實驗五線粒體的分離與觀察

實驗五線粒體的分離與觀察第1頁/共25頁一、實驗目的1.對分離得到的線粒體進行活性鑒定。2.掌握用差速離心技術分離制備線粒體的方法。第2頁/共25頁二、實驗原理細胞器是細胞中維持細胞復雜生命活動的功能性器官，為了研究各種細胞器的功能，首先就要將這些細胞器從細胞中分離出來。利用各種物理方法（研磨、超聲波振蕩、低滲等將組織制成勻漿，細胞中的個中亞組分即從細胞中釋放出來。細胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)的細胞器大小密度存在差異，因此不同細胞器在介質(zhì)中的沉降系數(shù)各不相同。根據(jù)這一原理，常用不同轉(zhuǎn)速的離心法來分離不同的細胞器。分級分離的方法有差速離心和密度梯度離心兩種。第3頁/共25頁分離細胞器最常用的方法是將組織制成勻漿，在均勻的懸浮介質(zhì)中用差速離心法進行分離，其過程包括組織細胞勻漿、分級分離和分析三步，這種方法已成為研究亞細胞成分的化學組成、理化特性及其功能的主要手段。第4頁/共25頁

(1)勻漿(Homogenization)低溫條件下，將組織放在勻漿器中，加入等滲勻漿介質(zhì)(即0.25mol／L蔗糖)進行破碎細胞使之成為各種細胞器及其包含物的勻漿。第5頁/共25頁

(2)分級分離(Fractionation)由低速到高速離心逐漸沉降。先用低速使較大的顆粒沉淀，再用較高的轉(zhuǎn)速，將浮在上清液中的顆粒沉淀下來，從而使各種細胞結(jié)構(gòu)，如細胞核、線粒體等得以分離。由于樣品中各種大小和密度不同的顆粒在離心開始時均勻分布在整個離心管中，所以每級離心得到的第一次沉淀必然不是純的最重的顆粒，須經(jīng)反復懸浮和離心加以純化.第6頁/共25頁

(3)分析

分級分離得到的組分，可用細胞化學和生化方法進行形態(tài)和功能鑒定。第7頁/共25頁中性紅-詹納斯綠染色

詹納斯綠（JanusgreenB）是對線粒體專一的活細胞染料，毒性很小，屬于堿性染料，解離后帶正電，由電性吸引堆積在線粒體膜上。由于線粒體內(nèi)具有細胞色素氧化酶系，能使詹納斯綠保持在氧化狀態(tài)（淡藍綠色），在胞質(zhì)區(qū)詹納斯綠則被還原為無色。中性紅的陽離子可與帶有一定負電荷的原生質(zhì)及細胞核結(jié)合，而使原生質(zhì)與細胞核染色。第8頁/共25頁離心技術概述離心技術是根據(jù)顆粒在作勻速圓周運動時都會受到一個向外的力這一原理而發(fā)展起來的一種分離技術。離心力是顆粒在一定角度速度下作圓周運動受到一個向外的力。與角速度和旋轉(zhuǎn)半徑有關。相對離心力又稱相對離心加速度，是指離心力相當于重力加速度的倍數(shù)，表示“數(shù)字×g”。第9頁/共25頁離心力g＝1.11×10-5n2r

r為離心機中軸到離心管遠端的距離

n為離心機每分鐘的轉(zhuǎn)速（r/min）

1000g=9.8牛（N）第10頁/共25頁離心技術類型離心技術可用于細胞器的分離。離心技術一般包括：差速離心和密度梯度離心

第11頁/共25頁（一）差速離心

（differentialcentrifugation）在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級離心，用于分離不同大小的細胞和細胞器。第12頁/共25頁差速離心法是指有低速到高速逐級沉淀分離，使較大的顆粒先在較低速中沉淀，再用較高的轉(zhuǎn)速將原先懸浮于上清夜中的較小顆粒分離沉淀下來，從而使各種亞細胞組分得以分離。但由于樣品中各種大小和密度不同的顆粒在離心十是均勻分布于整個離心介質(zhì)中的，故每級分離得到的第一次沉淀必然不是純的最重的顆粒，需經(jīng)反復懸浮和離心加以純化。第13頁/共25頁（二）密度梯度離心

（densitygradientcentrifugation）

A等速度沉降，B等密度沉降用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分離。第14頁/共25頁密度梯度離心法是用密度具有梯度的介質(zhì)來替換離心管中的密度均一的介質(zhì)，使介質(zhì)分為不同的層次，濃度的低的在上層，濃度高的在底層。將細胞勻漿加在最上層，隨后離心。這樣，不同大小、形態(tài)、密度的顆粒就會以不同的速度向下移動，集中到不同的區(qū)域，可以分別收集。細胞器分離過程中的懸浮介質(zhì)常使用水溶性的蔗糖溶液，因為它比較接近細胞質(zhì)的分散相，在一定程度上，能保持細胞器的結(jié)構(gòu)和功能，保持酶的活性，避免細胞器的聚集。第15頁/共25頁

沉淀轉(zhuǎn)速x時間內(nèi)

容

物

A150gx20min完整細胞

B1000gx20min細胞核，細胞碎片C3000gx6min葉綠體

D10000gx20min線粒體、溶酶體、微體

E105000gx120min微粒體

F105000gx20min0.26%脫氧膽酸納

核糖體

第16頁/共25頁三、實驗材料、用品1.器材：剪刀，漏斗，研缽，紗布，離心管，顯微鏡，冷凍高速離心機等。2.材料：玉米黃化苗第17頁/共25頁四、玉米線粒體及細胞核的分離從植物細胞分離線粒體，除了作線粒體功能研究外，在植物細胞遺傳工程中，常用于分離核外基因――線粒體DNA等目的。分離線粒體的方法仍采用均勻介質(zhì)中的差數(shù)離心。介質(zhì)中0.25mol/L蔗糖也可以用0.3mol/L甘露醇代替。EDTA螯合二價陽離子，Ca2+除去后細胞間粘著解體，促使組織分散成單個細胞。牛血清白蛋白（BSA）能包在細胞外面，并作為競爭性底物削弱蛋白酶的作用。第18頁/共25頁1.試劑1）分離介質(zhì)：0.25mol/L蔗糖，50mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH7.4），3mmol/LEDTA，0.75mg/mlBSA（牛血清蛋白）。2）保存液：0.3mol/L甘露醇（pH7.4）。3）20%NaClO（次氯酸鈉）溶液。4）1%詹納斯綠B染液，用生理鹽水配制。2.器材剪刀，漏斗，研缽，紗布，離心管，顯微鏡，冷凍高速離心機等。第19頁/共25頁實驗方法1）剪取1～2cm長的玉米黃化苗15g，剪碎；加3倍體積的預冷的分離介質(zhì)，冰浴上研磨成勻漿。2）勻漿用雙層紗布過濾.3）濾液700Xg離心10分鐘，除去核和雜質(zhì)沉淀。4）上清夜10000Xg離心10分鐘。5）沉淀為線粒體,可以存于0.3mol/L甘露醇中。6）涂片，立即滴加1%詹納斯綠B染液，染色20分鐘，蓋上蓋玻片，用顯微鏡觀察，線粒體是藍綠色圓形顆粒。PS:以上勻漿化及離心均控制在0~4℃進行。第20頁/共25頁涂片過程：第21頁/共25頁五、實驗結(jié)果光學顯微鏡觀察，線粒體呈藍綠色，小棒狀或啞鈴狀。

第22頁/共25頁五、實驗報告實驗目的實