實驗三動物性食品生物性污染的檢驗

實驗三動物性食品生物性污染的檢驗第1頁/共19頁實驗三、動物性食品生物性污染

物的檢驗動物性食品衛(wèi)生學實驗第2頁/共19頁一.生物性污染的來源微生物污染(microorganismpollution)寄生蟲污染(parasiticalpollution)昆蟲污染(insecticalpollution)第3頁/共19頁PathogensSpoilageOrganismsVirusesBacteriumFoodborneInfectionMicroorganismsUnpleasantsmellandtasteFungi第4頁/共19頁內(nèi)源性污染外源性污染外源性生物性污染是動物性食品微生物污染的主要途徑第5頁/共19頁二.生物性污染的評價指標菌落總數(shù)細菌總數(shù)大腸菌群值（MPN）致病菌檢測(PCR法)其他第6頁/共19頁實驗目的掌握動物性食品菌落總數(shù)、大腸菌群測定及常見致病菌PCR檢測的原理、步驟和方法了解動物性食品菌落總數(shù)的衛(wèi)生標準，進行衛(wèi)生判定第7頁/共19頁1.鮮乳的微生物學檢驗菌落總數(shù)的測定檢驗處理24±2h或48±2h36±1℃報告菌落記數(shù)每皿加入適量營養(yǎng)瓊脂選擇3個適宜稀釋度，吸取1ml加入滅菌平皿作成幾個倍數(shù)的稀釋液第8頁/共19頁注意事項無菌操作稀釋度的選擇平均菌落數(shù)在30-300之間的稀釋度為宜；每個稀釋度作兩個平皿記數(shù)要求30-300＞300＜30＞300或＜30第9頁/共19頁2.鮮乳大腸菌群值的測定第10頁/共19頁報告根據(jù)證實為大腸菌群陽性的管數(shù)，查MPN檢索表，報告每100mL(g)檢樣中大腸菌群的最可能數(shù)。判定標準第11頁/共19頁3.常見致病菌的快速檢測

——SE的PCR檢測原理以擴增的DNA分子為模板，以一對分別與模板互補的寡核苷酸片段為引物，在DNA聚合酶的作用下，按半保留復制的機制沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA合成。不斷重復這一過程，可使目的DNA片段得到擴增。因為新合成的DNA也可以作為模板，因而PCR可使DNA的合成量呈指數(shù)增長。第12頁/共19頁PCR的基本成分模板DNA特異性引物(SEF14)熱穩(wěn)定DNA聚合酶dNTP二價陽離子緩沖液過程(高溫變性、低溫退火、中溫延伸)第13頁/共19頁引物設計

利用引物設計軟件Primer5.0針對SEF14主要結構亞單位sefA的基因序列設計引物:上游引物UsefA為5′-ATGCGTAAATCAGCATCTG-3′；下游引物LsefA為5′-TTAGTTTTGATACTGCTGAAC-3′第14頁/共19頁樣品處理（模板制備）以12000rpm離心5min,上清液即含基因組DNA待檢肉樣乳1g/mL以9mL增菌液混合研碎，制成食品勻漿液37℃振蕩培養(yǎng)3小時取樣液1mL以2000rpm離心2min,取上清液以8000rpm離心5min,沉淀以50uL懸浮沸水浴10min后迅速置冰浴5min第15頁/共19頁反應體系10×Buffer2.5uLdNTP2.0MgCl22.0上游引物（20uM）1uL下游引物（20uM）1uL模板2uLTaqDNAPolymerase0.25滅菌ddH2Oupto25uL第16頁/共19頁反應參數(shù)1.Initialdenature95℃5min2.Denature95℃60s3.Anealing47℃60s4.Elongation72℃60sReturnto2for30cycle5.Finalelongation72℃10minKeep4℃5min第17頁/共19頁瓊脂糖凝膠電泳電泳條件：argrose1%