實(shí)驗(yàn)大腸桿菌的分離和培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)1大腸桿菌的培養(yǎng)和分離基本要求1.進(jìn)行大腸桿菌的擴(kuò)增，利用液體培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)的操作。2.進(jìn)行大腸桿菌的分離，用固體平面培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌的培養(yǎng)。當(dāng)前1頁(yè)，總共33頁(yè)。一、大腸桿菌

革蘭氏陰性、兼性厭氧的腸道桿菌在腸道中一般對(duì)人無(wú)害但也有一些菌株對(duì)人體是有害的，可侵襲腸粘膜并產(chǎn)生毒素任何大腸桿菌如果進(jìn)入人的泌尿系統(tǒng)，都會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害。當(dāng)前2頁(yè)，總共33頁(yè)。結(jié)晶紫碘液95%乙醇革蘭氏染色法1min革蘭陽(yáng)性革蘭陰性1min脫色復(fù)染當(dāng)前3頁(yè)，總共33頁(yè)。菌落（colony）：一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞在固體培養(yǎng)基上發(fā)展成一個(gè)肉眼可見，具一定形態(tài)結(jié)構(gòu)的子細(xì)胞群。光滑型菌落粗糙型菌落當(dāng)前4頁(yè)，總共33頁(yè)。當(dāng)前5頁(yè)，總共33頁(yè)。二、細(xì)菌的培養(yǎng)和分離1、實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備：移液槍當(dāng)前6頁(yè)，總共33頁(yè)。接種環(huán)玻璃刮刀當(dāng)前7頁(yè)，總共33頁(yè)。超凈工作臺(tái)（保證無(wú)菌環(huán)境）當(dāng)前8頁(yè)，總共33頁(yè)。高壓蒸汽滅菌鍋當(dāng)前9頁(yè)，總共33頁(yè)。恒溫培養(yǎng)箱當(dāng)前10頁(yè)，總共33頁(yè)。搖床當(dāng)前11頁(yè)，總共33頁(yè)。2、培養(yǎng)基：平板斜面固體培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基：蛋白胨：0.5g酵母提取物：0.25gNaCl:0.5gH2O:50mL瓊脂：1g液體培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基調(diào)pH值當(dāng)前12頁(yè)，總共33頁(yè)。菌膜菌沉淀均勻渾濁對(duì)照液體培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）當(dāng)前13頁(yè)，總共33頁(yè)。3、實(shí)驗(yàn)步驟：（1）培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿滅菌

——高壓蒸汽滅菌法

將配制好的50mlLB液體和固體培養(yǎng)基分別裝入250ml三角瓶中，加上封口膜；

將培養(yǎng)皿用牛皮紙包好；置于滅菌鍋內(nèi)1kg壓力滅菌15min

（121℃）當(dāng)前14頁(yè)，總共33頁(yè)。無(wú)菌技術(shù)

最常用的滅菌方法是高壓蒸汽滅菌，它可以殺滅所有的生物，同時(shí)可以基本保持培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分不被破壞。有些玻璃器皿也可采用高溫干熱滅菌。為防止雜菌，特別是空氣中的雜菌污染，試管及玻璃燒瓶都需采用適宜的塞子塞口，通常采用棉花塞（不能用脫脂棉：易吸水引起后引起污染），也可采用各種金屬、塑料、封口膜及硅膠帽，它們只可讓空氣通過(guò)，而空氣中的其他微生物不能通過(guò)。（160℃2h或170℃1h）當(dāng)前15頁(yè)，總共33頁(yè)。高壓蒸汽滅菌法：玻璃器皿、金屬、移液槍頭等（火焰）灼燒：接種環(huán)、試管口、三角燒瓶口紫外燈+過(guò)濾風(fēng)：超凈臺(tái)滅菌消毒：70%酒精棉球（消毒：利用化學(xué)或物理方法，殺死大部份致病微生物的過(guò)程。）當(dāng)前16頁(yè)，總共33頁(yè)。（2）倒平板

滅菌后，待滅菌鍋壓力與大氣壓力相同時(shí)打開鍋蓋將有培養(yǎng)基的三角瓶和培養(yǎng)皿放到超凈臺(tái)上打開超凈臺(tái)的紫外燈和過(guò)濾風(fēng)，待固體培養(yǎng)基冷卻到60℃時(shí)，關(guān)閉紫外燈用酒精棉球消毒桌面和手。當(dāng)前17頁(yè)，總共33頁(yè)。倒平板：10-12ml培養(yǎng)基/培養(yǎng)皿

每倒入一個(gè)后立即置于水平位置上，輕輕晃動(dòng)，使培養(yǎng)基鋪滿平皿底部，待凝，并形成平面。酒精燈旁：左手？右手？當(dāng)前18頁(yè)，總共33頁(yè)。制作試管斜面：

將配制好的呈熔化狀態(tài)的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到試管中時(shí)必須用三角漏斗

滅菌試管冷卻到50℃左右，把試管棉塞一端擱在玻棒上，待冷凝后即成試管斜面

將分裝好的含培養(yǎng)基的試管滅菌P21小字部分當(dāng)前19頁(yè)，總共33頁(yè)。1/3在試管外，2/3在試管內(nèi)正確不正確棉塞制作當(dāng)前20頁(yè)，總共33頁(yè)。（3）接種培養(yǎng)

左手：將大腸桿菌斜面和有液體培養(yǎng)基的三角燒瓶，靠近酒精燈火焰；

右手：拿接種環(huán)，并用無(wú)名指和小指夾住斜面的棉塞和三角瓶的封口膜；

接種環(huán)在火焰上燒紅，再深入到斜面，使環(huán)接觸培養(yǎng)基，再取菌體；

將菌體放入三角瓶的液體培養(yǎng)基中，瓶口封口膜和管口棉塞復(fù)原；

將三角瓶置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)12h。當(dāng)前21頁(yè)，總共33頁(yè)。當(dāng)前22頁(yè)，總共33頁(yè)。（4）劃線分離

在酒精燈火焰上灼燒接種環(huán)；

將搖床上培養(yǎng)了12h的菌液打開，接種環(huán)部分深入到菌液中；

在固體培養(yǎng)基的平板上連續(xù)劃線，接種環(huán)只在菌液中蘸菌液一次，劃線后蓋好培養(yǎng)皿；

將培養(yǎng)皿倒置（蓋在下面），放到恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-24h后，可看到在劃線的末端出現(xiàn)不連續(xù)的單個(gè)菌落，表明菌已被分離。當(dāng)前23頁(yè)，總共33頁(yè)。劃線分離法劃線的起點(diǎn)要有菌，且每一次新的起點(diǎn)應(yīng)比前一次的起點(diǎn)菌含量（濃度）低劃線的最終點(diǎn)不能與前面的劃線點(diǎn)重疊除第1次外，其余幾次劃線前，都要將接種環(huán)火焰灼燒當(dāng)前24頁(yè)，總共33頁(yè)。恒溫培養(yǎng)箱平板倒置防止培養(yǎng)皿蓋上的冷凝水滴落入培養(yǎng)基表面，使菌落中的菌隨水?dāng)U散，造成污染。當(dāng)前25頁(yè)，總共33頁(yè)。劃線分離法當(dāng)前26頁(yè)，總共33頁(yè)。（5）斜面接種保存

在無(wú)菌操作下將單菌落用接種環(huán)取出，再用劃線法接種在斜面上。37℃培養(yǎng)24h后，4℃冰箱保存。當(dāng)前27頁(yè)，總共33頁(yè)。涂布分離法當(dāng)前28頁(yè)，總共33頁(yè)。首先，涂布分離法的操作比劃線分離法更復(fù)雜。因?yàn)橥坎挤蛛x法包括先將菌液稀釋的步驟，而且通常要稀釋多個(gè)濃度，常稀釋到10-5-10-7倍。（稀釋實(shí)驗(yàn)過(guò)程見P26圖）在涂布時(shí)，從不同稀釋度的稀釋菌液中各取0.1ml放在平板固體培養(yǎng)基上，再用玻璃刮刀涂布后培養(yǎng)。其次，涂布分離法更易分開單菌落。通常培養(yǎng)皿中有20個(gè)以內(nèi)的單菌落為最合適。當(dāng)前29頁(yè)，總共33頁(yè)。土樣稀釋當(dāng)前30頁(yè)，總共33頁(yè)。液樣稀釋當(dāng)前31頁(yè)