有參考基因組的轉(zhuǎn)錄組生物信息分析模板

一、生物信息剖析流程獲取原始測序序列(SequencedReads)后，在有有關(guān)物種參照序列或參照基因組的狀況下，經(jīng)過以下賤程進(jìn)行生物信息剖析：二、項目結(jié)果說明原始序列數(shù)據(jù)高通量測序(如illuminaHiSeqTM2000/MiSeq等測序平臺)測序獲取的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)堿基辨別(BaseCalling)剖析轉(zhuǎn)變?yōu)樵紲y序序列(SequencedReads)，我們稱之為RawData或RawReads，結(jié)果以FASTQ(簡稱為fq)文件格式儲存，此中包含測序序列(reads)的序列信息以及其對應(yīng)的測序質(zhì)量信息。FASTQ格式文件中每個read由四行描繪，以下：@EAS139:136:FC706VJ:2:2104:15343:1973931:Y:18:ATCACGGCTCTTTGCCCTTCTCGTCGAAAATTGTCTCCTCATTCGAAACTTCTCTGT+@@CFFFDEHHHHFIJJJ@FHGIIIEHIIJBHHHIJJEGIIJJIGHIGHCCF此中第一行以“@”開頭，隨后為illumina測序表記符(SequenceIdentifiers)和描繪文字(選擇性部分)；第二行是堿基序列；第三行以“+”開頭，隨后為illumina測序表記符(選擇性部分)；第四行是對應(yīng)序列的測序質(zhì)量(Cocketal.)

。illumina

測序表記符詳盡信息以下：EAS139136FC706VJ22104153431973931Y18ATCACG

UniqueinstrumentnameRunIDFlowcellIDFlowcelllaneTilenumberwithintheflowcelllane'x'-coordinateoftheclusterwithinthetile'y'-coordinateoftheclusterwithinthetileMemberofapair,1or2(paired-endormate-pairreadsonly)Yifthereadfailsfilter(readisbad),Notherwise0whennoneofthecontrolbitsareon,otherwiseitisanevennumberIndexsequence第四行中每個字符對應(yīng)的ASCII值減去量值。假如測序錯誤率用e表示，illuminaQphred表示，則有以下關(guān)系：

33，即為對應(yīng)第二行堿基的測序質(zhì)HiSeqTM2000/MiSeq的堿基質(zhì)量值用公式一：

Qphred

=-10log

10(e)illuminaCasava版本測序錯誤率與測序質(zhì)量值簡潔對應(yīng)關(guān)系以下：測序錯誤率測序質(zhì)量值對應(yīng)字符5%13.1%205%30?%40I測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估測序錯誤率散布檢查每個堿基測序錯誤率是經(jīng)過測序Phred數(shù)值(Phredscore,Qphred)經(jīng)過公式1轉(zhuǎn)變獲取，而Phred數(shù)值是在堿基辨別(BaseCalling)過程中經(jīng)過一種展望堿基鑒別發(fā)生錯誤概率模型計算獲取的，對應(yīng)關(guān)系以下表所顯示：illuminaCasava版本堿基辨別與Phred分值之間的簡潔對應(yīng)關(guān)系Phred分值不正確的堿基辨別堿基正確辨別率Q-sorce101/1090%Q10201/10099%Q20301/1000%Q30401/10000%Q40測序錯誤率與堿基質(zhì)量有關(guān)，受測序儀自己、測序試劑、樣品等多個要素共同影響。關(guān)于RNA-seq技術(shù)，測序錯誤率散布擁有兩個特色：測序錯誤率會跟著測序序列(SequencedReads)的長度的增添而高升，這是因為測序過程中化學(xué)試劑的耗費而致使的，并且為illumina高通量測序平臺都擁有的特色(ErlichandMitra,2008;Jiangetal.)。前6個堿基的地點也會發(fā)生較高的測序錯誤率，而這個長度也正好等于在RNA-seq建庫過程中反轉(zhuǎn)錄所需要的隨機(jī)引物的長度。因此推測前6個堿基測序錯誤率較高的原由為隨機(jī)引物和RNA模版的不完整聯(lián)合(Jiangetal.)。測序錯誤率散布檢查用于檢測在測序長度范圍內(nèi)，有無異樣的堿基地點存在高錯誤率，比方中間地點的堿基測序錯誤率明顯高于其余地點。一般狀況下，每個堿基地點的測序錯誤率都應(yīng)當(dāng)?shù)陀?。圖測序錯誤率散布圖橫坐標(biāo)為reads的堿基地點，縱坐標(biāo)為單堿基錯誤率GC含量散布檢查GC含量散布檢查用于檢測有無AT、GC分別現(xiàn)象，而這類現(xiàn)象可能是測序或許建庫所帶來的，并且會影響后續(xù)的定量剖析。在illumina測序平臺的轉(zhuǎn)錄組測序中，反轉(zhuǎn)錄成cDNA時所用的6bp的隨機(jī)引物會惹起前幾個地點的核苷酸構(gòu)成存在必定的偏好性。而這類偏好性與測序的物種和實驗室環(huán)境沒關(guān)，但會影響轉(zhuǎn)錄組測序的均一化程度(Hansenetal.)。除此以外，理論上G和C堿基及A和T堿基含量每個測序循環(huán)上應(yīng)分別相等，且整個測序過程穩(wěn)固不變，呈水平線。關(guān)于DGE測序來說，因為隨機(jī)引物擴(kuò)增偏差等原由，經(jīng)常會致使在測序獲取的每個read前6-7個堿基有較大的顛簸，這類顛簸屬于正常狀況。圖GC含量散布圖橫坐標(biāo)為reads的堿基地點，縱坐標(biāo)為單堿基所占的比率；不同顏色代表不同的堿基種類測序數(shù)據(jù)過濾測序獲取的原始測序序列，里面含有帶接頭的、低質(zhì)量的reads，為了保證信息剖析質(zhì)量，一定對rawreads進(jìn)行過濾，獲取cleanreads，后續(xù)剖析都基于cleanreads。數(shù)據(jù)辦理的步驟以下：去除帶接頭(adapter)的reads；去除N(N表示沒法確立堿基信息)的比率大于10%的reads；去除低質(zhì)量reads。RNA-seq的接頭(Adapter,OligonucleotidesequencesforTruSeqandDNASamplePrepKits)信息：

TMRNARNA5’Adapter(RA5),part#

：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’RNA3’Adapter(RA3),part#：5’-GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC(6位index)ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG3’-圖原始數(shù)據(jù)過濾結(jié)果測序數(shù)據(jù)質(zhì)量狀況匯總表數(shù)據(jù)產(chǎn)出質(zhì)量狀況一覽表SamplenameRawreadsCleanreadscleanbasesErrorrate(%)Q20(%)Q30(%)GCcontent(%)HS1_1HS1_2HS2_1數(shù)據(jù)質(zhì)量狀況詳盡內(nèi)容以下：Rawreads：統(tǒng)計原始序列數(shù)據(jù)，以四行為一個單位，統(tǒng)計每個文件的測序序列的個數(shù)。Cleanreads：計算方法同RawReads，不過統(tǒng)計的文件為過濾后的測序數(shù)據(jù)。后續(xù)的生物信息剖析都是鑒于Cleanreads。(3)Cleanbases：測序序列的個數(shù)乘以測序序列的長度，并轉(zhuǎn)變?yōu)橐訥為單位。Errorrate：經(jīng)過公式1計算獲取。Q20、Q30：分別計算Phred數(shù)值大于20、30的堿基占整體堿基的百分比。GCcontent：計算堿基G和C的數(shù)目總和占總的堿基數(shù)目的百分比。參照序列比對剖析測序序列定位算法：依據(jù)不同的基因組的特色，我們選用相對適合的軟件(動植物用TopHat(Trapnelletal.,2009)、真菌或許基因密度較高的物種用Bowtie)，適合的參數(shù)設(shè)置(如最大的內(nèi)含子長度，會依據(jù)已知的該物種的基因模型來進(jìn)行統(tǒng)計剖析)，將過濾后的測序序列進(jìn)行基因組定位剖析。以下圖為TopHat的算法表示圖：Tophat的算法主要分為兩個部分：將測序序列整段比對到外顯子上。將測序序列分段比對到兩個外顯子上。我們統(tǒng)計了實驗所產(chǎn)生的測序序列的定位個數(shù)(TotalMappedReads)及其占cleanreads的百分比，此中包含多個定位的測序序列個數(shù)(MultipleMappedReads)及其占整體（cleanreads）的百分比，以及單個定位的測序序列個數(shù)(UniquelyMappedReads)及其占整體（cleanreads）的百分比。Reads與參照基因組比對狀況統(tǒng)計表Reads與參照基因組比對狀況一覽表SamplenameHS1HS2HT1HT2HW1HW2TotalreadsTotalmapped%)%)%)%)%)%)Multiplemapped606556%)633575%)714678%)450156%)389470%)335509%)Uniquelymapped%)%)%)%)%)%)Read-1%)%)%)%)(43%)%)Read-2%)%)%)%)%)%)Readsmapto'+'%)%)%)%)%)%)Readsmapto'-'%)%)%)%)%)%)Non-splicereads%)%)%)%)%)%)Splicereads%)%)%)%)%)9910559%)Readsmappedinproperpairs%)%)%)%)%)%)比對結(jié)果統(tǒng)計詳盡內(nèi)容以下：Totalreads：測序序列經(jīng)過測序數(shù)據(jù)過濾后的數(shù)目統(tǒng)計(Cleandata)。Totalmapped：能定位到基因組上的測序序列的數(shù)目的統(tǒng)計；一般狀況下，假如不存在污染并且參照基因組選擇適合的狀況下，這部分?jǐn)?shù)據(jù)的百分比大于70%。Multiplemapped：在參照序列上有多個比對地點的測序序列的數(shù)目統(tǒng)計；這部分?jǐn)?shù)據(jù)的百分比一般會小于10%。Uniquelymapped：在參照序列上有獨一比對地點的測序序列的數(shù)目統(tǒng)計。(5)Readsmapto'+'，Readsmapto'-'：測序序列比對到基因組上正鏈和負(fù)鏈的統(tǒng)計。(6)Splicereads：(2)中，分段比對到兩個外顯子上的測序序列(也稱為Junctionreads)的統(tǒng)計，Non-splicereads為整段比對到外顯子的將測序序列的統(tǒng)計，Splicereads的百分比取決于測序片段的長度。Reads在參照基因組不同地區(qū)的散布狀況對Totalmappedreads的比對到基因組上的各個部分的狀況進(jìn)行統(tǒng)計，定位地劃分為Exon(外顯子)、Intron(內(nèi)含子)和Intergenic(基因間隔地區(qū))。正常狀況下，Exon(外顯子)地區(qū)的測序序列定位的百分比含量應(yīng)當(dāng)最高，定位到Intron(內(nèi)含子)地區(qū)的測序序列可能是因為非成熟的mRNA的污染或許基因組說明不完整致使的，而定位到Intergenic(基因間隔地區(qū))的測序序列可能是因為基因組說明不完整以及背景噪音。圖Reads在參照基因組不同地區(qū)的散布狀況Reads在染色體上的密度散布狀況對Totalmappedreads的比對到基因組上的各個染色體（分正負(fù)鏈）的密度進(jìn)行統(tǒng)計，以以下圖所示，詳細(xì)作圖的方法為用滑動窗口(windowsize)為1K，計算窗口內(nèi)部比對到堿基地點上的reads的中位數(shù)，并轉(zhuǎn)變成log2。正常狀況下，整個染色體長度越長，該染色體內(nèi)部定位的reads總數(shù)會越多(Marquezetal.)。從定位到染色體上的reads數(shù)與染色體長度的關(guān)系圖中，能夠更為直觀看出染色體長度和reads總數(shù)的關(guān)系。圖Reads在染色體上的密度散布圖上圖：橫坐標(biāo)為染色體的長度信息(以百萬堿基為單位)，縱坐標(biāo)為log2(reads的密度的中位數(shù))，綠色為正鏈，紅色為負(fù)鏈以下圖：橫坐標(biāo)為染色體的長度信息(單位為Mb)，縱坐標(biāo)為mapped到染色體上的reads數(shù)(單位為M)Reads比對結(jié)果可視化我們供給RNA-seqReads在基因組上比對結(jié)果的bam格式文件，部分物種還供給相應(yīng)的參照基因組和說明文件，并介紹使用IGV(IntegrativeGenomicsViewer)閱讀器對bam文件進(jìn)行可視化閱讀。IGV閱讀器擁有以下特色：(1)能在不同尺度下顯示單個或多個讀段在基因組上的地點，包含讀段在各個染色體上的散布狀況和在說明的外顯子、內(nèi)含子、剪接接合區(qū)、基因間區(qū)的散布狀況等；能在不同尺度下顯示不同地區(qū)的讀段豐度，以反應(yīng)不同地區(qū)的轉(zhuǎn)錄水平；(3)能顯示基因及其剪接異構(gòu)體的說明信息；(4)能顯示其余說明信息；(5)既能夠從遠(yuǎn)程服務(wù)器端下載各樣說明信息，又能夠從當(dāng)?shù)丶虞d說明信息。IGV閱讀器使用方法可參照我們供給的使用說明文檔(。圖IGV閱讀器界面可變剪切剖析用ASprofile軟件對Cufflinks(Trapnelletal.)展望出的基因模對每個樣品的可變剪切事件分別進(jìn)行分類和表達(dá)量統(tǒng)計。剖析流程及ASprofile中的可變剪切事件分類以以下圖所示：12類可變剪切事件定義以下:(1)TSS:Alternative5'firstexon(transcriptionstartsite)第一個外顯子可變剪切(2)TTS:Alternative3'lastexon(transcriptionterminalsite)最后一個外顯子可變剪切(3)SKIP:Skippedexon(SKIP_ON,SKIP_OFFpair)單外顯子跳躍(4)XSKIP:ApproximateSKIP(XSKIP_ON,XSKIP_OFFpair)單外顯子跳躍（模糊界限）(5)MSKIP:Multi-exonSKIP(MSKIP_ON,MSKIP_OFFpair)多外顯子跳躍(6)XMSKIP:ApproximateMSKIP(XMSKIP_ON,XMSKIP_OFFpair)多外顯子跳躍（模糊界限）(7)IR:Intronretention(IR_ON,IR_OFFpair)單內(nèi)含子滯留(8)XIR:ApproximateIR(XIR_ON,XIR_OFFpair)單內(nèi)含子滯留（模糊界限）(9)MIR:Multi-IR(MIR_ON,MIR_OFFpair)多內(nèi)含子滯留(10)XMIR:ApproximateMIR(XMIR_ON,XMIR_OFFpair)多內(nèi)含子滯留（模糊界限）(11)AE:Alternativeexonends(5',3',orboth)可變5'或3'端剪切XAE:ApproximateAE可變5'或3'端剪切（模糊界限）可變剪切事件分類和數(shù)目統(tǒng)計圖AS分類和數(shù)目統(tǒng)計縱軸為可變剪切事件的分類縮寫，橫軸為該種事件下可變剪切的數(shù)目，不相同品用不同子圖和顏色劃分可變剪切事件構(gòu)造和表達(dá)量統(tǒng)計表AS構(gòu)造和表達(dá)量統(tǒng)計event_ievent_typgene_ichroevent_starevent_enevent_patterstranfpkdedmtdndref_idm1000001TSS1343827734383303438330+ENSGALT000000102251000002TSS1345021834502533450253+ENSGALT00000010225ENSGALT000000102+25ENSGALT000000102+25(1)event_id:AS事件編號event_type:AS事件種類(TSS,TTS,SKIP_{ON,OFF},XSKIP_{ON,OFF},MSKIP_{ON,OFF},XMSKIP_{ON,OFF},IR_{ON,OFF},XIR_{ON,OFF},AE,XAE)(3)gene_id:cufflink組裝結(jié)果中的基因編號(4)chrom:染色體編號(5)event_start:AS事件開端地點event_end:AS事件結(jié)束地點event_signature:AS事件特色(forTSS,TTS-insideboundaryofalternativemarginalexon;for*SKIP_ON,thecoordinatesoftheskippedexon(s);for*SKIP_OFF,thecoordinatesoftheenclosingintrons;for*IR_ON,theendcoordinatesofthelong,intron-containingexon;for*IR_OFF,thelistingofcoordinatesofalltheexonsalongthepathcontainingtheretainedintron;for*AE,thecoordinatesoftheexonvariant)(8)strand:基因正負(fù)鏈信息fpkm:此AS種類該基因表達(dá)量ref_id:此基因在參照說明文件中的編號新轉(zhuǎn)錄本展望將全部測序reads數(shù)據(jù)的基因組定位結(jié)果放到一同，用Cufflinks進(jìn)行組裝，而后用Cuffcompare和已知的基因模型進(jìn)行比較，能夠:(1)發(fā)現(xiàn)新的未知基因（有關(guān)于原有基因說明文件）；(2)發(fā)現(xiàn)已知基因新的外顯子地區(qū)；(3)對已知基因的開端和停止地點進(jìn)行優(yōu)化。新基因和新外顯子地區(qū)展望結(jié)果為GTF格式的說明文件。GTF格式的詳盡說明可參照(表新轉(zhuǎn)錄本構(gòu)造說明結(jié)果seqnamesourcefeaturestartendscorestrandframeattributes1novelGeneexon1853119499.gene_id"Novel00001";transcript_id+."";exon_number"1";1novelGeneexon2081321813.gene_id"Novel00002";transcript_id+."";exon_number"1";1novelGeneexon2391724402.gene_id"Novel00003";transcript_id+."";exon_number"1";1novelGeneexon2518926100.gene_id"Novel00004";transcript_id+."";exon_number"1";seqname：染色體編號source：根源標(biāo)簽，這里的novelGene指新基因feature：地區(qū)種類，當(dāng)前我們展望外顯子地區(qū)start：開端坐標(biāo)end：停止坐標(biāo)score：不用關(guān)注strand：正負(fù)鏈信息frame：不用關(guān)注attributes：屬性，包含基因編號、轉(zhuǎn)錄本編號等信息表已知基因構(gòu)造優(yōu)化Gene_idChromosomeStrandOriginal_spanAssembled_spanENSGALG000000000031+~~ENSGALG00000000004Z-~~ENSGALG000000000116-~~ENSGALG0000000001322+2783575~27873372783575~2787453Gene_id：原說明文件中基因命名編號Chromosome：染色體編號Strand：正負(fù)鏈信息Original_span：原說明文件中基因開端地點~停止地點Assembled_span：轉(zhuǎn)錄組拼接結(jié)果中基因開端地點~停止地點6SNP和Indel剖析SNP全稱SingleNucleotidePolymorphisms，是指在基因組上由單個核苷酸變異形成的遺傳標(biāo)志，其數(shù)目好多，多態(tài)性豐富。從理論上來看每一個SNP位點都能夠有4種不同的變異形式，但實質(zhì)上發(fā)生的只有兩種，即變換和顛換，兩者之比為1:2。SNP在CG序列上出現(xiàn)最為屢次，并且多是C變換為T，原由是CG中的C常為甲基化的，自覺地脫氨后即成為胸腺嘧啶。一般而言，SNP是指變異頻次大于1%的單核苷酸變異。Indel(insertion-deletion)是指有關(guān)于參照基因組，樣本中發(fā)生的小片段的插入缺失，該插入缺失可能含一個或多個堿基。我們經(jīng)過samtools和picard-tools等工具對照對結(jié)果進(jìn)行染色體坐標(biāo)排序、去掉重復(fù)的reads等辦理，最后經(jīng)過變異檢測軟件GATK(McKennaetal.,2010)分別進(jìn)行SNPCalling和IndelCalling，并對原始結(jié)果進(jìn)行過濾，獲取以下表形式的剖析結(jié)果。此中Indel剖析結(jié)果每列的含義和SNP結(jié)果是一致的。表

6

SNP剖析結(jié)果#CHROM

POS

REF

ALT

HS1

HS2

HT1

HT2

HW1

HW21

502A

G

..

..

11..

00..1563CA....111100..11213AG....11......11316GA000001..0000#CHROM：SNP位點所在染色體POS：SNP位點坐標(biāo)REF：參照序列在該位點的基因型ALT：該位點的其余基因型othercoloums：每個個體該位點的基因型(0與REF一致；1與ALT一致；.缺乏數(shù)據(jù)支持)基因表達(dá)水平剖析一個基因表達(dá)水平的直接表現(xiàn)就是其轉(zhuǎn)錄本的豐度狀況，轉(zhuǎn)錄本豐度程度越高，則基因表達(dá)水平越高。在RNA-seq剖析中，我們能夠經(jīng)過定位到基因組地區(qū)或基因外顯子區(qū)的測序序列(reads)的計數(shù)來預(yù)計基因的表達(dá)水平。Reads計數(shù)除了與基因的真切表達(dá)水平成正比外，還與基因的長度和測序深度成正有關(guān)。為了使不同基因、不同實驗間預(yù)計的基因表達(dá)水平擁有可比性，人們引入了RPKM的觀點，RPKM(ReadsPerKilobasesperMillionreads)是每百萬reads中來自某一基因每千堿基長度的reads數(shù)目。RPKM同時考慮了測序深度和基因長度對reads計數(shù)的影響，是當(dāng)前最為常用的基因表達(dá)水平估量方法(Mortazavial.,2008)。

et結(jié)果文件分別統(tǒng)計了不同表達(dá)水平下基因的數(shù)目以及單個基因的表達(dá)水平。一般狀況下，RPKM數(shù)值或許1作為判斷基因能否表達(dá)的閾值，不同的文件所采納的閾值不同。表不同表達(dá)水平區(qū)間的基因數(shù)目統(tǒng)計表RPKMIntervalHS1HS2HT1HT2HW1HW20-111678%)11157%)11644%)11552%)11663%)11652%)1-33416%)3829%)3497%)3622%)3359%)3503%)3-156586%)6741%)6719%)6731%)6441%)6522%)15-603436%)3421%)3278%)3277%)3612%)3442%)>601055%)1023%)1033%)989%)1096%)1052%)表基因表達(dá)水平統(tǒng)計表geneID

HS1

HS2

HT1

HT2

HW1

HW2ENSGALG00000000003ENSGALG00000000004ENSGALG00000000011ENSGALG000000000138RNA-seq整體質(zhì)量評估表達(dá)水平的飽和曲線檢查定量飽和曲線檢查反應(yīng)了基因表達(dá)水平定量對數(shù)據(jù)量的要求。表達(dá)量越高的基因，就越簡單被正確立量；反之，表達(dá)量低的基因，需要較大的測序數(shù)據(jù)量才能被正確立量。表達(dá)水平的飽和曲線的詳細(xì)算法描繪以下：分別對10%、20%、30%90%的整體測序數(shù)據(jù)獨自進(jìn)行基因定量剖析，并把全部數(shù)據(jù)條件下獲取的基因的表達(dá)水平作為最后的數(shù)值。用每個百分比條件下求出的單個基因的RPKM數(shù)值和最后對應(yīng)基因的表達(dá)水平數(shù)值進(jìn)行比較，假如差別小于15%，則以為這個基因在這個條件下定量是正確的。圖定量飽和曲線檢查散布圖橫坐標(biāo)代表定位到基因組上的reads數(shù)占總reads數(shù)的百分比，縱坐標(biāo)代表定量偏差在15%之內(nèi)的基因的比率RNA-Seq有關(guān)性檢查生物學(xué)重復(fù)是任何生物學(xué)實驗所一定的，高通量測序技術(shù)也不例外(Hansenetal.)。生物學(xué)重復(fù)主要有兩個用途：一個是證明所波及的生物學(xué)實驗操作是能夠重復(fù)的且變異不大，另一個為后續(xù)的差別基因剖析所需要的。樣品間基因表達(dá)水平有關(guān)性是查驗實驗靠譜性和樣本選擇能否合理性的重要指標(biāo)。有關(guān)系數(shù)越靠近1，表示樣品之間表達(dá)模式的相像度越高。Encode計劃建議皮爾遜有關(guān)系數(shù)的平方(R2)大于(理想的取樣和實驗條件下)。詳細(xì)的項目操作中，我們要求R2起碼要大于，不然需要對樣品做出適合的解說，或許從頭進(jìn)行實驗。此部分，我們同時計算了spearman有關(guān)系數(shù)和kendall-tau有關(guān)系數(shù)作為參照，這兩個主假如針對次序變量的有關(guān)系數(shù)，即秩有關(guān)。圖RNA-Seq有關(guān)性檢查R^2:pearson有關(guān)系數(shù)的平方;rho:spearman有關(guān)系數(shù);tau:kendall-tau有關(guān)系數(shù)均一性散布檢查理想條件下，關(guān)于RNA-seq技術(shù)來說，測序序列(reads)之間為獨立抽樣并且reads在全部表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本上的散布應(yīng)當(dāng)表現(xiàn)均一化散布。但是好多研究表明，好多偏好型的要素都會影響這類均一化的散布(Dohmetal.,2008)。比如，在RNA-seq建庫過程中，片段破裂和RNA反轉(zhuǎn)錄的次序不相同會致使RNA-seq最后的數(shù)據(jù)表現(xiàn)嚴(yán)重的3’偏好性。其余要素還包含轉(zhuǎn)錄地區(qū)的GC含量不同、隨機(jī)引物等等，并且生物體內(nèi)從5’或許3’的降解過程相同會致使不均一性散布。圖不同表達(dá)水平的轉(zhuǎn)錄本的reads密度散布圖High：高表達(dá)量轉(zhuǎn)錄本；Medium：中度表達(dá)量轉(zhuǎn)錄本；Low：低表達(dá)量轉(zhuǎn)錄本；橫坐標(biāo)為距離轉(zhuǎn)錄本5’端的相對地點(以百分比表示)，縱坐標(biāo)為覆蓋深度的均勻值基因差別表達(dá)剖析基因表達(dá)水平對照經(jīng)過全部基因的RPKM的散布圖以及盒形圖對不同實驗條件下的基因表達(dá)水平進(jìn)行比較。關(guān)于同一實驗條件下的重復(fù)樣品，最后的RPKM為全部重復(fù)數(shù)據(jù)的均勻值。圖不同實驗條件下基因表達(dá)水平比對圖RPKM散布圖(左圖)的橫坐標(biāo)為log10(RPKM),縱坐標(biāo)為基因的密度。RPKM盒形圖(右圖)的橫坐標(biāo)為樣品名稱，縱坐標(biāo)為log10(RPKM)，每個地區(qū)的盒形圖對五個統(tǒng)計量(至上而下分別為最大值，上四分位數(shù)，中值，下四分位數(shù)和最小值)差別表達(dá)基因列表基因差別表達(dá)的輸入數(shù)據(jù)為基因表達(dá)水平剖析中獲取的readcount數(shù)據(jù)。關(guān)于有生物學(xué)重復(fù)的樣品，剖析我們采納DESeq（Andersetal,2010）進(jìn)行剖析：該剖析方法鑒于的模型是負(fù)二項散布，第i個基因在第j個樣本中的readcount值為Kij，則有K～NB(μ,σij2)ijij關(guān)于無生物學(xué)重復(fù)的樣品，先采納TMM對re