《煙草品種鑒定技術(shù)規(guī)程 SNP標(biāo)記法》技術(shù)報告

《煙草品種鑒定技術(shù)規(guī)程SNP標(biāo)記法》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)報告項目組2023年2月

目錄1概述 概述煙草（NicotianaTabacum）是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，在我國國民經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)中占有重要地位。我國迄今為止育成（通過審定）的烤煙品種有180多個，現(xiàn)存的各類煙草種質(zhì)資源5000余份，數(shù)量居世界之最。但是在煙草品種和種質(zhì)資源的鑒定和應(yīng)用等方面與主要糧食作物相比還存在很大差距，尤其是DNA身份鑒定領(lǐng)域缺乏相應(yīng)的檢測標(biāo)準(zhǔn)。2015年，制訂了《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南煙草》（NY/T2746-2015），建立了基于品種特異性、一致性和穩(wěn)定性（DUS）的形態(tài)學(xué)評價鑒定體系。雖然形態(tài)學(xué)鑒定法簡單、直觀，但是該方法存在田間種植規(guī)模大、鑒別項目多（鑒別性狀涉及株高、葉數(shù)、節(jié)距、葉長、葉寬、莖葉角度等）、周期長（跨越煙草不同生育期）、鑒別難度大（性狀指標(biāo)差異?。⑼恍誀钅甓乳g存在差異（受環(huán)境影響）等不足，同時鑒定結(jié)果還具有一定的主觀性。此外，由于親本的集中利用和定向人工選擇造成我國煙草品種遺傳背景狹窄[1]，形態(tài)學(xué)鑒定難以區(qū)分微小的遺傳變異。作物品種差異，本質(zhì)上是品種的基因型差異決定的。DNA分子標(biāo)記指紋圖譜鑒定法通過直接分析品種DNA水平上的差異來進(jìn)行品種鑒定，能夠?qū)煵萜贩N的鑒定由傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定提升到DNA分子鑒定水平。DNA分子標(biāo)記指紋圖譜鑒定法通過直接分析品種DNA水平上的差異來進(jìn)行品種鑒定，與形態(tài)學(xué)鑒定相比，具有多位點性、高多態(tài)性、簡單而穩(wěn)定的遺傳特性，表現(xiàn)出極大的實用價值。研究人員先后嘗試?yán)肦APD(RandomAmplifiedPolymorphicDNA)[2]、SSR(SimpleSequenceRepeats)[3-5]和ISSR(Inter．simpleSequenceRepeats)[6]等分子標(biāo)記進(jìn)行煙草DNA指紋圖譜構(gòu)建。由于煙草基因組自身的復(fù)雜性和低遺傳多樣性的特點，加之這些標(biāo)記技術(shù)存在的局限性如標(biāo)記數(shù)量少、檢測通量低、精確性低、自動化程度低、標(biāo)記開發(fā)難度大等，限制了其進(jìn)一步的發(fā)展與應(yīng)用[7]。SNP(singlenucleotidepolymorphisms)是指在基因組上由單個核苷酸變異所引起的DNA序列多態(tài)性[8]。栽培煙草基因組大小約為4.5G，其中含有大量的重復(fù)序列，并且品種間遺傳多樣性低[7,9]。作為第三代分子標(biāo)記，SNP相較之前的標(biāo)記具有以下優(yōu)勢：1）精確性高，區(qū)分的差異是單個堿基的差異，數(shù)據(jù)重復(fù)率高；2）高通量，可以同時對成百上千的位點進(jìn)行檢測；3）覆蓋廣，SNP在基因組中廣泛分布，極易篩選到分布于各染色體上的標(biāo)記；4）自動化程度高，檢測流程高度集成化、標(biāo)準(zhǔn)化，節(jié)約了人力物力，減少了人為讀帶誤差導(dǎo)致的干擾[10]。目前，國際植物新品種保護(hù)聯(lián)盟（UPOV）、國際種子檢驗協(xié)會（ISTA）、國際種子聯(lián)盟（ISF）等國際組織均將SNP標(biāo)記作為品種身份鑒定和數(shù)據(jù)庫構(gòu)建的優(yōu)選標(biāo)記。2015年農(nóng)業(yè)部出臺了《農(nóng)作物品種DNA身份鑒定體系構(gòu)建實施方案》，同樣提出以SNP技術(shù)和現(xiàn)代信息技術(shù)為手段，構(gòu)建全國統(tǒng)一的農(nóng)作物品種DNA信息數(shù)據(jù)庫及品種身份查詢平臺。SNP芯片(singlenucleotidepolymorphismarray)是將數(shù)百萬DNA標(biāo)記序列有規(guī)律地排列在玻片或特殊硅片上，固定形成SNP探針陣列。它的工作原理是通過固定在芯片上的SNP標(biāo)記序列與目標(biāo)基因組發(fā)生堿基配對反應(yīng)，從而精準(zhǔn)鑒定基因信息。與計算機(jī)芯片高度微型技術(shù)集成特點相似，基因芯片運用先進(jìn)的微生化反應(yīng)技術(shù)、顯微標(biāo)記技術(shù)、微米級掃描分辨成像技術(shù)和生物信息計算機(jī)處理技術(shù)，準(zhǔn)確鑒定檢測生物個體中特定的DNA序列[11]。SNP芯片通過芯片上的SNP探針檢測生物個體中大量的SNP變異位點，從而可以推測基因組的基因型和關(guān)鍵的遺傳變異。目前，已有超過25種作物和多年生樹木開發(fā)了超過50種SNP芯片[12]?？的螤柎髮W(xué)利用AffymetrixGeneChipRice44KSNP芯片針對413份水稻品種進(jìn)行基因分型和鑒定[13]。北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心利用3072個SNP標(biāo)記成功研發(fā)了maizeSNP3072芯片，可以有效應(yīng)用于玉米品種指紋圖譜鑒定[14]。中國種子集團(tuán)有限公司聯(lián)合北京大學(xué)、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)與美國Illumina公司利用第二代SNP芯片技術(shù)率先成功研制出水稻全基因組育種芯片系列Rice6K、Rice60K等[11]。Rice6K在粳稻之間、秈稻之間、秈稻和粳稻之間任意兩個品種能夠檢測到的多態(tài)性SNP位點平均分別約為800、1000和2600個[15]。Rice60K芯片對粳稻之間、秈稻之間、秈稻和粳稻之間任意兩個品種能夠檢測到的多態(tài)性SNP位點平均分別約為8000、1.2萬和2.3萬個[16]。依托煙草基因組計劃重大專項，國家煙草基因研究中心成功研制了世界上首款四倍體煙草基因分型基因芯片（Tobacco430kSNParray）。該芯片覆蓋了432362個煙草SNP位點，涵蓋絕大多數(shù)標(biāo)簽SNP位點并均勻分布整個煙草基因組[9]。綜上所述，建立基于高通量SNP標(biāo)記技術(shù)的煙草品種鑒定方法，可以進(jìn)一步提高我國煙草品種鑒定技術(shù)的規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化水平，填補該方面研究的空白，有效提升我國煙草的品種創(chuàng)新和管理水平。2標(biāo)準(zhǔn)適用范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了利用單核昔酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)標(biāo)記進(jìn)行煙草(NicotianatabacumL.)品種鑒定的操作程序、數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計、判定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于煙草品種的SNP指紋數(shù)據(jù)采集及品種鑒定。3方法原理不同煙草品種的基因組DNA存在核苷酸序列差異，其中單個核苷酸(A、C、G、T)的替換引起的這種多態(tài)性差異稱之為SNP。SNP具有分布密度高、通量高、數(shù)據(jù)整合易等特點，不同品種的SNP位點的基因型可通過擴(kuò)增及芯片掃描等技術(shù)進(jìn)行檢測，從而能夠區(qū)分不同品種。4材料與方法4.1儀器與設(shè)備樣品粉碎儀或研磨機(jī)，恒溫孵育器或水浴鍋，渦旋振蕩器，PCR擴(kuò)增儀，離心機(jī)，電泳儀，凝膠成像儀，核酸濃度測定儀，雜交爐，SNP芯片分型儀。4.2試劑和材料259份不同煙草品種和種質(zhì)SNP芯片分型數(shù)據(jù)由國家煙草基因研究中心保存提供。不同煙草品種驗證材料，由中國煙草總公司鄭州煙草研究院、貴州省煙草科學(xué)研究院、云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所提供。DNA提取試劑盒，SNP芯片試劑盒。4.3實驗方法利用AxiomTobacco430KSNPArray（Affymetrix）對不同煙草樣品進(jìn)行全基因組掃描，依托GeneTitan芯片平臺（Affymetrix）進(jìn)行樣本DNA的SNP分型。參照GeneTitanMCInstrumentManual進(jìn)行如下操作：1)基因組DNA變性取20μL稀釋后的煙草樣品基因組DNA（2.5ng/μL）加入96孔板中。分別加入Axiom2.0DenatSoln10X2μL、AxiomWater18μL，渦旋10min。孵育完成后，加入Axiom2.0NeutralSoln130μL進(jìn)行中和反應(yīng)，并渦旋混勻。2) 基因組DNA擴(kuò)增向變性基因組DNA中分別緩慢加入Axiom2.0AmpSoln225μL、Axiom2.0AmpEnzyme5μL，渦旋混勻，1000rpm離心1min。置于37℃雜交爐中進(jìn)行全基因組擴(kuò)增，反應(yīng)24h。3) DNA片段化將96孔板放入65℃雜交爐，孵育20min終止擴(kuò)增反應(yīng)。再從65℃雜交爐迅速轉(zhuǎn)入37℃雜交爐，孵育45min。孵育完成后，取出96孔板，將樣品放置在37℃金屬保溫槽中。分別加入Axiom10XFragBuffer45.7μL、AxiomFragDiluent10.3μL、AxiomFragEnzyme1.0μL。渦旋混勻后，放入37℃雜交爐，孵育30min進(jìn)行片段化反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，立即向反應(yīng)樣品中加入StopSolution19μL終止反應(yīng)。4) DNA沉淀分別向反應(yīng)樣品中加入AxiomPrecipSoln1238μL、AxiomPrecipSoln22μL后，渦旋混勻。再加入600μL異丙醇，使用槍頭在液面下吹打混勻。封膜后放入-20℃冰箱，過夜沉淀。5) DNA干燥和重懸將過夜沉淀的樣品4℃3200g離心40min。離心完成后，倒掉上清液體。將96孔板倒扣后用無塵吸水紙上5min，去除多余水分。正向放置在37℃雜交爐中20min進(jìn)行干燥。向干燥后的反應(yīng)樣品中加入35μLAxiomResuspBuffer，水平振蕩，900rpm10min。待DNA沉淀完全溶解后，將重懸好的樣品轉(zhuǎn)入96孔PCR板中。6) 雜交打開GeneTitanMCInstrument預(yù)熱，在室溫下平衡芯片25min，注冊樣品文件。向重懸好的樣品中加入AxiomHybBuffer70.5μL、AxiomHybSoln10.5μL、AxiomHybSoln29μL，渦旋混勻。95℃10min，48℃3min進(jìn)行變性。取出后立即放入預(yù)熱到48℃的金屬保溫板中。標(biāo)記HybTray，吸取105μL變性好的雜交液到HybTray中，將ArrayPlate和HybTray放入GeneTitanMCInstrument，雜交24h。7) 連接、洗滌、染色和掃描分別配置染色液Stain1MasterMix和Stain2MasterMix，固定液StabilizationMasterMix，以及連接液LigationMasterMix。將配好的染色液分別加入對應(yīng)的StainTray中，每孔加入105μL。向ScanTray中加入150μLHoldBuffer。運行GeneTitanMCInstrument，機(jī)器自動完成連接、染色、洗滌和掃描工作。每一個SNP通過芯片表面所發(fā)生的雙色連接反應(yīng)進(jìn)行鑒別連接。雜交過程完成后進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)性洗滌以去除非特異性結(jié)合。連接反應(yīng)完成后，芯片在GeneTitan多通道自動化芯片工作站上完成染色洗滌等步驟，最后進(jìn)行掃描并輸出結(jié)果。5結(jié)果與討論5.1SNP標(biāo)記篩選依托基因組計劃重大專項，基于AffymetrixGeneTitan芯片平臺（圖1），國家煙草基因中心先后積累了259份不同煙草品種和種質(zhì)資源的430K煙草高密度SNP芯片分型數(shù)據(jù)。圖1AffymetrixGeneTitan芯片平臺A:GeneTitan設(shè)備及煙草430K高密度SNP芯片；B:GeneTitan工作流程1）參照Axiom分型結(jié)果，挑選多態(tài)性好、分型明晰數(shù)據(jù)類型，篩選獲得了203430個高置信的PolyHighResolution類型SNP位點（圖2，表1），結(jié)合參考基因組（紅大v1.2）的位置信息，明確其中123147個位于染色體上，71283個位于scaffold上。圖2Axiom分型檢測結(jié)果類型表1不同煙草SNP分型檢測數(shù)據(jù)統(tǒng)計ConversionTypeCountPercentage(%)PolyHighResolution20343047.051MonoHighResolution12435828.762NoMinorHom5357412.391Other300696.955CallRateBelowThreshold111572.58OTV97742.2612）為了盡可能提高篩選SNP標(biāo)記的檢出效率（callrate），去除掉在任一樣本中存在缺失（nocall）的標(biāo)記，保留染色體上所有樣本均能正常檢出的90375個SNP。3）為了挑選煙草基因組上單倍型區(qū)域具有代表性的標(biāo)記位點，利用生物信息學(xué)軟件（Haploview）對所獲得的染色體上的SNP標(biāo)記根據(jù)連鎖不平衡篩選具有標(biāo)記性的SNP（tagSNP），得到15980個SNP標(biāo)記；4）為了挑選多態(tài)性更高、適用范圍更廣的標(biāo)記，針對tagSNP按照最小等位基因型頻率（MAF）>0.3和雜合率（heterozygosity）<0.1進(jìn)一步篩選獲得3727個SNP標(biāo)記；5）根據(jù)不同材料間的LD值（~1.5Mb）和SNP標(biāo)記的染色體分布特點，以1.5Mb為相對滑動區(qū)間窗口，最終篩選了2048個SNP標(biāo)記，均勻分布于煙草24條染色體上（圖3），標(biāo)記具體位置信息、基因型以及側(cè)翼序列信息詳見附錄A。圖3推薦SNP標(biāo)記在染色體上分布5.2樣品選擇考慮到在正常體細(xì)胞組織中，父母本等位基因型拷貝數(shù)多為1:1，均容易被檢出。而種子胚乳中父母本等位基因型拷貝數(shù)不均衡，可能出現(xiàn)母本等位基因型丟失。為了避免這一問題，樣品類型宜選用煙草葉、莖、根等以體細(xì)胞倍性為主的樣品。結(jié)合幼嫩且新鮮的葉片組織提取的DNA量大且不容易降解，因此應(yīng)該優(yōu)先考慮此類。項目組分別利用田間采集的煙草葉片、根、莖樣品以及種子培養(yǎng)皿萌發(fā)后采集的子葉樣品利用DNA提取試劑盒進(jìn)行樣品DNA提取，然后進(jìn)行電泳檢測（圖4）。分析發(fā)現(xiàn)，所有樣品DNA電泳主帶明顯，相比于根和莖的樣品，葉片樣品和種子萌發(fā)后的子葉混合樣品，DNA完整度更好。因此，我們優(yōu)先推薦采集幼嫩組織葉片作為檢測樣品。若試驗樣品為種子時，其質(zhì)量應(yīng)符合GB/T21138中對煙草種子純度的要求。可考慮進(jìn)行種子萌發(fā)后采集幼嫩葉片組織進(jìn)行檢測，從煙草品種材料中抽取的個體的數(shù)量應(yīng)滿足NY/T2594要求。圖4不同類型樣品DNA提取后電泳檢測A：田間采集葉片樣品；B：種子培養(yǎng)皿萌發(fā)后采集子葉樣品；C：田間采集根樣品；D：田間采集莖樣品。5.3DNA提取方法選擇分別采用傳統(tǒng)的CTAB法和DNA提取試劑盒進(jìn)行煙草幼嫩葉片樣本DNA提取。DNA電泳檢測主帶明顯，無明顯降解和RNA殘留；Nanodrop核酸濃度測定儀測定DNA濃度介于82-265ng/μL之間，260nm與230nm處的吸光度值的比值介于1.5與2.0之間；在260nm與280nm處的吸光度值的比值介于1.8與2.0之間。兩種方法提取的DNA質(zhì)量無明顯差異。考慮到芯片實驗對樣本DNA的要求，因此，所獲DNA質(zhì)量能夠符合擴(kuò)增需要（濃度>10ng/μL，OD260/230=1.5-2.0，OD260/280=1.8-2.0，無明顯降解和RNA殘留）的提取方法都適用于本標(biāo)準(zhǔn)?？紤]到DNA提取試劑盒實驗流程更為簡單，推薦采用該方法進(jìn)行樣品DNA快速提取。圖5不同方法DNA提取后電泳檢測A：CTAB法提取；B：DNA提取試劑盒提取。5.4SNP指紋數(shù)據(jù)采集利用AxiomTobacco430KSNPArray對不同煙草樣品進(jìn)行全基因組掃描，依托GeneTitan芯片平臺進(jìn)行樣本DNA的SNP分型。按照DishQC值>0.82，QCcallrate值>0.97進(jìn)行芯片實驗質(zhì)控，選擇質(zhì)控合格的樣品，提取篩選獲得的2048個SNP標(biāo)記對應(yīng)的樣品基因型。根據(jù)SNP位點的分型效果，剔除或留用該位點的數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)記錄為X/X或X/Y，其中X、Y為該位點的單核苷酸，如A、T、C、G，按此順序排列。無效數(shù)據(jù)記錄為-/-。為確保樣品檢測結(jié)果比對準(zhǔn)確可靠，當(dāng)一個樣品的有效數(shù)據(jù)所占比例<95%時，該樣品數(shù)據(jù)結(jié)果建議不予采用。利用樣品的有效數(shù)據(jù)構(gòu)建該樣品的指紋圖譜。5.5結(jié)果判定當(dāng)前關(guān)于作物品種鑒定的判定方法通常采用差異位點數(shù)或者遺傳相似度來進(jìn)行比較。由于本標(biāo)準(zhǔn)采用的SNP標(biāo)記數(shù)量較多，更適合采用遺傳相似度，即以品種間的遺傳相似比值來表示兩個品種間的差異性。遺傳相似度GS=nijNij×100%，其中GS表示檢測樣品與對照品種的遺傳相似度（%），nij表示檢測樣品與對照品種中均檢出的但基因型無差異的標(biāo)記位點的數(shù)目，Nij為了有效進(jìn)行樣品的身份鑒定，我們對遺傳相似度的判定閾值進(jìn)行了綜合分析。首先選擇了國家煙草基因中心前期從不同省份不同煙葉產(chǎn)區(qū)采集的3個品種（K326、紅花大金元、云煙87）各8個單株葉片樣品進(jìn)行獨立分型測試，發(fā)現(xiàn)其品種內(nèi)變異均大于96%；與此同時，針對259份煙草品種和種質(zhì)SNP分型數(shù)據(jù)，通過數(shù)據(jù)質(zhì)控、存疑數(shù)據(jù)清洗、相同品種材料合并，整理后發(fā)現(xiàn)在剩余的202份材料中兩兩品種間遺傳相似度大部分低于96%（比例為98.6%），遺傳相似度>96%的材料中主要為地方種質(zhì)資源。因此認(rèn)為當(dāng)樣品間遺傳相似度≤96%，則可判定為“不同品種”；當(dāng)樣品間遺傳相似度＞96%，判定為“近似品種或疑同品種”。對于“近似品種或疑同品種”的樣品，可按NY∕T2746-2015的規(guī)定進(jìn)行田間種植進(jìn)一步鑒定。5.6驗證實驗項目組組織了鄭州煙草研究院、貴州省煙草科學(xué)研究院、云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所4家單位進(jìn)行驗證實驗。5.6.1驗證實驗1貴州省煙草科學(xué)研究院從其煙草核心種質(zhì)資源庫中選取了32份不同類型煙草品種為實驗材料（表2），涵蓋不同類型煙草樣本，包括烤煙、白肋煙、雪茄煙和香料煙。表2貴州院驗證實驗材料編號名稱類型G1Coker176烤煙G2NC82烤煙G3NC89烤煙G4NC95烤煙G5Oxford2烤煙G6Oxford26烤煙G7RG11烤煙G8RG13烤煙G9RG17烤煙G10RG8烤煙G11RG89烤煙G12SpeightG-28烤煙G13SpeightG-80烤煙G14紅花大金元烤煙G15云煙2號烤煙G16中煙90烤煙G17畢納1號烤煙G18南江三號烤煙G19中煙14烤煙G20革新三號烤煙G21韭菜坪2號烤煙G22BY21白肋煙G23KY8959白肋煙G24TN90白肋煙G25Beinhart1000-1雪茄煙G26Florida301雪茄煙G27Argiro香料煙G28Basma香料煙G29Cekpka香料煙G30Samsun香料煙G31科英蒂尼巴什馬香料煙G32Alidatobak香料煙樣品提取DNA后，進(jìn)行SNP芯片分型檢測，獲得檢測樣品在的DNA指紋數(shù)據(jù)，并進(jìn)行品種間的遺傳相似度分析（表3）。分析發(fā)現(xiàn)，32個樣本兩兩之間遺傳相似度均小于96%，32份測試樣本均為不同品種。該方法判定結(jié)果準(zhǔn)確有效。表3貴州院驗證實驗樣品間遺傳相似度5.6.2驗證實驗2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院煙草研究所選取了33份不同類型煙草DUS測試標(biāo)準(zhǔn)品種為實驗材料（表4），實驗材料具有典型的形態(tài)特征差異。表4青州所驗證實驗材料編號資源編號品種名稱資源類型典型性狀SV012290NC82引進(jìn)橢圓形葉形SV02485小黃金1025地方葉數(shù)少、黑脛病感病SV031084G28引進(jìn)葉寬寬、葉長寬比小、寬橢圓形葉形、感CMVSV042490中煙90選育縱向葉面急彎、葉面較皺、葉緣皺折SV051365中煙15選育花序密集SV062243Coker176引進(jìn)葉耳大、中等花冠尖SV072293NC89引進(jìn)葉厚較厚、橫向葉面平、葉面平整、葉色綠SV082266K326引進(jìn)株型塔形、腋芽少、長橢圓形葉形、葉尖漸尖、橫向葉面凹、縱向葉面微彎、波浪葉緣、花色淡紅SV093660中煙100選育葉緣微波、花長短SV10540紅花大金元選育葉面平整、花冠小、花色紅SV11503革新三號選育抗黑脛病、中抗TMVSV12520凈葉黃選育抗赤星病SV134820中煙103選育葉緣皺折SV142318G140引進(jìn)感赤星病、感TMVSV151087T.I.245引進(jìn)抗CMVSV163570Coker139引進(jìn)腋芽少、倒圓錐形花序SV173765K149引進(jìn)葉寬窄、葉色淺綠SV18494金星6007選育中抗黑脛病SV19258長脖黃地方葉長長、葉長寬比大、葉尖鈍尖、感青枯病SV20505革新五號選育株高很高、葉數(shù)較多SV213574NC-22-NF引進(jìn)株高很高、葉數(shù)多、葉長短、中心花開放很晚SV222339丸葉引進(jìn)有葉柄、莖葉夾角大、寬卵圓形葉形SV231020DB101引進(jìn)抗青枯病SV242299NC矮桿種引進(jìn)株高矮SV253780NC27NF引進(jìn)株高高、葉數(shù)多、中心花開放晚SV262247Coker254引進(jìn)主莖色淺綠SV272291NC86引進(jìn)主莖色深綠、葉尖急尖、葉色深綠SV282282MN373引進(jìn)葉厚較薄、長橢圓形葉形、葉耳小、中心花開放早SV291005B.L.Orinoco引進(jìn)長卵圓形葉形SV30484小黃金5209地方卵圓形葉形SV313750Coker371Gold引進(jìn)花管膨脹部不明顯、SV322340泰國白花烤煙引進(jìn)花色白SV333719貴煙11號選育球形花序樣品提取DNA后，進(jìn)行SNP芯片分型檢測，除NC-22-NF未通過樣本質(zhì)檢，數(shù)據(jù)結(jié)果不予采用外，其余32個樣本均獲得了有效數(shù)據(jù)。提取檢測樣品在的DNA指紋數(shù)據(jù)，并進(jìn)行品種間的遺傳相似度分析（表5）。分析發(fā)現(xiàn)，樣本兩兩之間遺傳相似度均小于90%，低于判定閾值，32份煙草DUS測試標(biāo)準(zhǔn)品種均可鑒定為不同品種。該方法判定結(jié)果準(zhǔn)確有效。表5青州所驗證實驗樣品間遺傳相似度5.6.3驗證實驗3云南省煙草科學(xué)研究院從其煙草核心種質(zhì)資源庫中選取了30份不同類型煙草品種為實驗材料（表6），涵蓋不同類型煙草樣本，包括烤煙、白肋煙、雪茄煙、香料煙和晾曬煙。表6云南院驗證實驗材料編號名稱類型編號名稱類型Y1云煙116烤煙Y16Coker176烤煙Y2長脖黃烤煙Y17Coker371-gold烤煙Y3云煙300烤煙Y18NC37NF烤煙Y4云煙85烤煙Y19TI245烤煙Y5云煙317烤煙Y20筑波1號烤煙Y6K326烤煙Y21NC55烤煙Y7云煙110烤煙Y22TI488A烤煙Y8云煙97烤煙Y23TN90白肋煙Y9寸莖煙烤煙Y24Burley21白肋煙Y10臺煙7號烤煙Y25Florida301雪茄煙Y11臺煙8號烤煙Y26Beinhart1000-1雪茄煙Y12小黃金1025烤煙Y27印尼雪茄包皮雪茄煙Y13云煙1號烤煙Y28克撒錫巴斯瑪香料煙Y14云煙2號烤煙Y29KokuluIzmir香料煙Y15云煙301烤煙Y30會寧黃晾曬煙樣品提取DNA后，進(jìn)行SNP芯片分型檢測，提取檢測樣品在的DNA指紋數(shù)據(jù)，并進(jìn)行品種間的遺傳相似度分析（表7）。分析發(fā)現(xiàn)，樣本兩兩之間遺傳相似度均小于96%，低于判定閾值，30份煙草測試樣品均可鑒定為不同品種。該方法判定結(jié)果準(zhǔn)確有效。表7云南院驗證實驗樣品間遺傳相似度5.6.4驗證實驗4鄭州煙草研究院利用保存品種材料和行業(yè)內(nèi)單位送檢驗證材料，選取了96份不同類型煙草品種為實驗材料（表8），涵蓋不同類型煙草樣本，包括近年來國內(nèi)烤煙主栽品種、DUS測試標(biāo)準(zhǔn)品種以及行業(yè)種質(zhì)資源保存單位提供的核心種質(zhì)資源，類型包括烤煙、白肋煙、雪茄煙、晾曬煙和香料煙等不同類型。表8鄭州院驗證實驗材料編號名稱類型編號名稱類型TC1云煙87烤煙TC49K149烤煙TC2K326烤煙TC50金星6007烤煙TC3紅大烤煙TC51長脖黃烤煙TC4云煙100烤煙TC52革新五號烤煙TC5云煙99烤煙TC53丸葉烤煙TC6翠碧1號烤煙TC54DB101烤煙TC7龍江911烤煙TC55NC矮桿種烤煙TC8云煙105烤煙TC56NC27NF烤煙TC9NC102烤煙TC57Coker254烤煙TC10云煙116烤煙TC58NC86烤煙TC11秦?zé)?6烤煙TC59MN373烤煙TC12粵煙97烤煙TC60B.L.Orinoco烤煙TC13KRK26烤煙TC61小黃金5209烤煙TC14NC55烤煙TC62Coker371Gold烤煙TC15豫煙6烤煙TC63泰國白花烤煙烤煙TC16韭坪2號烤煙TC64貴煙11號烤煙TC17龍江981烤煙TC65長脖黃烤煙TC18川煙1號烤煙TC66云煙300烤煙TC19豫煙10烤煙TC67云煙85烤煙TC20G80烤煙TC68云煙317烤煙TC21湘煙5號烤煙TC69云煙110烤煙TC22遼煙19烤煙TC70云煙97烤煙TC23湘煙3號烤煙TC71寸莖煙烤煙TC24中煙202烤煙TC72臺煙7號烤煙TC25中煙101烤煙TC73臺煙8號烤煙TC26小白筋0948烤煙TC74小黃金1025烤煙TC27大黃金5210烤煙TC75云煙1號烤煙TC28云煙2號烤煙TC76云煙301烤煙TC29中煙90烤煙TC77筑波1號烤煙TC30畢納1號烤煙TC78會寧黃晾曬煙TC31南江三號烤煙TC79云曬1號晾曬煙TC32中煙14烤煙TC80TI488A烤煙TC33韭菜坪2號烤煙TC81Florida301雪茄煙TC34黔Q6烤煙TC82Beinhart1000-1雪茄煙TC35NC82烤煙TC83印尼雪茄包皮雪茄煙TC36小黃金1025烤煙TC84TN90白肋煙TC37G28烤煙TC85Burley21白肋煙TC38中煙90烤煙TC86克撒錫巴斯瑪香料煙TC39中煙15烤煙TC87KY8959白肋煙TC40Coker176烤煙TC88Argiro香料煙TC41NC89烤煙TC89Cekpka香料煙TC42中煙100烤煙TC90Samsun香料煙TC43革新三號烤煙TC91Alidatobak香料煙TC44凈葉黃烤煙TC92NC95烤煙TC45中煙103烤煙TC93Oxford2烤煙TC46G140烤煙TC94Oxford26烤煙TC47T.I.245烤煙TC95RG11烤煙TC48Coker139烤煙TC96RG17烤煙樣品提取DNA后，進(jìn)行SNP芯片分型檢測，提取檢測樣品在的DNA指紋數(shù)據(jù)，并進(jìn)行品種間的遺傳相似度分析（圖6）。分析發(fā)現(xiàn)，除云煙87和云煙301（98.83%）、紅花大金元和云煙300（99.32%）外，其余樣本兩兩之間遺傳相似度均小于96%，低于判定閾值，可鑒定為不同品種。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，云煙301為定向遺傳改良抗PVY云煙87，云煙300為定向遺傳改良抗黑脛病紅花大金元，兩組樣品間存在較高的遺傳背景相似性。表明該方法判定結(jié)果準(zhǔn)確有效。圖6鄭州院驗證實驗樣品間遺傳相似度5.7比對實驗為了考察本方法的穩(wěn)定性和可靠性，項目組選用4家單位中來源相對獨立的3個樣品進(jìn)行了數(shù)據(jù)比對分析，比對結(jié)果見表9。結(jié)果表明，不同來源的相同樣本在不同實驗室中獲得的遺傳相似度均大于不同品種的判定閾值，均能證實為同一品種。不同實驗室數(shù)據(jù)存在的差異與種子來源有關(guān)，相同品種樣品存在細(xì)微差異的現(xiàn)象是合理的。此外，項目組利用一個紅花大金元樣品DNA同時進(jìn)行5組重復(fù)芯片實驗后，5個重復(fù)樣本間的遺傳相似度均大于99.71%，表明本標(biāo)準(zhǔn)采用SNP芯片的方法重復(fù)性較好。表9重復(fù)樣品的比對分析樣品名稱檢測單位遺傳相似度紅花大金元鄭州院青州所貴州院>98.49%K326鄭州院云南院貴州院>97.95%Coker176青州所貴州院云南院>99.026結(jié)論項目組基于第三代分子標(biāo)記SNP，通過分析不同煙草品種及種質(zhì)材料的SNP芯片分型檢測結(jié)果，篩選到了2048個均勻分布于煙草24條染色體的SNP標(biāo)記。通過對樣品類型、DNA提取、分型檢測、結(jié)果判定等實驗方法比較分析，建立了煙草品種鑒定的分子標(biāo)記檢測方法。在行業(yè)內(nèi)相關(guān)單位進(jìn)行了驗證實驗，并對方法的重復(fù)性和可靠性進(jìn)行了比對。通過以上研究最終完成《煙草品種鑒定SNP標(biāo)記法》，方法準(zhǔn)確可靠，能夠在DNA分子水平上有效區(qū)分不同煙草品種，進(jìn)一步提高我國煙草品種鑒定技術(shù)的規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化水平。可以作為推薦性行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)在行業(yè)內(nèi)使用。參考文獻(xiàn)[1]常愛霞，賈興華，馮全福，等.我國主要烤煙品種的親源系譜分析及育種工作建議［J］.中國煙草科學(xué)，2013，34（1）：1-6.[2] 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附錄ASNP標(biāo)記SNP標(biāo)記見表A.1。表A.1SNP標(biāo)記序號染色體位置正負(fù)鏈序列S11602184-ACTAATTAAAAAATAACTAAGGTGCAAAGTAAATC[T/C]TAGTGAAACATAATAATATCTGACAACGAAATATGS212328654+TTTGAACTCTGATGGGCTCGACTAAATAACAATCA[C/T]GGTGAATTTAGTGGGTAGTTAATACAAGCCTCTGTS313233714-ATGCACGTTTGCCTAAGACCTTGGAATCAGCTGTA[C/T]TACTTGATGCTCAATATATTGCTTGTGGAAGCACAS416045225-AAGAACCATCACAATTGTGAAGTCATCCACATTTC[T/C]GTTGCCTTCGCAAATTGCGAAGGTAAGTTTGCAAAS517289665+AGCATTCTAAGTACAAAGCTATTAACATTTCAGCA[A/G]CCAAAATCAACATTTCAGCAGCAAAATCAGCATTTS618165810+GGAAGCCAAGTGCAGCACCGTTACCAATACCAAAA[G/A]ACTTTAAGATGCCCGATATTCCTAAATATGATGGGS719763770-CAAAATCTACAATAAGTATAAACGCTAACTTTCAA[T/C]AGGATAAAACATGCCAAGAGACTGGAACAAACCCTS8111443707-ATGAAATATAAGTCAAAGTACCAATATGGAATAAA[C/G]ATAAAAATAATTTAGTAAAACACGAACAAGAAATAS9112281249-TCTAGAGAAATGGTGGAGAAGTTGAGATGTAGAAC[C/T]GAGAGGCAAGGAGCACGTTTTATCTCGTTTAATCCS10113070704-CAGATGGAATTAATCATAAGCTTAACTCAAGGAAT[C/A]AGATAAATCAAGATCTCACTACATATTCATCAAGTS11114230693+TACTAAAGCCAGATGGACCAGAACCGACAAAAGAA[C/G]CTCGACAGCAGCACGCCAATTCAGAAGCGCATCACS12115640723-TGGAAATCCCTTAATTTTGATACCACTGCTCTAAG[C/A]TGCGATAATATCAATTGGCTAGATGCCATCAAACATTCTATATATATGGGACCTTTTTTCTTAGAAAACC[C/G]TAATAGTACAAATATTAGGAATATTCACTAGAATATGGTACACCGCCGATATCTTGTGAGATAACGTCAA[T/G]GTGCTTTGTCACGAGGAGGGACTTTGCGTTAGAGAAACGTAGTCTGCTGCCTCCGTGAGAGAAAGCCCTT[C/T]ATACTCCATTAGAGCAGCCACATCTCTCGCTACAGS16122439721-ATTTTTTAGCAAAGTTGATAGGGTAACATGTGACT[T/C]AGCACTATCAACTTAACGTCAGAAAGATCATTTTCTTTACGCTGAATCCGGAGGAGGATTTCATCTCAAG[G/A]GATGTGATGTAAGGAGCCTACTCTGATACACGTATTCCGCAGATGCGAAGTTTGAAGATTTGGGCATTTC[T/C]GTAAAAGTGGACTAAGGGCCGCAGAAGCGCCTCCGS19127017134-TCACAATAGCATTGTATGTACTGCCTAAGAAAGTG[G/C]CACCTACCGTGGCTAAAAAACGGGAAGTAGAAATCS20128267949+TCAATACATAGATATCTGACATGAAGTTTAAGTGC[C/A]AAGTTGAACCAGCGATCCACATGAGAAGCCAATTCS21128601351-TTTAAATGTCTTTTACGATTGGTTAAATATCTCTG[A/T]TTCTCTCTAAAAAACATTGAAAACACCAAATCTGAS22129309274-AAGTATGATGGGACTACAAATCATCAGGATAATAT[T/C]ACCGCCTATATAACGGCAGTGAAGGGAAACAATTTS23130628325-TGAAGTTCAGTCCATAGAAAACACTAAATAAAACA[C/T]GCGCAAGTAACACCGAGGGACGTACGGTCCGATCTS24132415288+AAGTGCATTTATTGCAAAGATATATGACCGGTACA[G/A]CCATTTAATGCCACGGTACGGGCCTGAACTAGCCTS25133067181-GGAGCCGCACCACAGATCATCGTGTAACCTCCTTT[C/T]TGCAGCCATAGCGGCAGCCTGAATTGGGGTGAGTGS26133430580-TACAAAGAGATACAGACCTGACAGATAGACAGAGG[A/C]ACACGGTGAGGATATAGGAGATACACTGAGAGGGAS27134152695+TCCACGTAATCCATCATTTTGTTGATATGAACTGT[T/A]GTCAAATGTATCAAATTGTTGTCCTTTAGGAATGCS28135344571+GGACGAGAAATCATAGAATGCTTCGACAATCTCTG[T/C]ATCCCCAGTCCAGGTAGATTGTTGATGTCTATCTCS29136324277+CTTTTGATTGATTCAAAACATGAACGCAAGCACTC[G/A]TATAAGTATGCAAGCGAGGGACCAACGCAGCCAAAS30138995108+TATGTTCTTCTGTATTTTGAGACTCTAAGTTCGAG[A/G]ATGAGAGTGAGCGATTGAACTCGTGCAGTTAAGGCS31141173300-TCTAACATGTGGAACCCACCTCGCTAACTTGAAGC[T/C]ATCCCACATGCCTGGCAACAAGCTTCTGTAATTGCS32143535978+CATCCGATAAATTTGGAAGGAAGATCATGACGATC[A/C]TGCGAAAGGATAACATGCAGAAATCACAATATTGTS33145181817+ATGTTACTCTCCATGTAAGCCAAGTTCTCCATCTT[C/T]AATGTGCTAGAACATAACTCCTTGAAAAATAAACTS34146592072-GTGTGGATAAATAATGTCTAATAATTATTGGCATC[C/T]GATTGGTGGTCACTCTTTATAAATAGAGATCAACAS35148566755-AAATTTCAATGCCACGCAGGATCGCTGGAACTTAA[C/T]GAAAACAGGGTATATTTGAACTAATATTATAACGAS36150187135+GGAGCCTATCACTCAAGATGACAAGATTAATATTG[C/T]TTAACATGGGGAGTCCTACAAACCACACAAAGGACS37152525648+AGTATAGCCTTTTATCCACATTTGATGGGCAGGCA[G/A]AGCAGACCATTCAGATAATTGAAGATATGTTGCATS38153749378+AGTAAAAGCCAAAGAACATGTCCCATATAATATTC[T/C]CCATGCACATGCATGGCCATGCAAAGACAGACTTTS39155047840-AAGGAGGAGAAGCTCATTGTTTATGAATATGTTCC[T/C]TGTGGTGACTTGTTCGAGCTTTTACATGGTTGGTTS40155853411+AGGTTGAAAAACATATTTGAGTCCAAAAATTGAGG[C/T]GGGTCTAAATCTGGGGCGGGTAGAAACCAATCTGGS41157062163-TGGCTAATACCTGGTACAAGCCTACAACAAAGTAG[C/A]ATATGCAAAACATATGGTGGAAGCTAAAAGAAATGS42158561969-TAGTAAGTTGCATATGAGAGTTTCAAGACTATGCC[T/C]TGTTTTGTGCATTGTATATACTCTCATTGTTTTTGS43159330866+GCAATTGGAAGATATAAAAGCAGCCACTACTTGAT[G/A]TTATTTTTGGCTTTGCTTGGTTCCTGCATGATAATS44160309861-AGGAGGTAGTAGGGTTTTAATATTCTGTTGATTGA[C/T]GTCTAGGACGTTCAGAGTGAGGGAGTGGTTTGCTAS45162141714-TGCTACCTTGATTAACATGGTATTTGAGCGCGTTA[G/A]TTGTAATAAAATTTATGAGAATTTGTTATGATTCGS46164793038+GAAAAGATCGGGAGAGAAGGTAAGTAACATACTAT[C/T]ATGGTCCTGAGCAAGTCACTCGGGACGCTCTGATCS47166883544+TTTGATAGTGCAATGGAATGTAGAGGAGGGAAGGA[G/T]AAAGGGAAAAGCCATCCCCAGTTAGGAGTATCACAS48167568043+GCTAAATATTACAAGTATAGCCACCGAACGTAATG[A/C]AGTCTTTAATTGTTGAAATTGCGCATATAGCCGCTS49168802740+AGAAATAGTATGAAAAATTGTAATTGATGCCAAGG[C/A]ATAGTTTCGAAAATACTTTGGGGAAAAATTGGGTAS50170278499+TACCATTTGCATGTATTACGGTCTTTAAATTGGAA[A/C]TGCCTTTAGAACTATTGCTAGGGCAATACTTACATS51172063965+AGGTACTCTCCCTTCGAATCTATTTATCTCTCTTC[A/C]TTTGCATTTTACTTCACACTTTTCCCCTTTATTTTS52173496361+GATTGCTTCCATCTTCTATTCCATATCTCAACTCG[G/A]AATCTTCTTCAACATCAACGATTCGAGCTATATAGS53175014014+GTATTGCTTTCATGTTACAGAAATGTTTAAAACGA[G/A]GGTCGGCCTACGTACGTCTCATTCAAATCGAATGTS54177145399-TATTTAGGTTTTGTTGGTGAACTAAATGGTTGTGA[G/T]ATGTGTGTAGGGATGTTTGATGCAGTGCAGGGCTAS55178231796-AACGAATTACAACTGATTCATGGAACAAAAAAAAC[C/G]AAAAACAAGAAAAAGGAGGTTCCAGACTGCTATTAS56179766998-CACCTAAGCTTAATTTGATAAAGTGAAAGAGAACA[G/A]GAATGAAATTAGTCTTGGGGTGAAAAAGCTATGCAS57181769077-TGATTGATTACATAATTCATATAAGAGGCCTGAGT[T/C]AGGCCTGCCTGCTGGTTGTAGTTAATAGCACAGATS581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