育種出發(fā)菌的分離篩選課件

第五章育種出發(fā)菌的分離篩選向菌種保藏機(jī)構(gòu)索取有關(guān)的菌株。菌種來(lái)源的途徑國(guó)內(nèi)外著名的菌種保藏機(jī)構(gòu)有：CCCCM(中國(guó)微生物保藏管理委員會(huì)）

ATCC(美國(guó)典型菌種保藏中心）NCTC(英國(guó)國(guó)家典型菌種保藏所)IFO(大阪發(fā)酵研究所)2.

從一些發(fā)酵制品中分離目的菌株。容易篩選到較理想的菌株。

3.

由自然界采集樣品中獲得。如土壤、水、動(dòng)植物體等，從中進(jìn)行分離篩選。容易發(fā)現(xiàn)新的菌株資源。2023/3/312菌株分離與篩選菌株分離(separation)：是將樣品中混雜生長(zhǎng)的各種微生物通過(guò)分離技術(shù)區(qū)分開，獲得所需微生物的過(guò)程。菌株篩選(screening)：在目的菌株分離的基礎(chǔ)上，結(jié)合常規(guī)生產(chǎn)性能測(cè)定，選擇目的產(chǎn)物合成能力相對(duì)高的菌株的過(guò)程。2023/3/313第一節(jié)含微生物樣品的采集第二節(jié)含微生物樣品的富集培養(yǎng)第三節(jié)微生物的分離第四節(jié)野生菌株篩選和目的產(chǎn)物鑒定主要內(nèi)容2023/3/315第一節(jié)含微生物樣品的采集2023/3/316含微生物樣品的采集一、從土壤中采樣1根據(jù)土壤特點(diǎn)采集①土壤有機(jī)質(zhì)含量和通氣狀況2023/3/317不同土壤類型2023/3/319③地理?xiàng)l件

南方土壤比北方土壤中的微生物數(shù)量和種類都要多。④季節(jié)條件

秋季是采樣的良好季節(jié)②土壤的酸堿度2023/3/31102土壤中采樣的方法選點(diǎn)取土裝袋標(biāo)記用取樣鏟，將表層5cm左右的浮土除去，取5-25cm處的土樣10-25g，記錄地點(diǎn)、土壤質(zhì)地、植被名稱、時(shí)間及其他環(huán)境條件2023/3/3111①局部環(huán)境條件。如：海洋、腸道、溫泉、堆肥②極端環(huán)境條件。在絕大多數(shù)微生物所不能生長(zhǎng)的高溫、低溫、高酸、高堿、高鹽或高輻射強(qiáng)度的環(huán)境下，也有少數(shù)微生物存在，這類微生物被稱為極端環(huán)境微生物。三、特殊環(huán)境下采樣2023/3/3113第二節(jié)含微生物樣品的富集培養(yǎng)2023/3/3114富集(enrichment)培養(yǎng)：是在目的微生物含量較少時(shí)，根據(jù)微生物的生理特點(diǎn)，設(shè)計(jì)一種選擇性培養(yǎng)基，并創(chuàng)造有利的生長(zhǎng)條件，使目的微生物在合適的環(huán)境下迅速生長(zhǎng)繁殖，由原來(lái)自然條件下的劣勢(shì)種變成人工環(huán)境下的優(yōu)勢(shì)種，以利分離到所需要菌株的過(guò)程。富集培養(yǎng)主要根據(jù)微生物的碳源、氮源、pH、溫度、需氧情況等生理因素加以控制。2023/3/3115三、抑制不需要的菌類通過(guò)高溫、高壓、加入抗生素等方法減少非目的微生物的數(shù)量，使目的微生物的比例增加，達(dá)到富集的目的。如：硫乙醇酸鈉－－造成厭氧環(huán)境，利于厭氧菌生長(zhǎng)?？股兀梢种萍?xì)菌生長(zhǎng)，用于培養(yǎng)霉菌。2023/3/3117被分離的微生物添加物質(zhì)及其濃度被抑制的微生物放線菌放線菌酮（50），制霉菌素（50），環(huán)己亞氨（50），匹馬霉素（50），丙酸鈉（4mg）霉菌革蘭氏陰性菌其他革蘭氏陽(yáng)性菌環(huán)己亞氨+多黏菌素+枯草菌素（各20單位），多黏菌素B（5）+青霉素（1）細(xì)菌放線菌酮（50-500），制霉菌素（100），優(yōu)洛殺菌素（30-100）（eu-rocidin）霉菌、酵母菌原蟲霉素（5）原生動(dòng)物革蘭氏陽(yáng)性菌多黏菌素B（5）革蘭氏陰性菌革蘭氏陰性菌青霉素（1），月桂酸鈉（2mg）革蘭氏陽(yáng)性菌酵母菌氯霉素（100），青霉素（20）+鏈霉素（40），玫瑰紅（50）+放線菌酮（10）細(xì)菌放線菌酮霉菌霉菌菌氯霉素（100），青霉素（20）+鏈霉素（40），玫瑰紅（35-67）氯霉素（50）+放線菌酮（10），青霉素（100）細(xì)菌細(xì)菌、酵母菌2023/3/3118第三節(jié)微生物的分離2023/3/31192劃線分離法2023/3/31213利用生化反應(yīng)進(jìn)行分離飽浸含某種指示劑的固體培養(yǎng)基的濾紙片變色圈固體培養(yǎng)基中滲入溶解性差、可被特定菌利用的營(yíng)養(yǎng)成分，造成不透明的培養(yǎng)基背景。菌落利用此物質(zhì)形成透明圈。利用某種營(yíng)養(yǎng)缺陷型微生物作為指示菌，若待篩選菌具有將前體物轉(zhuǎn)化成營(yíng)養(yǎng)物的能力，指示菌就能圍繞該菌生長(zhǎng)。待篩選的菌株能分泌產(chǎn)生某些能抑制指示菌生長(zhǎng)的物質(zhì)指示劑直接摻入或噴灑固體培養(yǎng)基，菌落周圍形成變色圈。如淀粉的平皿上噴上稀碘液2023/3/3122變色圈法：2023/3/3123脂酶產(chǎn)生菌的分離：可采用固體平板變色圈法。①甘油三丁酸脂為底物，羅丹明B

為指示劑，觀察熒光圈；②制備維多利亞藍(lán)乳脂瓊脂培養(yǎng)基(pH7.0)，將樣品涂布在平板上培養(yǎng)，陽(yáng)性反應(yīng)由粉紅色變?yōu)樗{(lán)色。③改良雙層法：平皿底層倒一層營(yíng)養(yǎng)瓊脂，把一片浸有被維多利亞藍(lán)染色的乳脂的圓紙片鋪在上面，然后覆蓋一薄層含樣品營(yíng)養(yǎng)瓊脂，保溫培養(yǎng)，陽(yáng)性反應(yīng)為藍(lán)色。2023/3/31254組織分離法是從一些罹病組織或特殊組織中分離菌株的方法。①對(duì)一般患病組織的分離方法取樣無(wú)菌水洗滌表面消毒無(wú)菌水洗滌表面植入平板，培養(yǎng)鏡檢，分離純化2023/3/31265特殊菌類——環(huán)保菌的分離在分離某類污染物或廢棄物的降解微生物時(shí)，通常采用以該物質(zhì)為唯一碳源或氮源的培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)，經(jīng)過(guò)幾個(gè)月的富集培養(yǎng)后，通過(guò)劃線或涂布的方法進(jìn)行在分離平板上分離、篩選。該法在分離苯胺、DDT、甲基對(duì)硫磷（MP）、石油、甲胺磷等污染物降解菌時(shí)取得良好效果。注意：環(huán)境污染物一般對(duì)微生物的生長(zhǎng)有抑制作用，需要根據(jù)不同情況設(shè)計(jì)合理的篩選模型。2023/3/3129二、厭氣菌的分離⑴加還原劑⑵焦性沒食子酸法⑶平皿厭氣培養(yǎng)法⑷試管厭氣培養(yǎng)法⑸玻璃板隔絕空氣培養(yǎng)法⑹生物吸氧法2023/3/3130厭氧培養(yǎng)袋厭氧培養(yǎng)罐厭氧工作站厭氧操作儀器2023/3/3131第四節(jié)野生菌株篩選和目的產(chǎn)物鑒定2023/3/3132一、初篩定義：從大量分離到的微生物中將能合成目的產(chǎn)物的微生物篩選出來(lái)的過(guò)程。篩選的方法有以下兩種：1平板篩選用于在分離純化階段隨機(jī)挑選的菌株，用選擇性平板進(jìn)行定性測(cè)定。特點(diǎn)：快速，簡(jiǎn)捷，效率高。2023/3/31332搖瓶發(fā)酵篩選用于經(jīng)過(guò)定性篩選的菌種，通過(guò)搖瓶發(fā)酵進(jìn)一步測(cè)定菌株相互之間產(chǎn)物活性的差異。特點(diǎn)：比較接近發(fā)酵罐培養(yǎng)條件。接種發(fā)酵制作含指示菌或底物的瓊脂平板瓊脂平板打孔加發(fā)酵液測(cè)透明圈2023/3/3134二、復(fù)篩將初篩得到的菌株進(jìn)行發(fā)酵罐發(fā)酵，然后精確分析（如：電泳、色譜、質(zhì)譜等精密儀器）測(cè)定其確切的產(chǎn)量水平，從而確定用于生產(chǎn)的菌株的過(guò)程。復(fù)篩的工作：①優(yōu)化培養(yǎng)基成分；②注意各種培養(yǎng)條件對(duì)菌體量