基因工程原理第3章基因克隆載體

基因工程原理PrincipleofGeneEngineering第三章基因工程原理當(dāng)前1頁(yè)，總共84頁(yè)。DNA重組（限制性內(nèi)切酶）運(yùn)輸工具——基因克隆載體目的基因的制備目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞外源基因的表達(dá)基因工程的應(yīng)用當(dāng)前2頁(yè)，總共84頁(yè)。第三章基因克隆載體克隆載體：一種具有特定功能的DNA分子，他們將攜帶外源DNA片段或基因進(jìn)入受體細(xì)胞，并使其在特定受體細(xì)胞中得以維持或表達(dá)。原核生物克隆載體真核生物克隆載體穿梭載體：是指含有兩個(gè)親緣關(guān)系不同的復(fù)制子，能在兩種不同的生物中復(fù)制的。例如既能在原核生物中復(fù)制，又能在真核生物中復(fù)制的載體。當(dāng)前3頁(yè)，總共84頁(yè)。針對(duì)受體細(xì)胞的可轉(zhuǎn)移性自主復(fù)制功能：ori顯著的篩選標(biāo)記：抗藥性或顯色特定的多克隆位點(diǎn)：RE位點(diǎn)安全性：不含對(duì)受體有害基因、不任意轉(zhuǎn)入其它細(xì)胞尤其是人體細(xì)胞第一節(jié)克隆載體的一般特征當(dāng)前4頁(yè)，總共84頁(yè)。一、細(xì)菌質(zhì)粒載體第二節(jié)原核生物基因克隆載體——細(xì)菌質(zhì)粒載體是以細(xì)菌質(zhì)粒DNA分子為基礎(chǔ)構(gòu)建的克隆載體，主要用于外源基因片段的轉(zhuǎn)移、貯存、表達(dá)以及基因文庫(kù)的構(gòu)建等。當(dāng)前5頁(yè)，總共84頁(yè)?！拗骷?xì)胞染色體外裸露的雙鏈DNA分子。（一）質(zhì)粒（Plasmid）組成與構(gòu)型1.質(zhì)粒構(gòu)型：共價(jià)閉合環(huán)型DNA（ccc-DNA）呈超螺旋SC構(gòu)型開(kāi)環(huán)DNA（oc-DNA）線性DNA（L-DNA）當(dāng)前6頁(yè)，總共84頁(yè)。ccc-DNAl-DNAoc-DNA當(dāng)前7頁(yè)，總共84頁(yè)。2.質(zhì)粒DNA分子大小當(dāng)前8頁(yè)，總共84頁(yè)。3.質(zhì)粒的復(fù)制——嚴(yán)緊型質(zhì)粒：1個(gè)寄主內(nèi)僅含1-3拷貝——松弛型質(zhì)粒：1個(gè)寄主內(nèi)含10-60拷貝當(dāng)前9頁(yè)，總共84頁(yè)。質(zhì)粒DNA復(fù)制：?jiǎn)蜗驈?fù)制，受宿主細(xì)胞和質(zhì)粒遺傳系統(tǒng)雙重控制，不會(huì)無(wú)限制復(fù)制。質(zhì)粒DNA復(fù)制控制機(jī)理的分子模型：自體阻遏蛋白質(zhì)模型（autorepressormodel）抑制蛋白質(zhì)稀釋模型（inhibitordilutionmodel）質(zhì)?？刂疲篛ri序列拷貝數(shù)：細(xì)胞內(nèi)某種質(zhì)粒的數(shù)量與染色體的數(shù)量之比。當(dāng)前10頁(yè)，總共84頁(yè)。自體阻遏蛋白質(zhì)模型：質(zhì)粒DNA復(fù)制控制機(jī)理有兩種解釋解釋一：質(zhì)粒DNA的復(fù)制是由一種叫做起始蛋白質(zhì)Rep引發(fā)的。Rep蛋白質(zhì)編碼基因rep和自體阻遏蛋白質(zhì)編碼基因atr是屬于同一個(gè)操縱子，它們共轉(zhuǎn)錄成同一個(gè)mRNA分子。自體阻遏蛋白質(zhì)通過(guò)同啟動(dòng)子-操縱基因區(qū)（P/O）的結(jié)合作用，調(diào)節(jié)質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)錄作用，以維持細(xì)胞中Atr和Rep蛋白質(zhì)處于恒定的水平。而后，由Atr蛋白質(zhì)調(diào)節(jié)產(chǎn)生的Rep蛋白質(zhì)，則是通過(guò)同復(fù)制起點(diǎn)（ori）的結(jié)合，來(lái)引發(fā)質(zhì)粒DNA的復(fù)制[圖（a）]。當(dāng)前11頁(yè)，總共84頁(yè)。自體阻遏蛋白質(zhì)模型：解釋二：Rep蛋白質(zhì)是一種具有雙重功能的蛋白質(zhì)。它既具有自體阻遏蛋白質(zhì)的功能，可同P/O區(qū)結(jié)合而抑制轉(zhuǎn)錄作用；同時(shí)又具有起始蛋白質(zhì)的功能，能對(duì)復(fù)制起點(diǎn)（ori）發(fā)生作用，引發(fā)質(zhì)粒DNA進(jìn)行復(fù)制[圖（b）]當(dāng)前12頁(yè)，總共84頁(yè)。抑制蛋白質(zhì)稀釋模型：質(zhì)粒DNA的復(fù)制，是受一種由質(zhì)粒DNA編碼的抑制蛋白質(zhì)Cop調(diào)控的。細(xì)胞中Cop蛋白質(zhì)的濃度是同質(zhì)粒分子的拷貝數(shù)成正比。Cop抑制質(zhì)粒DNA復(fù)制活性的作用方式有兩種途徑：通過(guò)同質(zhì)粒DNA的復(fù)制起點(diǎn)（ori）結(jié)合，直接地抑制質(zhì)粒DNA的復(fù)制。通過(guò)阻斷起始蛋白質(zhì)Rep的合成，間接地抑制質(zhì)粒DNA的合成。當(dāng)前13頁(yè)，總共84頁(yè)。——在沒(méi)有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能在同一宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地共存，這一現(xiàn)象叫質(zhì)粒不親和性。隨著細(xì)胞分裂質(zhì)粒分配到子細(xì)胞質(zhì)?？截悢?shù)加倍兩種不相容質(zhì)粒的拷貝數(shù)變化4.質(zhì)粒的不親和性當(dāng)前14頁(yè)，總共84頁(yè)。野生型與其衍生物通常屬于不親和質(zhì)粒，因此，受體細(xì)胞最好不含內(nèi)源質(zhì)粒當(dāng)前15頁(yè)，總共84頁(yè)。接合型質(zhì)粒：含有tra基因的質(zhì)粒。F質(zhì)粒非接合型質(zhì)粒：不含tra基因的質(zhì)粒。ColE15.質(zhì)粒遷移——轉(zhuǎn)移性質(zhì)?？稍诩?xì)胞間轉(zhuǎn)移，并能帶動(dòng)染色體發(fā)生轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。構(gòu)建克隆載體的一般是非接合型質(zhì)粒當(dāng)前16頁(yè)，總共84頁(yè)。顯性質(zhì)粒：能使宿主細(xì)胞表現(xiàn)出質(zhì)粒所攜帶的性狀。如：隱蔽質(zhì)粒：不會(huì)賦予宿主細(xì)胞新性狀的質(zhì)粒為隱性質(zhì)粒。6.顯性質(zhì)粒和隱蔽質(zhì)?？剐再|(zhì)粒（R質(zhì)粒），抗Amp（Ap)、抗Cmp（Cm)、抗Kan（Km)、抗Tet（Tc)等育性質(zhì)粒（F質(zhì)粒）降解質(zhì)粒：降解農(nóng)藥Ti質(zhì)粒：形成冠癭瘤當(dāng)前17頁(yè)，總共84頁(yè)。（二）構(gòu)建質(zhì)粒克隆載體的策略含有有效的質(zhì)粒復(fù)制起始位點(diǎn)（ori）含有外源DNA片段克隆位點(diǎn)含有標(biāo)記基因載體DNA分子盡可能小特殊需要的元件：強(qiáng)啟動(dòng)子、終止子…當(dāng)前18頁(yè)，總共84頁(yè)。（三）質(zhì)粒載體的構(gòu)建選擇合適的出發(fā)質(zhì)粒：ori，選擇標(biāo)記、克隆位點(diǎn)、啟動(dòng)子、終止子……正確獲得構(gòu)建質(zhì)粒載體的元件組裝合適的選擇標(biāo)記基因選用合適的啟動(dòng)子構(gòu)建過(guò)程簡(jiǎn)單1.質(zhì)粒載體的構(gòu)建原則當(dāng)前19頁(yè)，總共84頁(yè)。pBR322質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)特征：大?。?363bp具有ColE1拷貝復(fù)制子選擇標(biāo)記：Amp，Tet24種限制性核酸內(nèi)切酶單一位點(diǎn)

BamHI等導(dǎo)致Tet插入失活

PstI等導(dǎo)致Amp插入失活可以克隆10kb以下外源DNA片段2.大腸桿菌質(zhì)?？寺≥d體pBR322當(dāng)前20頁(yè)，總共84頁(yè)。啟動(dòng)子區(qū)當(dāng)前21頁(yè)，總共84頁(yè)。啟動(dòng)子：Promotor，DNA分子上能與RNA聚合酶結(jié)合并形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體的區(qū)域，在許多情況下，還包括促進(jìn)這一過(guò)程的調(diào)節(jié)蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)前22頁(yè)，總共84頁(yè)。Pribnowbox5’-AGGAGG-3’SD序列當(dāng)前23頁(yè)，總共84頁(yè)。pBR322質(zhì)?？寺≥d體構(gòu)建：當(dāng)前24頁(yè)，總共84頁(yè)。pBR322質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)來(lái)源優(yōu)點(diǎn)：分子量小2個(gè)選擇標(biāo)記及若干個(gè)插入失活位點(diǎn)高拷貝數(shù)Apr缺點(diǎn)：負(fù)篩選當(dāng)前25頁(yè)，總共84頁(yè)。①pUC質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)pBR322的復(fù)制起點(diǎn)Amp標(biāo)記大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因LacZ的啟動(dòng)子、調(diào)節(jié)因子及編碼α-肽鏈的DNA序列——LacZ’在LacZ’的5‘端有1段多克隆位點(diǎn)（MCS）區(qū)段。3.質(zhì)?？寺≥d體pUC18/19當(dāng)前26頁(yè)，總共84頁(yè)。當(dāng)前27頁(yè)，總共84頁(yè)。當(dāng)前28頁(yè)，總共84頁(yè)。pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)——具有更小的分子量和更高的拷貝數(shù)pUC18/19的分子量2.69kb——具有多克隆位點(diǎn)：多種粘性末端的切點(diǎn)——篩選方便：藍(lán)/白菌落當(dāng)前29頁(yè)，總共84頁(yè)。當(dāng)前30頁(yè)，總共84頁(yè)。pBR322質(zhì)粒是人工構(gòu)建的一種較為理想的大腸桿菌質(zhì)粒載體，分子大小為（4.3kb），具有松弛型復(fù)制子，選擇標(biāo)記為（Amp）和（Tet）。就克隆一個(gè)基因(DNA片段)來(lái)說(shuō)，最簡(jiǎn)單的質(zhì)粒載體也必需包括三個(gè)部分：（復(fù)制區(qū)：含有復(fù)制起點(diǎn)）；（選擇標(biāo)記：主要是抗性基因）；（克隆位點(diǎn)：便于外源DNA的插入）。另外，一個(gè)理想的質(zhì)粒載體必須具有低分子量。載體的功能是（d）（a）外源基因進(jìn)入受體的搭載工具（b）不能為外源基因提供整合能力（c）不能提供復(fù)制能力（d）不能為外源基因提供表達(dá)能力基因工程中所用的質(zhì)粒載體大多是改造過(guò)的，真正的天然質(zhì)粒載體很少，在下列載體中只有（a）被視為用作基因工程載體的天然質(zhì)粒載體（a）pSCl01（b）pBR322（c）pUBll0（d）pUCl8當(dāng)前31頁(yè)，總共84頁(yè)。第七次課結(jié)束！當(dāng)前32頁(yè)，總共84頁(yè)。4.TA載體TTAA當(dāng)前33頁(yè)，總共84頁(yè)。當(dāng)前34頁(yè)，總共84頁(yè)。5.質(zhì)粒表達(dá)載體——表達(dá)載體是在克隆載體的基礎(chǔ)上增加了表達(dá)元件構(gòu)建而成的，在受體細(xì)胞內(nèi)能穩(wěn)定維持并表達(dá)外源目的基因。當(dāng)前35頁(yè)，總共84頁(yè)。lac啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)當(dāng)前36頁(yè)，總共84頁(yè)。質(zhì)粒表達(dá)載體融合型表達(dá)載體非融合型表達(dá)載體分泌型表達(dá)載體當(dāng)前37頁(yè)，總共84頁(yè)。融合蛋白質(zhì)克隆載體克隆外源基因示意圖融合蛋白表達(dá)載體：融合蛋白：由克隆在一起的兩個(gè)或數(shù)個(gè)不同基因的編碼序列組成的融合基因轉(zhuǎn)移產(chǎn)生的單一的多肽序列。當(dāng)前38頁(yè)，總共84頁(yè)。表達(dá)融合體蛋白質(zhì)策略的優(yōu)點(diǎn)：（1）克隆的外源基因能有效轉(zhuǎn)譯。（2）表達(dá)的蛋白質(zhì)穩(wěn)定。（3）可以加入信號(hào)肽，定位輸送蛋白質(zhì)。（4）利于分離純化。當(dāng)前39頁(yè)，總共84頁(yè)。非融合蛋白表達(dá)載體：當(dāng)前40頁(yè)，總共84頁(yè)。二、噬菌體克隆載體λDNA：——在噬菌體中是線狀DNA分子，進(jìn)入寄主細(xì)胞后呈環(huán)狀DNA分子?！L(zhǎng)48kb?！笥覂啥烁饔?2bp組成的彼此完全互補(bǔ)的粘性末端。形成cos位點(diǎn)?！?1個(gè)基因，其中1/2參與了噬菌體生命周期，是必要基因，另1/2屬于不必要基因，用于基因工程操作。當(dāng)前41頁(yè)，總共84頁(yè)。相關(guān)概念：溶菌生命周期：噬菌體吸附到寄主細(xì)胞表面后，注入DNA進(jìn)行復(fù)制及蛋白質(zhì)合成，并組裝成子代噬菌體顆粒后，使寄主細(xì)胞破裂，釋放出來(lái)的過(guò)程。溶原生命周期：在感染過(guò)程中沒(méi)有產(chǎn)生出子代噬菌體顆粒，噬菌體DNA整合到寄主細(xì)胞染色體上，隨著染色體的復(fù)制而復(fù)制的過(guò)程。溫和噬菌體：能進(jìn)入溶原周期和溶菌周期的噬菌體。烈性噬菌體：具有溶菌生命周期的噬菌體。溶原性細(xì)菌：帶有溫和噬菌體的細(xì)菌。當(dāng)前42頁(yè)，總共84頁(yè)。溶原性噬菌體的生命周期a：噬菌體吸附到寄主細(xì)胞表面；b：噬菌體DNA注入寄主細(xì)胞；c：噬菌體大量增殖d：子代噬菌體顆粒組裝；e：寄主細(xì)胞溶菌；f：噬菌體DNA從寄主染色體DNA上刪除下來(lái)；g：溶原性細(xì)胞按照正常速率分裂。當(dāng)前43頁(yè)，總共84頁(yè)。1.與構(gòu)建載體相關(guān)的λ噬菌體性質(zhì)基因按功能相近性聚集成簇：左側(cè)區(qū)：A-J，合成頭尾蛋白的全部基因中間區(qū)：J-N，非必要區(qū)，與重組有關(guān)右側(cè)區(qū)：N-R，DNA合成及調(diào)控。當(dāng)前44頁(yè)，總共84頁(yè)。G+C=10A+T=2cos位點(diǎn)：cohesive-endsite粘性末端位點(diǎn)線性雙鏈DNA分子兩端各有1條由12個(gè)核苷酸組成的完全互補(bǔ)的5'單鏈突出序列，即粘性末端。注入到寄主細(xì)胞內(nèi)的線性DNA分子會(huì)迅速的通過(guò)粘性末端之間的互補(bǔ)作用，形成環(huán)狀雙鏈DNA分子。然后在DNA連接酶的作用下，將相鄰的5'—P和3'—OH基團(tuán)封閉起來(lái)，進(jìn)一步超盤(pán)旋化，這種由粘性末端結(jié)合形成的雙鏈DNA區(qū)域稱為cos位點(diǎn)。當(dāng)前45頁(yè)，總共84頁(yè)。2.λ噬菌體作為構(gòu)建克隆載體的依據(jù)λ噬菌體是一種溫和噬菌體能承載比較大的外源DNA片段存在多個(gè)限制性位點(diǎn)當(dāng)前46頁(yè)，總共84頁(yè)。3.構(gòu)建λ噬菌體克隆載體的基本策略和路線用限制酶切去λDNA上的非必需區(qū)在λDNA的非必需區(qū)內(nèi)組入選擇性標(biāo)構(gòu)建重組λDNA分子體外包裝系統(tǒng)當(dāng)前47頁(yè)，總共84頁(yè)。噬菌體的包裝：當(dāng)前48頁(yè)，總共84頁(yè)。體外包裝：在離體條件下，用噬菌體或病毒的蛋白質(zhì)包裹噬菌體或病毒的裸核酸，組裝成有感染性的噬菌體或病毒顆粒的過(guò)程。當(dāng)前49頁(yè)，總共84頁(yè)。λDNA分子體外包裝系統(tǒng)的建立E基因：λ噬菌體的E基因編碼頭部基因的主要成分（占頭部總蛋白的70%）D基因：λ噬菌體的D基因也編碼頭部蛋白，但主要與λDNA進(jìn)入頭部和頭部的成熟有關(guān)（占20%）當(dāng)前50頁(yè)，總共84頁(yè)。當(dāng)前51頁(yè)，總共84頁(yè)。當(dāng)前52頁(yè)，總共84頁(yè)。4.λ噬菌體DNA的包裝限制問(wèn)題包裝能力：λDNA×75%——λDNA×105%，即從36kb——51kb野生型λDNA的必要區(qū)是28kb，所以能加入的外源DNA長(zhǎng)度最大為51kb-28kb=23kb。實(shí)際為15kb。若λ基因組缺失大于25%時(shí)，也不能有效包裝。當(dāng)前53頁(yè)，總共84頁(yè)。轉(zhuǎn)染作用（transfection）：寄主細(xì)胞捕獲噬菌體DNA的過(guò)程。或重組噬菌體DNA分子感染并進(jìn)入大腸桿菌的過(guò)程。轉(zhuǎn)導(dǎo)作用（transduction）：以噬菌體顆粒為媒介轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)的過(guò)程。轉(zhuǎn)化作用（transformation）：將質(zhì)粒等外源DNA引入細(xì)胞的過(guò)程。5.λ噬菌體克隆載體的應(yīng)用——構(gòu)建cDNA文庫(kù)細(xì)菌質(zhì)粒載體：是以細(xì)菌質(zhì)粒DNA分子為基礎(chǔ)構(gòu)建的克隆載體，主要用于外源基因片段的轉(zhuǎn)移、貯存、表達(dá)以及基因文庫(kù)的構(gòu)建等。當(dāng)前54頁(yè)，總共84頁(yè)。三、Cosmid載體（cossite-carryingplasmid）（一）Cosmid載體的特征環(huán)形雙鏈DNA分子，大小一般在10kb以下具有質(zhì)粒的性質(zhì)含有一個(gè)cos位點(diǎn)：cohesive-endsite粘性末端位點(diǎn)能承載較大的外源DNA片段——一類(lèi)由人工構(gòu)建的含有λDNA的cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類(lèi)型的質(zhì)粒載體。當(dāng)前55頁(yè)，總共84頁(yè)。

克隆能力：31—45kbpBR322（6524bp)λDNA：cos序列和控制包裝序列pBR322質(zhì)粒的復(fù)制子抗藥性基因多克隆位點(diǎn)區(qū)當(dāng)前56頁(yè)，總共84頁(yè)。（二）Cosmid載體的應(yīng)用程序應(yīng)用柯斯質(zhì)粒載體，在大腸桿菌細(xì)胞中克隆大片段的真核基因組DNA技術(shù)，叫做柯斯克?。╟osmidcloning）?？寺∵M(jìn)柯斯載體包裝進(jìn)噬菌體感染大腸桿菌選擇轉(zhuǎn)化子當(dāng)前57頁(yè)，總共84頁(yè)。進(jìn)行λDNA體外包裝時(shí)，選擇E基因突變的λ噬菌體，能夠使溶菌物中積累了大量的（尾部蛋白），而利用D基因突變的λ噬菌體，產(chǎn)生大量的（頭部蛋白），把這兩種溶菌物和重組DNA混合起來(lái)，將重組λDNA包裝起來(lái)。 重組在λ噬菌體載體上的DNA分子轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌的過(guò)程包括：制備包裝物，然后進(jìn)行（體外包裝），侵染（大腸桿菌），并篩選（重組體）噬菌斑?？滤官|(zhì)粒(cosmid)是質(zhì)?！删w雜合載體，它的復(fù)制子來(lái)自（質(zhì)粒）、COS位點(diǎn)序列來(lái)自（噬菌體），最大的克隆片段達(dá)到（45）kb。噬菌體載體由于受到包裝的限制，插入外源DNA片段后，總的長(zhǎng)度應(yīng)在噬菌體基因組的（75％～105％）的范圍內(nèi)。下列哪種克隆載體對(duì)外源DNA的容載量最大？（b）（a）質(zhì)粒（b）cosmid（c）λ噬菌體載體（d）cDNA表達(dá)載體（e）pUC質(zhì)粒當(dāng)前58頁(yè)，總共84頁(yè)。第八次課結(jié)束！當(dāng)前59頁(yè)，總共84頁(yè)。四、藍(lán)藻基因克隆載體（一）藍(lán)藻質(zhì)粒表達(dá)載體pPEK2的構(gòu)建出發(fā)質(zhì)粒：藍(lán)藻pPbS和pBR322當(dāng)前60頁(yè)，總共84頁(yè)。（二）藍(lán)藻染色體定位整合載體的構(gòu)建當(dāng)前61頁(yè)，總共84頁(yè)。第三節(jié)酵母基因克隆載體1.2μm質(zhì)粒當(dāng)前62頁(yè)，總共84頁(yè)。當(dāng)前63頁(yè)，總共84頁(yè)。2.YEp24（酵母游離型質(zhì)粒）載體出發(fā)質(zhì)粒：酵母2mm質(zhì)粒和pBR322當(dāng)前64頁(yè)，總共84頁(yè)。ura3基因：尿嘧啶合成缺陷型基因酵母V號(hào)染色體上的一個(gè)基因，系統(tǒng)命名號(hào)為YEL021W，編碼乳清苷5-磷酸脫羧酶，是酵母RNA嘧啶核苷酸合成過(guò)程中關(guān)鍵酶。應(yīng)用方式：（2）陰性選擇：乳清苷5-磷酸脫羧酶正常（1）陽(yáng)性選擇：乳清苷5-磷酸脫羧酶缺陷轉(zhuǎn)入ura3基因，培養(yǎng)基中加入尿苷或尿嘧啶，缺陷株生長(zhǎng)。5-氟乳清酸5-氟尿嘧啶，乳清苷5-磷酸脫羧酶細(xì)胞死亡當(dāng)前65頁(yè)，總共84頁(yè)。Ti質(zhì)粒（Tumorinducingplasmid）——存在于植物的土壤致癌農(nóng)桿菌中，誘發(fā)植物產(chǎn)生冠癭瘤的質(zhì)粒。分為4種類(lèi)型：一、農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒載體章魚(yú)堿型胭脂堿型琥珀堿型農(nóng)桿堿型第四節(jié)植物基因克隆載體（一）農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒當(dāng)前66頁(yè)，總共84頁(yè)。Ti質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體以外的遺傳物質(zhì)雙鏈閉合環(huán)型DNA200-250kb結(jié)構(gòu)分為4個(gè)功能區(qū)：

（Vir區(qū)）（Con區(qū)）T-DNA區(qū)Vir區(qū)Con區(qū)Ori區(qū)當(dāng)前67頁(yè)，總共84頁(yè)。（Vir區(qū)）（Con區(qū)）長(zhǎng)度25kb，占Ti質(zhì)粒1/10主要功能是轉(zhuǎn)移DNA，隨機(jī)插入植物染色體中。——天然的質(zhì)?？寺≥d體。含有2類(lèi)基因：（1）編碼冠癭堿合成酶（ocs、nos）及分解代謝的基因。（2）誘發(fā)腫瘤基因（Onc）Vir區(qū)：激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性。占Ti質(zhì)粒1/3。Con區(qū)——調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移，含有與細(xì)菌間接合轉(zhuǎn)移的有關(guān)基因tra。Ori區(qū)——復(fù)制起始區(qū)。當(dāng)前68頁(yè)，總共84頁(yè)。（二）農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒克隆載體的構(gòu)建取代型Ti質(zhì)粒載體的構(gòu)建當(dāng)前69頁(yè)，總共84頁(yè)。第五節(jié)動(dòng)物基因克隆載體一、SV40克隆載體二、逆轉(zhuǎn)錄病毒基因載體三、腺病毒基因載體四、豆苗病毒基因載體五、桿狀病毒表達(dá)載體當(dāng)前70頁(yè)，總共84頁(yè)。SV40克隆載體：猿猴空泡病毒405243bp當(dāng)前71頁(yè)，總共84頁(yè)。一、酵母人工染色體（YAC）的構(gòu)建第六節(jié)人工染色體載體利用酵母著絲粒載體所構(gòu)建的大片段DNA克隆?？寺≥d體上含有著絲粒、端粒、可選擇標(biāo)志基因、自主復(fù)制等序列，可攜帶插入的大片段DNA(100～1000kb)在酵母細(xì)胞中有效地復(fù)制，如同微小的人工染色體。是基因組研究的有用工具。當(dāng)前72頁(yè)，總共84頁(yè)。TEL：酵母染色體DNA端粒ARS：DNA復(fù)制起點(diǎn)CEN：著絲粒應(yīng)用：構(gòu)建人類(lèi)和高等生物的基因組文庫(kù)選擇標(biāo)記his3：組氨酸合成缺陷型基因Trp1：色氨酸合成缺陷型基因ura3：尿嘧啶合成缺陷型基因sup4：赭石突變抑制基因第二受體克隆子篩選標(biāo)記第一受體克隆子篩選標(biāo)記：抗生素當(dāng)前73頁(yè)，總共84頁(yè)。某一突變基因的表型效應(yīng)由于第二個(gè)突變基因的出現(xiàn)而恢復(fù)正常時(shí),稱后一突變基因?yàn)榍罢叩囊种苹?。回?fù)突變使突變基因的脫氧核糖核酸(DNA)分子結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常；抑制基因則并不改變突變基因的DNA分子結(jié)構(gòu),而只是使突變型的表型恢復(fù)正常。抑制基因一般用符號(hào)Su代表。無(wú)義抑制基因的種類(lèi)：琥珀型抑制基因：UAG赭石型抑制基因：UAA乳白型抑制基因：UGA、UAG當(dāng)前74頁(yè)，總共84頁(yè)。酵母人工染色體（YAC）的應(yīng)用酵母人工染色體（YAC）的局限性構(gòu)建基因組文庫(kù)存在插入子的穩(wěn)定性問(wèn)題。同一酵母細(xì)胞內(nèi)多個(gè)YAC引起交換轉(zhuǎn)化效率低。難以制備純的YAC-DNA（因結(jié)合組蛋白）。當(dāng)前75頁(yè)，總共84頁(yè)。二、細(xì)菌人工染色體載體（BAC）利用大腸桿菌F質(zhì)?；騊1噬菌體為基礎(chǔ)構(gòu)建的用于在大腸桿菌中克隆大片段DNA(100～350kb)的載體。用于基因組結(jié)構(gòu)的分析。當(dāng)前76頁(yè)，總共84頁(yè)。特點(diǎn)：

帶有外源DNA的BAC載體在細(xì)胞中是單拷貝的；

載體分子量很小(7.4kb)；

選擇標(biāo)記：氯霉素抗性基因；

多克隆位點(diǎn)。當(dāng)前77頁(yè)，總共84頁(yè)。BAC的優(yōu)點(diǎn)：BAC的優(yōu)點(diǎn)：1.BAC復(fù)制子來(lái)源于F因子：穩(wěn)定性好2.宿主為大腸桿菌3.體外操作簡(jiǎn)單4.容易構(gòu)建5.篩選方便6.克隆位點(diǎn)兩側(cè)含有T7和Sp6聚合酶啟動(dòng)子，可用于轉(zhuǎn)錄獲得RNA探針獲直接