌體的頭部155三、柯斯質(zhì)粒（cosmid）可攜帶40kb大小的DNA片段，并在大腸桿菌中復(fù)制保存，→綜合了質(zhì)粒載體和噬菌體載體二者的優(yōu)勢?？滤官|(zhì)粒上帶有多個單克隆位點(diǎn)、兩個cos位點(diǎn)、DNA復(fù)制起始位點(diǎn)和抗生素抗性基因，在兩個cos位點(diǎn)之間含有一個限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)（RE）。156四、YAC載體1、目前能容納最大外源DNA片段的載體是YAC（酵母人工染色體，yeastartificialchromosome）。2、真核生物染色體三個關(guān)鍵部分：著絲粒（centromere,CEN）,它主管染色體在細(xì)胞分裂過程中正確的分配到各子細(xì)胞中；端粒（telomere,TEL）,位于染色體的末端，對染色體末端的復(fù)制以及防止染色體被核酸外切酶切斷具有重要的意義；自主復(fù)制序列（autonomouslyreplicatingsequence,ARS）,即在染色體上的多處DNA復(fù)制起始位點(diǎn)。1573、作為真核基因表達(dá)載體應(yīng)具備如下條件：①含有原核基因的復(fù)制起始序列（如ColE1起始序列ori）篩選標(biāo)記；②含有真核基因的復(fù)制起始序列（如SV40病毒的復(fù)制序列、酵母的2μ質(zhì)粒的復(fù)制起始序列ARS、以及真核細(xì)胞篩選標(biāo)記（如氨基糖苷G148抗性基因、在酵母細(xì)胞中與自養(yǎng)有關(guān)的基因））；③含有有效的啟動子序列（可包含增強(qiáng)子序列等各種順式作用元件）；④RNA聚合酶所需的轉(zhuǎn)錄終止和poly(A)加入的信號序列；⑤合適的供外源基因插入的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。1584、YAC的主要功能成份有三：

1）著絲粒：mitosis姊妹染色單體和減數(shù)分裂同源染色體分離之必需2）端粒3）自主復(fù)制序列（ARS）元件4）構(gòu)建YAC需要4個短序列：2個端粒，著絲粒，ARS元件，選擇標(biāo)記，與外源DNA連接成線性DNA分子，導(dǎo)入酵母細(xì)胞克隆159第三節(jié)受體細(xì)胞接受遺傳物質(zhì)的細(xì)胞能攝取外源DNA并使其穩(wěn)定存在，具有重要的應(yīng)用價值和理論價值160一、原核生物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)大部分原核生物細(xì)胞沒有纖維素組成的堅(jiān)硬細(xì)胞壁，便于外源DNA導(dǎo)入沒有核膜，染色體DNA沒有固定結(jié)合的蛋白質(zhì)基因組小，遺傳背景簡單繁殖迅速，實(shí)驗(yàn)周期短，重復(fù)實(shí)驗(yàn)快161一、原核生物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)問題真核基因修飾DNA與細(xì)胞分裂的關(guān)系細(xì)胞的特異性分化熱源、內(nèi)毒素不易除去、產(chǎn)品難純化包涵體提純繁瑣蛋白質(zhì)復(fù)性困難，易出現(xiàn)肽鏈的不正確折疊162二、真核生物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)真核生物由多細(xì)胞組成，有明顯的細(xì)胞分化和細(xì)胞核真核細(xì)胞的一條成熟的mRNA只能翻譯出一條多肽存在大量的重復(fù)序列和內(nèi)含子1631、真菌細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)基因結(jié)構(gòu)相對簡單培養(yǎng)簡單，適于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)表達(dá)產(chǎn)物能分泌到培養(yǎng)基中，便于產(chǎn)物的提取和加工不產(chǎn)生毒素酵母菌1642、哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)水平僅為細(xì)菌表達(dá)量的5%能夠指導(dǎo)蛋白質(zhì)的正確折疊，提供復(fù)雜的N端糖基化和準(zhǔn)確的O型糖基化等多種翻譯后加工功能1653、昆蟲細(xì)胞及其幼體表達(dá)系統(tǒng)良好的翻譯后修飾功能表達(dá)產(chǎn)物接近天然的蛋白質(zhì)構(gòu)型166三、受體細(xì)胞的選擇避免外源DNA被修飾和降解無重組能力，重組DNA分子能穩(wěn)定維持和表達(dá)具有較高的可轉(zhuǎn)化性含有與載體的選擇性標(biāo)記相匹配的基因型，便于重組子的篩選感染寄生缺陷型，無致病性，不會對外界環(huán)境造成生物污染167第四節(jié)重組基因的導(dǎo)入和篩選168DNA克隆的基本過程分：分離目的基因切：對目的基因和載體適當(dāng)切割接：目的基因與載體連接轉(zhuǎn)：重組DNA轉(zhuǎn)入受體菌篩：篩選出含有重組體的受菌體169基因工程技術(shù)策略分：

基因載體

目的基因

質(zhì)粒噬菌體病毒直接分離cDNA人工合成基因文庫切：

限制性內(nèi)切酶有缺口的載體目的基因接：

連接酶粘端連接平端連接尾接法重組體轉(zhuǎn)：轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染體外包裝帶重組體的宿主篩：表型篩選電泳法核酸雜交1701、細(xì)胞內(nèi)總DNA的提取分離細(xì)胞內(nèi)總DNA的提取分離程序紫外分光光度計(jì)測定DNA溶液的純度和濃度1712、基因重組的方法：1）根據(jù)外源DNA片段末端的性質(zhì)同載體上適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)相連實(shí)現(xiàn)基因的體外重組。172外源DNA片段所具末端克隆所需條件注明平端需高濃度的DNA和連接酶1)非重組體克隆的背景可能較高2)外源DNA與載體DNA結(jié)合處的酶切位點(diǎn)可能消失3)重組質(zhì)粒會帶有外源DNA的串聯(lián)拷貝不同的突出端用限制性酶酶解后，需純化載體去除小片段，以提高有效連接效率1)載體與外源DNA結(jié)合處的酶切位點(diǎn)?？杀Ａ?)非重組克隆的背景較低3)外源DNA只以一個方向插入到重組質(zhì)粒中相同的突出端酶切后的線狀載體DNA常用磷酸酶處理去磷酸化1)載體與外源DNA結(jié)合處的酶切位點(diǎn)?？杀Ａ?)外源DNA會以兩個方向插入3)重組質(zhì)粒會帶有外源DNA的串聯(lián)拷貝外源DNA片段與載體的連接1732）當(dāng)在載體的以及外源DNA片段兩端的限制酶切位點(diǎn)之間，不可能找到恰當(dāng)?shù)钠ヅ鋾r，可采用下述方法解決：

①在線狀質(zhì)粒的末端／或外源DNA片段的末端用DNA連接酶接上接頭或銜接頭，這種接頭可以是含單一的或多個限制性酶切位點(diǎn)，然后通過適當(dāng)?shù)南拗泼附夂筮M(jìn)行重組。174②使用大腸桿菌DNA聚合酶IKlenow片段部分補(bǔ)平3’凹端?！?’凹端轉(zhuǎn)變成粘端。5’TCGAAGCT5’xhoI5’GATCCTAG5’Sau3AI5’TCGAAGCT5’CTTC5’GATCCTAG5’AGGCdCTP、dTTP、dATP、dGTPKlenow酶175③使用Klenow酶在4種dNTP存在下，將3’凹端完全補(bǔ)平或用S1核酸酶、綠豆核酸酶、Klenow酶、T4DNA聚合酶去除3’－突出端產(chǎn)生平端DNA分子，可與任何其他平端DNA分子相連。3）可以利用末端轉(zhuǎn)移酶分別在載體酶切位點(diǎn)處和外源DNA片段的3’端加上相互補(bǔ)的同聚尾→同聚物加尾法，常用于雙鏈cDNA的分子克隆。1764）多聚酶鏈反應(yīng)（PCR）為基因定向重組和構(gòu)建外源基因高效表達(dá)治理提供了一個通用方法。

根據(jù)載體上的克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)PCR引物，使引物上帶有與載體克隆位點(diǎn)相匹配的限制性內(nèi)切酶識別序列。1773、重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞1)轉(zhuǎn)化：由于外源DNA的進(jìn)入而使細(xì)胞遺傳性改變稱為轉(zhuǎn)化采取一些方法處理細(xì)胞，經(jīng)處理后的細(xì)胞就容易接受外界DNA，稱為感受態(tài)細(xì)胞，再與外源DNA接觸，就能提高轉(zhuǎn)化效率1782)轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過噬菌體或病毒的感染作用將一個細(xì)胞的遺傳信息傳遞到另一個細(xì)胞的過程用噬菌體活病毒作載體，以其DNA與目的序列重組后，在體外用噬菌體或病毒的外殼蛋白將重組DNA包裝成有活力的噬菌體或病毒，就能以感染的方式進(jìn)入宿主細(xì)菌或細(xì)胞，使目的序列得以復(fù)制繁殖1793)轉(zhuǎn)染：重組的噬菌體DNA也可像質(zhì)粒DNA的方式進(jìn)入宿主菌，即宿主菌先經(jīng)過CaCl2等處理成感受態(tài)細(xì)菌再接受DNA，進(jìn)入感受態(tài)細(xì)菌的噬菌體DNA可以同樣復(fù)制和繁殖也可用人工脂質(zhì)膜包裹DNA，形成的脂質(zhì)體可以通過與細(xì)胞膜融合而將DNA導(dǎo)入細(xì)胞180具體方法：①氯化鈣法②電穿孔：將宿主細(xì)胞置于一個高強(qiáng)電場中，通過電場脈沖在細(xì)胞壁上打孔，DNA分子隨即進(jìn)入細(xì)胞③聚乙二醇介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法：常用于轉(zhuǎn)化酵母以及其他真菌細(xì)胞→活躍生長的細(xì)胞或菌絲體用消化細(xì)胞壁的酶處理變成球形后，在適當(dāng)濃度的聚乙二醇6000（PEG-6000）的介導(dǎo)下將外源DNA轉(zhuǎn)化入受體細(xì)胞中181④磷酸鈣或DEAE－葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染：

¤將外源基因?qū)氩溉轭惣?xì)胞中瞬時表達(dá)的常規(guī)方法

¤磷酸鈣和DNA共沉淀：將被轉(zhuǎn)染的DNA同正在溶液中形成的磷酸鈣微粒共沉淀后可能通過內(nèi)吞作用進(jìn)入受體細(xì)胞

¤DEAE－葡聚糖作用：可能是其與DNA結(jié)合從而抑制核酸酶的作用或與細(xì)胞結(jié)合從而促進(jìn)DNA的內(nèi)吞作用182⑤原生質(zhì)體融合：通過帶有多拷貝重組質(zhì)粒的細(xì)菌原生質(zhì)體同培養(yǎng)的哺乳細(xì)胞直接融合⑥脂質(zhì)體法：將DNA或RNA包裹于脂質(zhì)體內(nèi)，然后進(jìn)行脂質(zhì)體與細(xì)胞膜融合將基因?qū)擘嗉?xì)胞核的顯微注射法：即將目的基因重組體通過顯微注射裝置直接注入細(xì)胞核中1834、一般克隆基因的檢查和鑒定方法瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定大小不等的酶解片段：磷酸基團(tuán)帶負(fù)電荷酶解片段向陽極移動電場驅(qū)動力和凝膠阻力

——不同遷移率分子量標(biāo)準(zhǔn)參照物酶切和電泳方法1841）重組質(zhì)粒的快速鑒定：根據(jù)有外源基因插入的重組質(zhì)粒同載體DNA之間大小的差異區(qū)分。2）重組質(zhì)粒的限制酶解分析。3）通過α互補(bǔ)使菌落產(chǎn)生的顏色反應(yīng)來篩選重組體。185

標(biāo)志補(bǔ)救（markerrescue）

若目的基因能夠在宿主菌表達(dá)，且表達(dá)產(chǎn)物與宿主菌的營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)，就可利用對營養(yǎng)素的依賴表型來篩選。

宿主生長——依賴Leu重組體+目的基因

———→能夠合成Leu在沒有Leu存在時——→能生長（已轉(zhuǎn)化）

重組體轉(zhuǎn)化的細(xì)菌中

在沒有Leu存在時——→不生長（沒有轉(zhuǎn)化）1864)外源DNA片段插入失活如果載體帶有兩個或多個抗生素抗性基因并在其上分布適宜的可供外源DNA插入的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)時，當(dāng)外源DNA片段插入到一個抗性基因中去時可導(dǎo)致此抗性基因失活。5)分子雜交篩選法：①原位雜交②點(diǎn)雜交和southern雜交187A.核酸的分子雜交技術(shù)

在大多數(shù)核酸雜交反應(yīng)中，經(jīng)過凝膠電泳分離的DNA或RNA分子，都是在雜交之前，通過毛細(xì)管作用或電導(dǎo)作用按其在凝膠中的位置原封不動地“吸印”轉(zhuǎn)移到濾膜上的常用的濾膜有尼龍濾膜、硝酸纖維素濾膜，疊氮苯氧甲基纖維素濾紙（DBM）和二乙氨基乙基纖維素濾膜（DEAE）188（1）提取總DNA（2）酶解（3）電泳（4）轉(zhuǎn)移到濾膜（5）變性解鏈（6）DNA探針及雜交（7）洗脫（8）放射自顯影（9）比較分析Southern雜交

A.DNA體外重組實(shí)驗(yàn)

B.抗生素篩選轉(zhuǎn)化子細(xì)胞

C.培養(yǎng)突變株細(xì)胞

D.Southern雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，外源目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入突變株細(xì)胞中Southern雜交分析示例1896)表達(dá)文庫的免疫學(xué)篩選：絕大多數(shù)構(gòu)建λ噬菌體的cDNA文庫選用λgt11、λZAP或λORF8作為表達(dá)載體這些噬菌體帶有一拷貝的大腸桿菌LacZ基因，克隆位點(diǎn)位于翻譯終止密碼子上游53bp處cDNA插入方向和閱讀框正確時，可以表達(dá)氨基端為β－半乳糖苷酶序列、羧基端是外源序列的融合蛋白，其中一些外源序列將暴露出可用特異抗體檢測的抗原表位1907)利用PCR方法來確定基因的重組體克隆PCR產(chǎn)物；通用引物：pUC/M13