發(fā)酵工程發(fā)酵工業(yè)菌種

發(fā)酵工程發(fā)酵工業(yè)菌種第1頁/共123頁

本章內(nèi)容一、常用發(fā)酵工業(yè)菌種二、發(fā)酵工業(yè)菌種的分離篩選三、發(fā)酵工業(yè)菌種鑒定四、發(fā)酵工業(yè)菌種改良四、發(fā)酵工業(yè)菌種保藏第2頁/共123頁第一節(jié)常用發(fā)酵工業(yè)菌種第3頁/共123頁工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)水平的高低取決于生產(chǎn)菌種、發(fā)酵工藝和后提取工藝三個因素，其中擁有良好生產(chǎn)菌種是前提，菌種質(zhì)量好壞直接影響了發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)量、質(zhì)量及其成本。例如，青霉素的發(fā)酵生產(chǎn)，在投產(chǎn)之初只有40U·mL-1，得到黃色晶體，青霉素純度很低，價比黃金；而現(xiàn)在采用新型菌種可以達到60000U·mL-1以上，得到晶體為純白色，青霉素純度高達95%以上，成本不到0.1元。青霉素發(fā)酵生產(chǎn)的這種質(zhì)的飛躍，生產(chǎn)所用菌種在其中起了關(guān)鍵作用。菌種選育有何意義？第4頁/共123頁微生物菌種是決定發(fā)酵產(chǎn)品的工業(yè)化價值以及發(fā)酵過程成敗的關(guān)鍵，只有具備良好的菌種基礎(chǔ)，才能通過改進發(fā)酵工藝和設(shè)備以獲得理想的發(fā)酵產(chǎn)品。優(yōu)良菌種都是通過菌種選育獲得的。菌種選育方法主要包括自然選育、誘變育種、雜交育種和基因工程育種。第5頁/共123頁菌種選育的意義：提供產(chǎn)量提高產(chǎn)品質(zhì)量改善加工工藝和開發(fā)新產(chǎn)品。在科學研究中，通過菌種選育還可以了解菌種的遺傳學性質(zhì)第6頁/共123頁2.1工業(yè)發(fā)酵菌種概述第7頁/共123頁第8頁/共123頁工業(yè)發(fā)酵微生物可培養(yǎng)微生物未培養(yǎng)微生物少數(shù)大多數(shù)缺乏敏感檢測技術(shù)培養(yǎng)基中營養(yǎng)過剩微生物間相互作用認識不足無法原位培養(yǎng)細菌放線菌酵母菌霉菌第9頁/共123頁細菌醋桿菌屬的醋化醋桿菌、弱氧化醋桿菌乳酸桿菌枯草桿菌丙酮丁醇梭菌大腸桿菌谷氨酸棒狀桿菌主要用于生產(chǎn)酶制劑、有機酸、氨基酸、肌苷酸等。第10頁/共123頁醋酸桿菌生產(chǎn)醋酸、山梨醇、5-酮葡糖酸和酒石酸等；乳酸菌廣泛應(yīng)用于乳酸的生產(chǎn)以及乳制品工業(yè)；產(chǎn)氨短桿菌、谷氨酸棒桿菌、黃色短桿菌等可生產(chǎn)氨基酸、核苷酸等；梭狀芽孢桿菌可生產(chǎn)丁二醇、丙酮、丁醇、乙醇、丙酮丁醇、核黃素以及一些有機酸；枯草芽孢桿菌可生產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、果膠酶、多肽類抗生素、氨基酸、維生素以及丁二醇等；假單胞菌能生產(chǎn)維生素B12、色素、丙氨酸、葡糖酸以及一些抗生素和甾體等；黃單胞菌可生產(chǎn)維生素B12；運動單胞菌可生產(chǎn)乙醇；大腸桿菌可生產(chǎn)天冬氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、纈氨酸以及谷氨酸脫羧酶、天冬酰酶等。第11頁/共123頁細菌還用作基因工程載體的宿主細胞，用于構(gòu)建基因工程菌來生產(chǎn)外源物質(zhì)，如：利用大腸桿菌生產(chǎn)核酸和蛋白質(zhì)疫苗。第12頁/共123頁放線菌鏈霉菌屬小單孢菌屬諾卡菌屬地中海諾卡氏菌米蘇里游動放線菌主要用于生產(chǎn)多種抗生素，如鏈霉素、紅霉素、金霉素、慶大霉素等。第13頁/共123頁酵母菌釀酒酵母假絲酵母屬產(chǎn)朊假絲酵母解脂假絲酵母熱帶假絲酵母畢赤酵母屬、漢遜酵母屬主要用于生產(chǎn)食用、藥用和飼料用蛋白等。第14頁/共123頁酵母細胞本身含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素以及各種酶類，工業(yè)上常通過培養(yǎng)酵母制造單細胞蛋白，以供食用或作飼料蛋白，或用來制取核糖核酸、核苷酸、核黃素、細胞色素c、輔酶A、凝血質(zhì)、轉(zhuǎn)化酶和乳糖酶等。在發(fā)酵工業(yè)上，經(jīng)常利用酵母的代謝進行啤酒、白酒、黃酒和果酒等各種飲料酒的釀造，以及生產(chǎn)乙醇、甘油、有機酸及麥角固醇等多種產(chǎn)品。第15頁/共123頁霉菌曲霉屬米曲霉黑曲霉青霉屬青霉菌：點青霉、產(chǎn)黃青霉桔青霉根霉屬德氏根霉米根霉、小麥曲根霉紅曲霉屬紫紅曲霉主要用于生產(chǎn)酶制劑、有機酸、抗生素及甾體激素等。第16頁/共123頁霉菌除了應(yīng)用于傳統(tǒng)的釀酒、制漿和其他發(fā)酵食品生產(chǎn)外，還可用于生產(chǎn)乙醇、有機酸、抗生素、酶制劑、維生素、植物生長素以及甾體轉(zhuǎn)化等。黑曲霉用于生產(chǎn)酸性蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、葡糖氧化酶、檸檬酸、葡糖酸、草酸以及抗壞血酸等；紅曲霉能發(fā)酵生產(chǎn)紅曲紅色素、紅曲黃色素、檸檬酸、琥珀酸、麥角固醇、洛伐他丁、淀粉酶、蛋白酶和酯化酶等；產(chǎn)黃青霉用于生產(chǎn)青霉素、葡糖酸、抗壞血酸以及多種酶；根霉能產(chǎn)生反丁烯二酸、乳酸、琥珀酸、芳香脂和甾族化合物等；毛霉能產(chǎn)生果膠酶、凝乳酶、甾族化合物以及應(yīng)用于傳統(tǒng)的制醬工業(yè)等。第17頁/共123頁

未培養(yǎng)微生物定義：指迄今所采用的微生物純培養(yǎng)分離及培養(yǎng)方法還未獲得純培養(yǎng)的微生物，其在自然環(huán)境微生物群落中占有非常高的比例，約為99％，主要在各種極端環(huán)境中。第18頁/共123頁研究方法1、模擬自然培養(yǎng)法：原位培養(yǎng)、培養(yǎng)條件優(yōu)化、單細胞操作。2、宏基因組分析法：測序分析未培養(yǎng)微生物的基因組，結(jié)合蛋白質(zhì)組學，了解其代謝途徑、基因表達調(diào)控機制等。第19頁/共123頁第二節(jié)發(fā)酵工業(yè)菌種的分離篩選第20頁/共123頁菌種的來源根據(jù)資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；從大自然中分離篩選新的微生物菌種。第21頁/共123頁菌株的分離和篩選是獲得目的菌株的兩個重要環(huán)節(jié)。分離：篩選：注意采用方法的選擇性和靈敏度第22頁/共123頁

菌種選擇的要求

能在廉價原料制成的培養(yǎng)基上迅速生長，且生成的目的產(chǎn)物產(chǎn)量高、易于回收；

生長速度和反應(yīng)速度較快，發(fā)酵周期較短；培養(yǎng)條件易于控制；抗噬菌體及雜菌污染的能力強；菌種不易變異退化；對放大設(shè)備的適應(yīng)性強；菌種不是病原菌，不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)和毒素。第23頁/共123頁從自然界篩選菌種第24頁/共123頁制定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性。采樣：有針對性地采集樣品。預(yù)處理：提高菌種分離的效率富集培養(yǎng)：人為地通過控制養(yǎng)分或培條件，使所需菌種增殖培養(yǎng)后，在數(shù)量上占優(yōu)勢。分離：利用分離技術(shù)得到純種。菌種的篩選：通過常規(guī)生產(chǎn)性能測定，進一步篩選產(chǎn)物合成能力較高的菌株。發(fā)酵性能測定：進行生產(chǎn)性能測定。這些特性包括形態(tài)、培養(yǎng)特征、營養(yǎng)要求、生理生化特性、發(fā)酵周期、產(chǎn)品品種和產(chǎn)量、耐受最高溫度、生長和發(fā)酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。菌種保藏新種分離與篩選的步驟第25頁/共123頁1.樣品采樣（1）采樣原則

廣泛性

充分了解目標微生物的性質(zhì)（種類、生理特征等）如根據(jù)微生物的營養(yǎng)類型：纖維素酶產(chǎn)生菌——森林土壤蛋白酶和脂肪酶產(chǎn)生菌——肉類加工廠和飯店潲水溝中的污水、污泥利用碳氫化合物為碳源的菌株——油田附近極端菌的篩選要根據(jù)其特殊的生理特征：高溫酶產(chǎn)生菌——南方、溫泉、火山爆發(fā)處及北方的肥堆耐壓菌——油井或海洋深處第26頁/共123頁（有機質(zhì)豐富、通氣保水性能好）(2)采樣對象土壤、水、空氣及枯枝落葉等，以土壤為主。從土壤中采樣要考慮土壤的以下特點：有機質(zhì)含量和通風狀況耕地、菜園山坡上的森林沙土、無植被土壤、新開墾的生土、貧瘠的土地取樣的土層深度：5-25cm——細菌、放線菌（有機質(zhì)豐富、陰暗潮濕）——霉菌、酵母菌——微生物少第27頁/共123頁1.采樣土壤的酸堿度偏堿——細菌、放線菌偏酸——霉菌、酵母菌土壤的植被狀況葡萄成熟時——根部酵母菌增多地理條件南方土壤比北方土壤微生物含量多季節(jié)條件秋季菜土樣最理想第28頁/共123頁2.樣品的預(yù)處理

（1）物理方法熱處理：根據(jù)目的菌較非目的菌的耐熱性高從而增加目的菌的比例。膜過濾法：濃縮水中的微生物細胞。離心法：同上。第29頁/共123頁第30頁/共123頁（2）化學法通過培養(yǎng)基中添加某些化學成分來增加微生物的數(shù)量。如：用添加CaCO3穩(wěn)定培養(yǎng)基的pH來分離嗜堿性的放線菌。（3）誘餌法將某些固體物質(zhì)如石蠟、花粉、蛇皮、毛發(fā)等加到分離的土壤或水中做成誘餌富集目的菌，待菌落長出后再進行分離。第31頁/共123頁3.富集培養(yǎng)富集培養(yǎng)

利用不同微生物生長繁殖對環(huán)境和營養(yǎng)的不同要求，如溫度、PH、滲透壓、溶氧濃度、碳源和氮源類型及濃度等，使目的微生物在最適宜條件下迅速繁殖，數(shù)量增加，成為人工環(huán)境下的優(yōu)勢種。第32頁/共123頁3.富集培養(yǎng)富集培養(yǎng)的策略（1）控制培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分用促進某特定微生物生長繁殖的選擇性培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件?？捎靡种破渌⑸锷L繁殖的選擇性培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件。例如碳源利用的控制，可選定糖，淀粉、纖維素，或者石油等，以其中的一種為唯一碳源，那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長，而其它微生物就可能死亡或淘汰。這樣對下階段的純種分離就會順利得多。第33頁/共123頁3.富集培養(yǎng)富集培養(yǎng)的策略（2）控制培養(yǎng)條件溶氧濃度——好氧/厭氧高溫——嗜熱微生物/非嗜熱微生物pH——嗜酸性/嗜堿性

第34頁/共123頁4.菌種分離平板劃線分離法稀釋分離法毛細管分離法小滴分離法第35頁/共123頁

劃線分離法——平板劃線法第36頁/共123頁稀釋分離法

稀釋倒平板法

平板涂布法注意：必須要做多個濃度的稀釋分離平板。第37頁/共123頁樣品充分混勻；每支移液管及涂布棒只能接觸一個稀釋度的菌液；同一稀釋度三個以上重復,取平均值；每個平板上的菌落數(shù)目合適，便于準確計數(shù)；第38頁/共123頁①初篩初篩是從分離得到的大量菌種中將合成目的產(chǎn)物的菌種篩選出來的過程。初篩可分為兩種情況進行：a.平板篩選對于在分離純化階段沒有進行平板定性法挑選出來的菌株，可以先進行平板定性篩選。在初篩時，使用平板快速檢測法，將復雜而費時的化學測定改為平板上肉眼可見的顯色或生化反應(yīng)，可以減少篩選的工作量，大幅度地提高篩選效率。第39頁/共123頁微生物選擇性分離的原理和方法在菌種的分離篩選過程中，為了提高篩選的效率，通常要根據(jù)菌種的特性，設(shè)計具有選擇性的分離篩選方案，通過控制營養(yǎng)和培養(yǎng)條件以有利于待分離菌株的生長和抑制非目的微生物的生長，或通過添加顯色劑、指示劑以方便待分離菌株的挑選。在常見選擇性分離方法中，除了控制培養(yǎng)基營養(yǎng)成分和控制培養(yǎng)條件外，還有根據(jù)目的微生物的生理特性或利用某些代謝產(chǎn)物生化反應(yīng)來設(shè)計選擇培養(yǎng)基，通過觀察微生物在選擇培養(yǎng)基上生長狀況或生化反應(yīng)進行分離的方法。這種利用平板的生化反應(yīng)進行分離的方法有以下幾種：①變色圈法;②透明圈法;③生長圈法;④抑菌圈法.第40頁/共123頁①變色圈法在底物平板上加入指示劑或顯色劑，由于目的微生物分解底物或代謝產(chǎn)物引起平板上出現(xiàn)變色圈，使所需微生物能夠被快速鑒別出來。例如，用含0.2%果膠為唯一碳源的培養(yǎng)基平板篩選果膠酶產(chǎn)生菌，菌落長成后加入0.2%剛果紅溶液染色4h，具有分解果膠能力的菌落周圍便出現(xiàn)絳紅色水解圈；用加入溴百里酚藍的平板培養(yǎng)基分離谷氨酸產(chǎn)生菌時，若平板上出現(xiàn)產(chǎn)酸菌，其菌落周圍就變成黃色，可從黃色圈中挑取菌落。第41頁/共123頁②透明圈法在平板培養(yǎng)基中加入溶解性差的底物，使培養(yǎng)基渾濁，能夠分解底物的微生物就會在菌落周圍產(chǎn)生透明圈，根據(jù)透明圈的大小可以初步判斷菌株利用底物的能力。例如，以淀粉為唯一碳源的平板培養(yǎng)基分離淀粉酶產(chǎn)生菌時，形成菌落后用碘液浸涂，產(chǎn)淀粉酶菌株周圍會出現(xiàn)透明的水解圈，據(jù)此可挑取所需菌落。第42頁/共123頁③生長圈法生長圈法所用的工具菌是一些營養(yǎng)缺陷型菌株。將待檢菌涂布于含高濃度的工具菌并缺少工具菌所需營養(yǎng)物的平板培養(yǎng)基上，進行培養(yǎng)，若某菌株能合成工具菌所需營養(yǎng)物，在該菌株的菌落周圍就會形成一個渾濁的生長圈。例如，用嘌呤缺陷型大腸桿菌作為工具菌，與不含嘌呤的培養(yǎng)基混合倒平板，在平板培養(yǎng)基上涂布含菌樣品并恒溫培養(yǎng)，周圍出現(xiàn)生長圈的菌落即為嘌呤產(chǎn)生菌。第43頁/共123頁第44頁/共123頁b.搖瓶發(fā)酵篩選平板法是固體培養(yǎng)，與液體培養(yǎng)的條件差距較大，而搖瓶振蕩培養(yǎng)法更接近發(fā)酵罐的培養(yǎng)條件，搖瓶發(fā)酵篩選得到的菌株易于推廣，因此，經(jīng)過平板定性篩選的菌株須進行搖瓶培養(yǎng)篩選。一般一個菌株接一個瓶，在一定轉(zhuǎn)速的搖瓶機上以及適宜的溫度下進行振蕩培養(yǎng)，得到的發(fā)酵液進行目的產(chǎn)物檢測或進行菌種活性測定，通過比較可以初步篩選出少量生產(chǎn)能力較高的菌株。第45頁/共123頁④抑菌圈法抑菌圈法所用的工具菌是一些抗生素的敏感菌。將待檢菌涂布于含高濃度的工具菌的平板培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，若被檢菌能分泌某些抑制工具菌生長的物質(zhì)，如抗生素等，就會在被檢菌的菌落周圍形成工具菌不能生長的抑菌圈，從而使被檢菌很容易被鑒別出來。采用抑菌圈法，不僅能篩選抗生素，還能篩選某些酶類。例如，Meevootison等提出一套利用抑菌圈篩選青霉素?；府a(chǎn)生菌的方法。工具菌是一種對6-氨基青霉烷酸敏感而對芐青霉素有抗性的黏性沙雷氏菌，這種菌只有當芐青霉素尚未被別種微生物的青霉素?；皋D(zhuǎn)化為6-氨基青霉烷酸時才能生長。將工具菌與芐青霉素混合于平板培養(yǎng)基中，然后將待檢菌涂布于平板上，進行培養(yǎng)，周圍出現(xiàn)抑菌圈的菌落就是青霉素酰化酶產(chǎn)生菌。第46頁/共123頁第47頁/共123頁②復篩對初篩出來的菌株進行復篩時，通常采用搖瓶培養(yǎng)法，一般一個菌株至少要重復3~5個瓶，培養(yǎng)后的發(fā)酵液必須采用精確分析方法測定。直接從自然界分離得到的菌株為野生型菌株，一般需經(jīng)過進一步的人工改造才能真正用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)，因此，復篩出來的菌株通常作為進一步育種工作的原始菌株或出發(fā)菌株。復篩過程中，要結(jié)合各種培養(yǎng)條件進行篩選，在不同培養(yǎng)條件下進行試驗，以便初步掌握野生型菌株適合的培養(yǎng)條件，為育種提供依據(jù)。第48頁/共123頁細菌分離：以乳酸菌為例

取未成熟的醬醪樣品1g至無菌磨口瓶中

加麥芽汁至瓶口處，封塞，25℃培養(yǎng)24-48h培養(yǎng)基中長出絹絲狀波動物，鏡檢桿狀，陽性染色初步斷定乳酸菌

用選擇性培養(yǎng)基分批富集培養(yǎng)2-3代稀釋分離法分離單菌落，培養(yǎng)基為含麥芽汁、CaCO3的瓊脂培養(yǎng)基

根據(jù)透明圈挑選菌落

性能測定（鏡檢桿狀，染色陽性；乳酸紙層析鑒定）

Rf值定性（有機酸呈黃斑點）

乳酸生成量測定（滴定法）第49頁/共123頁第50頁/共123頁放線菌的分離：

以產(chǎn)鏈霉素菌種的分離為例（從退化菌種中篩選）

取工業(yè)發(fā)酵液（含孢子）樣品1環(huán)放入帶玻璃珠的裝有10ml無菌水的小三角瓶中，搖勻

采用稀釋法制平板，獲取單菌落

斜面保藏高產(chǎn)菌恢復根據(jù)高產(chǎn)菌的特點，選擇目的菌落放大培養(yǎng)，發(fā)酵液性能測試篩選模型：形態(tài)依據(jù)第51頁/共123頁真菌的分離篩選：以啤酒酵母的分離為例

取發(fā)酵液少許以10倍稀釋成10-1-10-7

稀釋分離法取0.1ml加入固體培養(yǎng)基鋪平皿（×2）

在麥芽汁固體培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)48-72h

形態(tài)篩選根據(jù)正常株特點進行挑選，接種斜面?zhèn)溆?/p>

純化，采用平板分離法進一步純化，至少反復三次

①生成子囊孢子速度測定 ②發(fā)酵力測定性能測定③熱死溫度測定 ④凝集力測定 ⑤雙乙酰含量測定第52頁/共123頁第三節(jié)發(fā)酵工業(yè)菌種的鑒定第53頁/共123頁一、微生物分類鑒定中的經(jīng)典方法（1）獲得純培養(yǎng)物；（2）測定一系列指標（3）查權(quán)威菌種鑒定手冊第54頁/共123頁（1）形態(tài)特征：大小，排列，分化，結(jié)構(gòu)，染色等（2）培養(yǎng)特征：營養(yǎng)要求，生長的物理環(huán)境（酸堿

度，溫濕度），菌落，菌苔，液體

培養(yǎng)特征。（3）代謝特征：微生物生命活動的方式。如：I.M.Vit（4）化學組成特征：細胞主要特征性化學成分的鑒定，如：細胞壁成分、細胞內(nèi)含物（5）抗原特征：抗原成為化學組成的一個特殊方面，微

生物具有許多不同類型的抗原。（6）生態(tài)特征：與其他生物的關(guān)系、自然界的分布、致

病性等經(jīng)典的鑒定指標第55頁/共123頁第四節(jié)發(fā)酵工業(yè)菌種的改良第56頁/共123頁菌種選育改良的具體目標提高目標產(chǎn)物的產(chǎn)量

提高目標產(chǎn)物的純度，減少副產(chǎn)物改良菌種性狀，改善發(fā)酵過程

改變生物合成途徑，以獲得高產(chǎn)的新產(chǎn)品第57頁/共123頁菌種代謝生理與分子生物學育種的目的就是采取各種手段獲得代謝調(diào)節(jié)機制不完善的高產(chǎn)菌株，使之過量積累人們所需的目標產(chǎn)物。初級代謝：分解代謝體系（5-磷酸核糖、丙酮酸等）合成代謝體系（氨基酸、核苷酸、蛋白質(zhì)、核酸等）次級代謝：抗生素、生物堿、色素、毒素等。第58頁/共123頁代謝調(diào)控機制酶合成的調(diào)節(jié)：調(diào)節(jié)酶的合成量進而調(diào)節(jié)代謝速率。誘導（組成型酶—初級代謝產(chǎn)物；誘導型酶-次級代謝產(chǎn)物）阻遏：末端代謝產(chǎn)物阻遏、分解代謝產(chǎn)物阻遏酶活性的調(diào)節(jié)：通過改變酶分子活性來調(diào)節(jié)新陳代謝的速率。包括酶活性的激活和抑制。第59頁/共123頁

發(fā)酵工業(yè)菌種改良方法常規(guī)育種(誘變育種)細胞工程育種基于代謝調(diào)節(jié)的育種技術(shù)基因工程育種蛋白質(zhì)工程育種代謝工程育種

第60頁/共123頁誘變育種誘變育種的基本原理誘變育種的理論基礎(chǔ)是基因突變。所謂基因突變是指由于染色體和基因本身的變化而產(chǎn)生的遺傳性狀的變異。突變主要包括染色體畸變和基因突變兩大類。染色體畸變是指染色體或DNA片段的缺失、易位、逆位、重復等，而基因突變是指DNA分子結(jié)構(gòu)中的某一部位發(fā)生變化（又稱點突變）。根據(jù)突變發(fā)生的原因又可分為自然突變和誘發(fā)突變。所謂自然突變是指在自然條件下出現(xiàn)的基因突變，而誘發(fā)突變是指用各種物理、化學因素人工誘發(fā)的基因突變。誘變因素的種類很多，有物理的、化學的和生物的三大類。經(jīng)誘變處理后，微生物的遺傳物質(zhì)，DNA和RNA的化學結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而引起微生物的遺傳變異。由于引進了誘變劑的處理，故誘變育種使菌種發(fā)生突變的頻率和變異的幅度得到了提高，從而使篩選獲得優(yōu)良特性的變異菌株的幾率得到了提高。第61頁/共123頁（五）基因突變及其機制僅影響一對堿基影響一段染色體第62頁/共123頁出發(fā)菌株的選擇菌懸液的制備前培養(yǎng)誘變變異菌株的分離和篩選第63頁/共123頁2023/3/864

誘變處理后再經(jīng)液體培養(yǎng)和不經(jīng)培養(yǎng)的比較第64頁/共123頁誘變育種中需要考慮的因素選擇合適的出發(fā)菌株：產(chǎn)量高、對誘變劑的敏感性大、變異幅度廣。復合誘變劑的使用：NTG、紫外線等。第65頁/共123頁常用誘變劑及其類別物理誘變劑化學誘變劑生物誘變劑堿基類似物與堿基反應(yīng)的物質(zhì)在DNA分子中插入或缺失一個或幾個堿基物質(zhì)紫外線快中子X射線γ射線激光2-氨基嘌呤5-溴尿嘧啶8-氮鳥嘌呤8-AG硫酸二乙酯（DES）甲基磺酸乙酯（EMS）亞硝基胍（NTG）亞硝基甲基脲（NMU）亞硝基乙基脲（NEU）亞硝酸（NA）氮芥（NM）4-硝基喹啉1-氧化物（4NQO）乙烯亞胺（EI）羥胺吖啶類物質(zhì)ICR類物質(zhì)①噬菌體①ICR是美國腫瘤研究所（TheInstituteforCancerResearch）的縮寫，ICR化合物是該研究所合成的吖啶類的氮芥衍生物。第66頁/共123頁誘變劑劑量的選擇：以致死劑量作為選擇適宜劑量的依據(jù)。合適劑量：能擴大變異幅度又能促使

變異移向正變范圍的劑量通常采用低劑量、長時間處理。第67頁/共123頁

凡在提高誘變率的基礎(chǔ)上，既能擴大變異幅度，又能促使變異移向正變范圍的劑量，就是合適的劑量。第68頁/共123頁兩條重要的實驗曲線橫坐標縱坐標①

劑量存活率曲線誘變劑的劑量細胞存活數(shù)的對數(shù)值②劑量－誘變率曲線誘變劑的劑量誘變后獲得的突變細胞數(shù)第69頁/共123頁變異菌株的篩選：從菌落形態(tài)變異類型著手。如在灰黃霉素產(chǎn)生菌蕁麻青霉的育種中，曾發(fā)現(xiàn)菌落的棕紅色變深者往往產(chǎn)量有所提高。第70頁/共123頁新誘變因子及誘變技術(shù)進展低能離子束誘變：是利用離子注入設(shè)備產(chǎn)生離子束(40~60keV)并注入生物體引起遺傳物質(zhì)的永久改變,然后從變異菌株中選育優(yōu)良菌株的方法。第71頁/共123頁類型示例活性離子N+、C+、O+、H+、P+惰性離子Ar+、Ne+金屬離子Fe+、Zn2+第72頁/共123頁展望盡管離子誘變存在一些約束如離子種類、誘變材料和生物學效應(yīng)難以解釋，但待一些理論得到更好解決，將可利用離子束選擇性破壞一部分細胞，切斷基因、觀察損傷和修復，并通過消除染色體或染色體的某些片段達到融合的目的，可大大減少突變菌株篩選的工作量，與此同時可獲得更多表型的突變菌株，極大的豐富動植物界和提高工業(yè)產(chǎn)量。第73頁/共123頁激光輻射誘變和微波電磁輻射誘變激光輻射誘變：量子流光微粒，引起DNA和RNA改變，導致酶激活或鈍化，引起細胞分裂和細胞代謝活動改變。微波電磁輻射誘變：場力和轉(zhuǎn)化能協(xié)同作用第74頁/共123頁原生質(zhì)體誘變原生質(zhì)體對理化因素的敏感性更強。第75頁/共123頁篩選方法平皿快速檢測法形態(tài)變異的利用高通量篩選第76頁/共123頁

平皿快速檢測法A、紙片培養(yǎng)顯色法:浸有指示劑濾紙B、變色圈法:直接用顯色劑或指示劑C、透明圈法:混濁底物被分解后形成透明圈。如可溶性淀粉、碳酸鈣等。D、生長圈法:利用某些具有特殊營養(yǎng)要求的微生物作為工具菌E、抑制圈法第77頁/共123頁在瓊脂平板上，通過觀察測定某突變菌落周圍蛋白酶水解圈的大小、淀粉酶變色圈（用碘液使淀粉顯色）的大小，氨基酸顯色圈（將菌落用打孔機取下，轉(zhuǎn)移到濾紙上，再用茚三酮試劑顯色）的大小，檸檬酸變色圈（可在厚濾紙上培養(yǎng)，用溴甲酚綠作指示劑）的大小，抗生素抑制圈的大小，指示菌生長圈的大小（測定生長因子產(chǎn)生），纖維素酶對纖維素水解圈（用剛果紅染色）的大小，外毒素的沉淀反應(yīng)圈的大小等，均可為初篩工作中估計某突變株代謝產(chǎn)物量的“形態(tài)”指標。第78頁/共123頁細胞工程育種-雜交育種和原生質(zhì)體融合雜交育種的遺傳標記（營養(yǎng)缺陷型標記、抗性標記、溫度敏感性標記、其它性狀標記）細菌的雜交育種：接合、轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)化供體菌（“雄性”）通過性菌毛與受體菌（“雌性”）直接接觸，把F質(zhì)?；蚱鋽y帶的不同長度的核基因組片段傳遞給后者，使后者獲得若干新遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為接合。通過接合而獲得新遺傳性狀的受體細胞，就是接合子（conjugant）。第79頁/共123頁放線菌的雜交育種：在原理上類似大腸桿菌。方法上類似霉菌。圖2-6.必須是感受態(tài)。第80頁/共123頁霉菌的雜交育種：有性生殖、準性生殖

準性生殖是一種類似于有性生殖，但比它更為原始的一種兩性生殖方式，這是一種在同種而不同菌株的體細胞間發(fā)生融合，它可不借減數(shù)分裂而導致低頻率基因重組并產(chǎn)生重組子。第81頁/共123頁準性雜交的步驟1）菌絲聯(lián)結(jié)（amastomosis)：發(fā)生在形狀相同而遺傳型有異的同一菌種兩個不同菌株間。頻率極低。2）形成異核體(heterocaryon)：體細胞聯(lián)結(jié)，原有的單倍體核形成了雙相異核體。第82頁/共123頁3）核融合(nuclearfusion)：異核體中的雙核偶爾可以發(fā)生核融合，產(chǎn)生雙倍體雜合子核。4）體細胞交換(somaticcrossing-over)和單倍體化：體細胞交換即體細胞中染色體間的交換。第83頁/共123頁第84頁/共123頁原生質(zhì)體融合

使遺傳性狀不同的兩細胞的原生質(zhì)體發(fā)生融合，并發(fā)生遺傳重組以產(chǎn)生融合子（fusant）的過程。已成功地應(yīng)用與植物細胞、真菌細胞、屬間、科間的遠緣細胞融合，融合產(chǎn)物含兩親代細胞基因組。第85頁/共123頁選擇兩個有特殊價值的并帶有選擇性遺傳標記的細胞作為親本脫壁酶細菌或放線菌可用溶菌酶或青霉素處理，真菌可用蝸牛酶或其他相應(yīng)的脫壁酶等離心聚集在高滲溶液中稀釋加入促融合劑或電脈沖各種選擇性培養(yǎng)基原生質(zhì)體融合的主要步驟是：第86頁/共123頁基于代謝調(diào)節(jié)的育種技術(shù)代謝工程育種（第三代基因工程）：通過特定突變型的選育，達到改變代謝通路，降低支路代謝終產(chǎn)物的生產(chǎn)或切斷支路代謝途徑及提高細胞膜透性，使代謝流向目標產(chǎn)物積累的方向發(fā)展。第87頁/共123頁1、組成型突變的育種：操縱子或調(diào)節(jié)基因突變引起酶合成誘導機制失靈，菌株不經(jīng)誘導也能合成酶，或不受終產(chǎn)物阻遏的調(diào)節(jié)突變型。限量誘導物恒化培養(yǎng)：誘變后接到低濃度的誘導物的恒化器中連續(xù)培養(yǎng)。循環(huán)培養(yǎng)：在含誘導物和不含誘導物的培養(yǎng)基上交替培養(yǎng)。第88頁/共123頁2、抗分解調(diào)節(jié)突變株的選育：抗分解阻遏和抗分解抑制的突變。解除碳源調(diào)節(jié)突變株的選育：葡萄糖解除氮源分解調(diào)節(jié)突變株的選育：銨鹽和其他快速利用的氮源。3、營養(yǎng)缺陷型在代謝調(diào)節(jié)育種中的應(yīng)用：使發(fā)生障礙前一步的中間代謝產(chǎn)物積累。4、抗反饋調(diào)節(jié)突變株的選育：解除合成代謝反饋調(diào)節(jié)機制，終產(chǎn)物不斷積累?？狗答佂蛔冃秃涂棺瓒敉蛔冃汀５?9頁/共123頁應(yīng)用營養(yǎng)缺陷型菌株解除正常的反饋調(diào)節(jié)

天冬氨酸天冬氨酸磷酸天冬氨酸半醛高絲氨酸

蘇氨酸

甲硫氨酸

C.glutamicum的代謝調(diào)節(jié)與賴氨酸生產(chǎn)賴氨酸為反饋抑制為阻遏AKHSDH第90頁/共123頁細胞膜透性突變株的選育營養(yǎng)缺陷型突變株的選育可改變細胞膜通透性溫度敏感突變株的選育溶菌酶敏感突變株的選育第91頁/共123頁基因工程育種體外重組DNA技術(shù)或稱基因工程、遺傳工程，是以分子遺傳學的理論為基礎(chǔ)，綜合分子生物學和微生物遺傳學的最新技術(shù)而發(fā)展起來的一門新興技術(shù)。它是現(xiàn)代生物技術(shù)的一個重要組成方面，在工業(yè)微生物學上提供了巨大的創(chuàng)造具有工業(yè)應(yīng)用價值的生產(chǎn)菌株的潛力。第92頁/共123頁1、基因工程的基本步驟目的基因的分離載體的選擇與制備目的基因與載體連接成重組DNA引入宿主細胞重組體的選擇和鑒定外源基因的表達第93頁/共123頁第94頁/共123頁原核表達系統(tǒng)常用：大腸桿菌（E.coli），枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、鏈霉菌等真核表達系統(tǒng)常用：釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae），巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris）第95頁/共123頁蛋白質(zhì)育種工程尋找新的物種，再從中分離篩選新蛋白或者對天然功能蛋白進行改造體外蛋白質(zhì)改造已經(jīng)成為獲得新功能蛋白質(zhì)的方法。蛋白質(zhì)工程分為理性設(shè)計（定點改造、定向改造）和非理性的體外定向進化（隨機化突變、定向篩選）第96頁/共123頁定點突變技術(shù)定點突變技術(shù)是基于蛋白質(zhì)工程的理論，以蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的計算機預(yù)測為基礎(chǔ)，設(shè)計新蛋白質(zhì)的氨基酸序列，應(yīng)用重組DNA技術(shù)設(shè)計并構(gòu)建具有新性質(zhì)的蛋白質(zhì)或酶的過程。改變蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)普遍用于菌種改良第97頁/共123頁定向進化技術(shù)體外模擬自然進化過程，使基因發(fā)生大量變異并定向選擇出所需性質(zhì)和功能的蛋白質(zhì)。特點：依賴基因隨機突變，建立突變體文庫方法：易錯PCR；DNA隨機重組（圖2-8）第98頁/共123頁代謝工程的定義利用多基因重組技術(shù)有目的地對細胞代謝途徑進行修飾、改造，改變細胞特性，并與細胞基因調(diào)控、代謝調(diào)控及生化工程相結(jié)合，為實現(xiàn)構(gòu)建新的代謝途徑，生產(chǎn)特定目的產(chǎn)物而發(fā)展起來的一個新的學科領(lǐng)域。又稱作途徑工程，是多基因的基因工程。第99頁/共123頁代謝工程育種思路1.改變代謝流：改變分支代謝途徑的流向，阻斷有害代謝產(chǎn)物的合成。（1）加速限速反應(yīng)（2）改變分支代謝途徑流向：提高代謝分支點的某一分支代謝途徑酶系的活力，在與另外的分支代謝途徑的競爭中占有優(yōu)勢，可以提高目的代謝末端產(chǎn)物的產(chǎn)量。（3）構(gòu)建代謝旁路（4）改變能量代謝途徑第100頁/共123頁2.擴展代謝途徑

（1）在引入外源基因后，使原來的代謝途徑向后延伸，產(chǎn)生新的末端代謝產(chǎn)物。（2）使原來的代謝途徑向前延伸，可以利用新的原料生物合成代謝末端產(chǎn)物。

第101頁/共123頁

3.轉(zhuǎn)移或構(gòu)建新的代謝途徑

1)轉(zhuǎn)移代謝途徑:為生產(chǎn)某一新的化學結(jié)構(gòu)的代謝產(chǎn)物，將催化某一代謝途徑的基因組克隆到另一不具備該種能力的微生物中，達到代謝途徑轉(zhuǎn)移的目的，使之具備生產(chǎn)該種新化合物的能力。

2)構(gòu)建新的代謝途徑:利用基因工程手段，通過克隆少數(shù)基因?qū)⒃瓉砑毎袩o關(guān)的兩條代謝途徑橋連在一起，形成新的代謝途徑。第102頁/共123頁組合生物合成育種通過合成化合物庫進行高效率的篩選。一次性同步合成成千上萬結(jié)構(gòu)不同的分子即組合庫，然后進行生物活性測定和化合物結(jié)構(gòu)鑒定。（圖2-9）第103頁/共123頁反向生物工程育種反向代謝工程針對限制生物活性的主要因素，在相關(guān)生物種類識別希望的表型，確定該表型的決定基因，通過重組DNA技術(shù)將該基因在需改造的生物中克隆表達出來。策略：圖2-10關(guān)鍵：確定希望表型的遺傳基礎(chǔ)。第104頁/共123頁第四節(jié)發(fā)酵工業(yè)菌種保藏第105頁/共123頁工業(yè)生產(chǎn)菌種的退化現(xiàn)象及原因菌種退化（degeneration）主要指生產(chǎn)菌種或選育過程中篩選出來的優(yōu)良菌株，由于連續(xù)傳代或保藏之后，群體中某些生理和形態(tài)特征逐漸退化或完全喪失（包括菌株產(chǎn)孢子能力、發(fā)酵主產(chǎn)物產(chǎn)量下降）的現(xiàn)象。第106頁/共123頁1、退化的表現(xiàn)菌落和細胞形態(tài)的改變：如蘇云金芽孢桿菌的芽孢和伴孢晶體變得小而少；生長速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越少：如細黃鏈霉菌的菌苔變薄、生長緩慢，不再產(chǎn)生典型而豐富的橘紅色分生孢子層；第107頁/共123頁抗不良環(huán)境條件（抗噬菌體、抗低溫等）能力的減弱。代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力下降：如藤倉赤霉產(chǎn)赤霉素能力下降；第108頁/共123頁2、退化的原因

1）基因突變那些控制生產(chǎn)性狀的基因發(fā)生負突變。

2）連續(xù)傳代第109頁/共123頁3、菌種退化的防治

1）從菌種選育方面考慮在育種過程中，應(yīng)盡可能使用孢子或單核菌株，避免對多核細胞進行處理；在使單鏈突變的同時，使另一條單鏈喪失模板作用，以減少出現(xiàn)分離回復現(xiàn)象；誘變處理后應(yīng)進行充分的后培養(yǎng)及分離純化，以保證菌株的“純度”。

第110頁/共123頁2）控制傳代次數(shù)如產(chǎn)腺苷的芽孢桿菌黃嘌呤營養(yǎng)缺陷型菌株，回復子的比例隨傳代次數(shù)的增加而增加，腺苷產(chǎn)量也隨之下降。

3）創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件在進行棲土曲霉培養(yǎng)時，溫度從28-