偽狂犬病毒PCR診斷

偽狂犬病毒PCR診斷現(xiàn)在是1頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三什么是PCR？

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，簡(jiǎn)稱PCR）又稱無細(xì)胞分子克隆或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增技術(shù)。一、PCR反應(yīng)的原理、方法及操作步驟現(xiàn)在是2頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（1）1983Cetus公司的K.Mullis在這年底（12月16日第一次成功實(shí)驗(yàn)）發(fā)明了PCR。1985關(guān)于PCR的文章首次由Cetus公司Saiki等人在Science上發(fā)表(R.Saiki,S.Scharf,F.Faloona,K.Mullis,G.Horn,H.ErlichandN.Arnheim)現(xiàn)在是3頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（2）1987當(dāng)年7月Cetus公司在美國(guó)獲得PCR基本技術(shù)專利批準(zhǔn)。成立于1985年底的Perkin-ElmerCetus儀器公司（PECI）于這一年的11月推出了第一個(gè)PCR試劑產(chǎn)品及第一臺(tái)熱循環(huán)儀。1989Science報(bào)道了耐熱性DNA多聚酶Taq酶的發(fā)現(xiàn),預(yù)示著分子時(shí)代的到來。12月《Science》雜志將PCR和它所使用的聚合酶命名為第一個(gè)“年度分子”?，F(xiàn)在是4頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（3）1992年3月Cetus公司獲得Taq酶、熱循環(huán)擴(kuò)增儀等專利；

KaryMullis因PCR的發(fā)明獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。現(xiàn)在是5頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三PCR及有關(guān)技術(shù)的發(fā)展歷史（4）九十年代中期PCR臨床應(yīng)用在國(guó)內(nèi)全面展開1998年實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)開始在中國(guó)較廣泛的應(yīng)用于臨床檢測(cè)1999年西方發(fā)達(dá)國(guó)家嘗試將PCR應(yīng)用于血液篩查現(xiàn)在是6頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三PCR原理PCR是一種選擇性擴(kuò)增DNA或RNA的方法，其基本原理是依據(jù)體內(nèi)細(xì)胞分裂中的DNA半保留復(fù)制機(jī)理，以及在體外DNA分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì)，人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度，以促使雙鏈DNA變成單鏈；單鏈DNA與人工合成的引物退火，以及在dNTP存在下，耐高溫的DNA聚合酶使引物沿單鏈模板延伸成為雙鏈DNA。高溫變性，低溫退火，適溫延伸等３步反應(yīng)循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增?，F(xiàn)在是7頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三PCR原理PCR技術(shù)在模板DNA、dNTP、Mg2+、合適Buffer等條件下，用耐熱的Taq聚合酶代替DNA聚合酶，用合成的DNA引物代替RNA引物，經(jīng)過DNA變性、引物與模板結(jié)合（復(fù)性）和延伸3個(gè)步驟的反復(fù)循環(huán)（2530次）過程，使目的DNA呈指數(shù)擴(kuò)增?，F(xiàn)在是8頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三（1）DNA模板的熱變性

將待擴(kuò)增DNA加熱到940C左右，使雙鏈DNA解開成為單鏈，并游離于反應(yīng)體系中作為模板。（2）模板與引物的結(jié)合（退火或復(fù)性）

將體系溫度降至合適溫度（520C左右），使加入的引物與模板DNA兩端（3ˊ端）堿基序列互補(bǔ)結(jié)合。現(xiàn)在是9頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三（3）引物延伸

將體系溫度升到720C左右，Taq聚合酶催化dNTP

按堿基互補(bǔ)原則連接在DNA引物3ˊ端，使鏈延伸，形成兩條與模板互補(bǔ)的新鏈。

以上為1次PCR循環(huán)（變性、復(fù)性和延伸）

（新合成的鏈可作為下一輪循環(huán)的模板）

按照上述（變性、復(fù)性和延伸）3個(gè)步驟反復(fù)循環(huán)，PCR產(chǎn)物呈指數(shù)擴(kuò)增。

模板DNA擴(kuò)增倍數(shù)T=2n(n:循環(huán)次數(shù))。現(xiàn)在是10頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三PCR原理SampledenaturatationPrimerannealingPrimerextension現(xiàn)在是11頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三PCRproduct現(xiàn)在是12頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系10×擴(kuò)增緩沖液10ul

4種dNTP混合物各200umol/L

引物10～100pmol

模板DNA0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100ul現(xiàn)在是13頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是14頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是15頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三2.PCR各要素及其作用（1）模板

PCR模板可以是DNA或RNA。以線性DNA模板為佳，量適中，一般為102105個(gè)拷貝；

RNA作為模板時(shí)，需要：

RNAcDNAPCR,稱此為RT-PCR.

（2）耐熱DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)

是從耐熱細(xì)菌體內(nèi)提取的一種DNA聚合酶，可在95℃穩(wěn)定30分鐘。從而保證PCR在[94℃變性→52℃退火→72℃延伸]循環(huán)30次過程中不變性失活。

逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)在是16頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三酶及其濃度目前有兩種TaqDNA聚合酶供應(yīng)天然酶：從棲熱水生桿菌中提純基因工程酶：大腸菌合成一個(gè)典型的PCR反應(yīng)約需酶量2.5U（指總反應(yīng)體積為100ul時(shí)）濃度過高可引起非特異性擴(kuò)增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少現(xiàn)在是17頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三引物引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增現(xiàn)在是18頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三引物設(shè)計(jì)的原則（一）①引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為20bp左右引物的有效長(zhǎng)度不能大于38bpmer，否則最適延伸溫度會(huì)超過TaqDNA聚合酶的最適溫度（72℃），不能保證PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性②引物擴(kuò)增跨度：以500bp為宜特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列現(xiàn)在是19頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三引物設(shè)計(jì)的原則（二）④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3’端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異性的擴(kuò)增條帶⑤引物3’端的堿基要求嚴(yán)格配對(duì)特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失?、抟镏杏谢蚰芗由虾线m的酶切位點(diǎn)被擴(kuò)增的靶序列最好有適宜的酶切位點(diǎn)，這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處現(xiàn)在是20頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三引物設(shè)計(jì)的原則（三）⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無明顯同源性⑧引物量：每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好.引物濃度偏高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì).現(xiàn)在是21頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三引物在線設(shè)計(jì)網(wǎng)址：primer/primer3_cgi現(xiàn)在是22頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是23頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三現(xiàn)在是24頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三dNTP的質(zhì)量與濃度dNTP的質(zhì)量與濃度和PCR擴(kuò)增效率有密切關(guān)系dNTP呈顆粒狀，保存不當(dāng)易變性失活dNTP溶液呈酸性，使用時(shí)應(yīng)配成高濃度后，以1MNaOH或1MTris-HCl的緩沖液將其pH調(diào)節(jié)到7.0～7.5，小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會(huì)使dNTP降解在PCR反應(yīng)中，dNTP應(yīng)為50～200umol/L，尤其是注意4種dNTP的濃度要相等（等摩爾配制），如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(shí)（偏高或偏低），就會(huì)引起錯(cuò)配。濃度過低又會(huì)降低PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量dNTP能與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度降低現(xiàn)在是25頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三Mg2+濃度Mg2+對(duì)PCR擴(kuò)增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響在一般的PCR反應(yīng)中，各種NTP濃度為200umol/L時(shí)，Mg2+濃度為1.5～2.0mmol/L為宜Mg2+濃度過高，反應(yīng)特異性降低，出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，濃度過低會(huì)降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應(yīng)產(chǎn)物減少現(xiàn)在是26頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三PCR反應(yīng)條件的選擇PCR反應(yīng)條件:溫度時(shí)間循環(huán)次數(shù)現(xiàn)在是27頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三溫度與時(shí)間的設(shè)置：設(shè)置變性-退火-延伸三個(gè)溫度點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸對(duì)于較短靶基因（長(zhǎng)度為100～300bp時(shí)）可采用二溫度點(diǎn)法，將退火與延伸溫度合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸現(xiàn)在是28頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三①變性溫度與時(shí)間：變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性若低于93℃則需延長(zhǎng)時(shí)間但溫度不能過高，因?yàn)楦邷丨h(huán)境對(duì)酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會(huì)導(dǎo)致PCR失敗現(xiàn)在是29頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三

②退火(復(fù)性)溫度與時(shí)間：退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞退火溫度與時(shí)間，取決于引物的長(zhǎng)度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長(zhǎng)度對(duì)于20個(gè)核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點(diǎn)較為理想現(xiàn)在是30頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三引物的復(fù)性溫度

通過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm值（解鏈溫度）=4（G+C）＋2（A+T）復(fù)性溫度=Tm值-（5～10℃）在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性。復(fù)性時(shí)間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合?，F(xiàn)在是31頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三③延伸溫度與時(shí)間：延伸溫度：一般選擇在70～75℃之間常用溫度為72℃過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。延伸反應(yīng)時(shí)間：根據(jù)待擴(kuò)增片段長(zhǎng)度而定1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時(shí)間1min（足夠）3～4kb的靶序列需3～4min擴(kuò)增10Kb需延伸至15min延伸進(jìn)間過長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增對(duì)低濃度模板的擴(kuò)增，延伸時(shí)間要稍長(zhǎng)些現(xiàn)在是32頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù)決定PCR擴(kuò)增程度循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度循環(huán)次數(shù)：選在30～40次之間循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多現(xiàn)在是33頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三（6）參數(shù)

變性溫度與時(shí)間

一般選擇：940C，30秒退火溫度與時(shí)間

取決于引物長(zhǎng)度、濃度和G+C含量，一般選擇：Tm-5℃

延伸溫度與時(shí)間

一般選擇：70℃75℃循環(huán)次數(shù)

取決于模板濃度，一般循環(huán)：30次現(xiàn)在是34頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三PCR反應(yīng)特點(diǎn)特異性強(qiáng)靈敏度高簡(jiǎn)便、快速對(duì)標(biāo)本的純度要求低現(xiàn)在是35頁(yè)\一共有40頁(yè)\編輯于星期三PCR產(chǎn)物分析凝膠電