分子生物學(xué)與醫(yī)學(xué)診斷

分子生物學(xué)與醫(yī)學(xué)診斷第1頁/共47頁分子診斷學(xué)的發(fā)展分子診斷學(xué)以分子生物學(xué)理論為基礎(chǔ)，利用分子生物學(xué)的技術(shù)和方法研究人體內(nèi)源性或外源性生物大分子和大分子體系的存在、結(jié)構(gòu)或表達(dá)調(diào)控的變化，為疾病的預(yù)防、預(yù)測、診斷、治療和轉(zhuǎn)歸提供信息和決策依據(jù)。第2頁/共47頁分子生物學(xué)與醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)歷史回顧常規(guī)技術(shù)邊緣技術(shù)未來發(fā)展第3頁/共47頁歷史回顧第4頁/共47頁Kan等用液相DNA分子雜交技術(shù)成功的進(jìn)行鐮形細(xì)胞貧血癥的基因診斷

——

檢驗(yàn)診斷進(jìn)入基因診斷時(shí)代分子診斷學(xué)的發(fā)展第5頁/共47頁分子診斷學(xué)的發(fā)展PolymeraseChainReaction(PCR)

技術(shù)發(fā)表1990s

人類基因組計(jì)劃（HGP）啟動1999

ThejournalofMolecularDiagnostics

出版第6頁/共47頁分子診斷學(xué)的發(fā)展三大階段：DNA分子雜交技術(shù)——遺傳病的基因診斷PCR技術(shù)——病原體檢測及多基因遺傳病組學(xué)技術(shù)（TheAgeof“Omics”）——高通量密集型檢測技術(shù)第7頁/共47頁常規(guī)技術(shù)第8頁/共47頁常規(guī)技術(shù)細(xì)胞水平分子水平組學(xué)技術(shù)DNA免疫印跡ProteinELISAPCR測序流氏細(xì)胞儀各類Microarray第9頁/共47頁常規(guī)技術(shù)基因結(jié)構(gòu)異?；虮磉_(dá)異常蛋白質(zhì)m-RNADNA核酸分子雜交PCRDNA測序逆轉(zhuǎn)錄PCRReal-timePCRNothern-blotWestern-blot蛋白質(zhì)組織化學(xué)染色ELISA第10頁/共47頁分子雜交類型第11頁/共47頁分子雜交技術(shù)DNAofvarioussizesElectrophoreseonagarosegelgelDenature-transfertofilterpaperblot第12頁/共47頁分子雜交技術(shù)Hybridizetoprobe

Visualize第13頁/共47頁分子雜交技術(shù)細(xì)胞遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷病原體診斷第14頁/共47頁P(yáng)CR第15頁/共47頁P(yáng)CR高靈敏度高特異性快速優(yōu)勢第16頁/共47頁P(yáng)CR第17頁/共47頁P(yáng)CRPCR法檢測乙肝的優(yōu)勢表現(xiàn)在：①早期診斷，因?yàn)镻CR擴(kuò)增極其敏感，在感染潛伏期即可被PCR法檢出。②對低持續(xù)感染乙肝病人的診斷，有些乙肝病人體內(nèi)的病毒長期低復(fù)制感染，血清病毒濃度極低，一般酶標(biāo)試劑無法檢出，可以用PCR法檢出。③療效跟蹤及病程判斷，因?yàn)镻CR能半定量檢測乙肝病毒基因，是病毒是否存在及其數(shù)量多少的最直接指標(biāo)。在治療過程中通過監(jiān)測血清或白細(xì)胞中病毒基因存在與否及其動態(tài)變化即能準(zhǔn)確地了解病情。

第18頁/共47頁Western-blot

原理:在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體，然后用這種多肽的特異抗體來檢測第19頁/共47頁Western-blot蛋白樣品的制備SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色流程第20頁/共47頁新興技術(shù)第21頁/共47頁新興技術(shù)脈沖場凝膠電泳技術(shù)流式細(xì)胞儀的新應(yīng)用第22頁/共47頁脈沖場凝膠電泳（PFGE）原理:

這種電泳是在兩個(gè)不同方向的電場周期性交替進(jìn)行的，DNA分子在交替變換方向的電場中作出反應(yīng)所需的時(shí)間顯著地依賴于分子大小，DNA越大，這種構(gòu)象改變需要的時(shí)間越長，重新定向的時(shí)間也越長，于是在每個(gè)脈沖時(shí)間內(nèi)可用于新方向泳動的時(shí)間越少，因而在凝膠中移動越慢。反之，較小的DNA移動較快，于是不同大小的分子被成功分離。第23頁/共47頁脈沖場凝膠電泳（PFGE）ThesizeofDNAis30~50kbThesizeofDNAlargerthan50kb第24頁/共47頁脈沖場凝膠電泳（PFGE）HowweseparatedthelargerDNAfragments,suchaschromosome?第25頁/共47頁脈沖場凝膠電泳（PFGE）原理:

細(xì)菌包埋于瓊脂塊中,用適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶在原位對整個(gè)細(xì)菌染色體進(jìn)行酶切,酶切片段在特定的電泳系統(tǒng)中通過電場方向不斷交替變換及合適的脈沖時(shí)間等條件下而得到良好的分離。第26頁/共47頁流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀(flowcytometer，F(xiàn)CM)是進(jìn)行流式細(xì)胞分析的儀器，它集電子技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)、激光技術(shù)、流體理論、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)及單克隆抗體技術(shù)于一體，被譽(yù)為實(shí)驗(yàn)室的“CT”。

第27頁/共47頁流式細(xì)胞儀第28頁/共47頁流式細(xì)胞儀Microbead第29頁/共47頁流式細(xì)胞儀Aschematicillustrationofusingfluorescentlymicrobeads

第30頁/共47頁流式細(xì)胞儀應(yīng)用細(xì)胞因子的聯(lián)合檢測感染性疾病的聯(lián)合診斷研究RNA與蛋白質(zhì)之間的相互作用第31頁/共47頁臨床應(yīng)用第32頁/共47頁遺傳性疾病的診斷Sickle-cellanemia（鐮狀細(xì)胞性貧血）

CysticFibrosis（囊性纖維化）Alpha-1-AntitrypsinDeficiency（α-1-抗胰蛋白酶缺乏癥）第33頁/共47頁Sicklecellanemia-background第34頁/共47頁Sicklecellanemia第35頁/共47頁SicklecellanemiaDNAHybridization1Normal(AA)2Abnormal(AS)3Abnormal(SS)第36頁/共47頁感染性疾病的診斷和檢測萊姆病第37頁/共47頁感染性疾病的診斷和檢測伯氏螺旋體PCR法檢測第38頁/共47頁感染性疾病的診斷和檢測厭氧菌、苛氧菌及不能人工培養(yǎng)的病原體的鑒定治療檢測耐藥基因的檢測第39頁/共47頁疾病的預(yù)測實(shí)驗(yàn)表明：氨基糖苷類藥物誘發(fā)非綜合征耳聾的分子基礎(chǔ)為線粒體DNA中12SrRNA基因A1555G突變和C1494T突變。第40頁/共47頁疾病的預(yù)測P53基因突變使細(xì)胞增值加速，若同時(shí)其等位基因丟失則增值更為加速一部分人直接由息肉轉(zhuǎn)變成癌C-myc的過量表達(dá)K-ras的突變癌基因激活抗癌基因丟失遺傳型FAP突變FAP丟失DCC基因丟失P53基因丟失轉(zhuǎn)移大腸癌腺癌或息肉正常腸上皮細(xì)胞人大腸癌癌變的分子機(jī)理檢測ras方法PCR-ASOPCR-SSCPDNA測序列檢測P53方法PCR第41頁/共47頁小結(jié)第42頁/共47頁檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展方向（1）分子診斷的內(nèi)容從傳統(tǒng)的DNA診斷發(fā)展到核酸及其表達(dá)產(chǎn)物（mRNA、蛋白質(zhì)）的全面診斷；（2）分子診斷的策略從利用分子雜交、PCR等單一技術(shù)的診斷發(fā)展到有機(jī)組合多項(xiàng)技術(shù)的聯(lián)合診斷；（3）分子診斷的方法從定性診斷發(fā)展到半定量和定量診斷，核酸標(biāo)記技術(shù)，特別是熒光標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，熒光定量PCR技術(shù)等方法日益成熟；第43頁/共47頁檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的發(fā)展方向（4）分子診斷的范圍從單基因疾?。系聽栠z傳性疾病，諸如白血病、早老癥、血紅蛋白病、甲型肝炎病毒，人類免疫缺陷病毒，人乳頭瘤病毒等）的診斷發(fā)展到多基因?。[瘤、心腦血管疾病、代謝病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病等）的診斷。（5）分子診斷的應(yīng)用多治療