實驗三紅曲色素的提取

關于實驗三紅曲色素的提取第1頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三123紅曲霉菌紅曲背景簡介：紅曲色素第2頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三紅曲霉菌紅曲霉菌是一種對人類有益的真菌，紅曲霉菌能使大米發(fā)酵制成紅曲米。紅曲霉菌菌絲具有橫隔、多核、分枝較多且不規(guī)律。由紅曲霉接種于大米發(fā)酵得到的紅曲是我國古代的一大發(fā)明，稱為丹曲，至今已有1000多年的歷史，很早就應用于食品著色、食品發(fā)酵以及中醫(yī)中藥。第3頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三紅曲菌是腐生真菌，生長的最適pH為3.5-5，能耐pH3.5，尤嗜乳酸。生長溫度為26-42℃，最適溫度為32-35℃；能耐10%乙醇。能合成生物素、泛酸、尼克酸硫胺素、核黃素等。還能產(chǎn)生色素、乙醇、琥珀酸及少量乳酸、醋酸等。紅曲菌的液化型α-淀粉酶的活性弱，而糖化型β-淀粉酶的活性較強，故可用來生產(chǎn)紅色麥芽糖。紅曲菌的蛋白酶的活性較高。紅曲霉可代謝生成多種酶類，有葡萄糖淀粉酶、葡萄糖苷酶、蛋白水解酶、酯化酶等。特性：第4頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三紅曲

紅曲又名丹曲、赤曲、紅曲米，是以秈米為原料，經(jīng)紅曲霉菌液體深層發(fā)酵精致而成，是一種純天然、安全性高、有益于人體健康的食品添加劑。而且本品色澤鮮艷、色調(diào)純正是天然綠色食品理想的著色劑。它應用范圍廣泛，包括食品類（肉制品、果汁、色酒、果醬、飲料、糖果、糕點、醬油、保健醋等）；藥品類（藥品著色劑、功能性保健品）；化妝品類。第5頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三

紅曲色素紅曲色素是一種由紅曲霉屬的絲狀真菌經(jīng)發(fā)酵而成的優(yōu)質(zhì)的天然食用色素，是紅曲霉的次級代謝產(chǎn)物。

紅曲色素，紅曲色素分為黃色素、橙色素和紫紅色素。商品名叫紅曲紅，是以大米、大豆為主要原料，經(jīng)紅曲霉菌液體發(fā)酵培養(yǎng)、提取、濃縮、精制而成，或者是以紅曲米為原料，經(jīng)萃取、濃縮、精制而成的天然紅色色素。第6頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三

第7頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三

紅曲色素

物理性質(zhì)：紅曲色素呈深紫紅色粉末，略帶異臭，熔點為165~192℃?；瘜W性質(zhì)：紅曲色素中的脂溶性色素均能溶于乙醇等有機溶劑。常用的溶劑是乙醇和醋酸，紅曲色素含量低時其溶液呈鮮紅色，含量高時呈帶黑褐色并伴有熒光產(chǎn)生。對蛋白質(zhì)的著色性能極好，一旦染著，雖經(jīng)水洗，亦不掉色。第8頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三紅曲色素的特性：

1熱穩(wěn)定性經(jīng)研究證明，紅曲色素的熱穩(wěn)定性較好，優(yōu)于其他合成色素，在天然色素中其耐熱性能也屬優(yōu)良。2光穩(wěn)定性紅曲色素的醇溶液受紫外線的影響較小，但日光能使色度降低。通過對紅曲色素中紅、橙、黃3類色素光穩(wěn)定性實驗分析發(fā)現(xiàn)，紅曲色素中紅、橙、黃3類色素間光穩(wěn)定性差別很大，黃色素的光穩(wěn)定性最強，其次為紅色素，橙色素對光最不穩(wěn)定。3對其他物質(zhì)的穩(wěn)定性質(zhì)實踐證明，紅曲色素不受常見金屬離子與氧化劑和還原劑的影響。4抗菌性對食品中54種易污染的微生物進行抑菌試驗證明：紅曲色素對肉毒梭狀芽胞桿菌，蠟狀芽胞桿菌、霉狀桿菌、枯草桿菌、金黃葡萄球菌、熒光假單胞桿菌有較強的抑制作用。第9頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三一、實驗目的1、了解紅曲菌液體菌種的制備方法,為紅曲發(fā)酵實驗準備液體種子。2、了解固體發(fā)酵的工藝過程,在實驗室中小規(guī)模制備紅曲。3、熟悉從紅曲中分離代謝產(chǎn)物的方法，以及掌握紅曲色素色價的測定方法。第10頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三123紅曲液體菌種的制備紅曲固體發(fā)酵項目紅曲色素的提取及紅曲色價測定第11頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三紅曲液體菌種的制備

一、實驗原理

紅曲霉菌是一種好氧性微生物,除了能進行固體淺盤培養(yǎng)外,還可以用液體搖瓶培養(yǎng)的方法來獲得種子。液體菌種生產(chǎn)具有純度高、活力強、繁殖快的特點，接種到固體培養(yǎng)料內(nèi)有流動性好、萌發(fā)點多，菌絲生長迅速等特種點。液體菌種應用于生產(chǎn)與固體菌種相比有以下優(yōu)點：菌種生產(chǎn)周期短；接種后，萌發(fā)點多；接種方便、成本低；適宜工廠化生產(chǎn)。液體菌種為固態(tài)發(fā)酵的集約化、標準化生產(chǎn)創(chuàng)造了更好的條件。第12頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三二、實驗器材與試劑

1．菌種：兩種紅曲菌種2．玉米面液體培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨20；玉米面20；酵母浸粉10；硫酸鎂0.5；磷酸氫二鉀1；硫酸亞鐵0.1；pH6.0。3．兩個500ML三角瓶，酒精燈，接種針，恒溫搖床,超凈工作臺,高壓蒸汽滅菌鍋等。第13頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三第14頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三三、實驗步驟1.配制玉米面液體培養(yǎng)基。500mL三角瓶中裝玉米面液體培養(yǎng)基150mL,包扎后0.lMPa滅菌20分鐘。第15頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三2.玉米面液體培養(yǎng)基滅菌冷卻后，每瓶中接入1/4支紅曲斜面菌苔(注意無菌操作)。第16頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三3.接種后置30℃恒溫搖床中180rpm搖瓶培養(yǎng)3天。第17頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三紅曲固體發(fā)酵第18頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三一、實驗原理

紅曲霉菌作為紅曲的生產(chǎn)菌,以其可產(chǎn)生大量天然色素而著稱。紅曲的應用主要有三方面：食品色素、藥物和發(fā)酵食品。紅曲的主要成分1）紅曲色素：黃色素、橙色素和紫紅色素2）活性酶3）洛伐他?。ㄈ毡景l(fā)現(xiàn)）4）抑菌物質(zhì)：桔霉素(Citrinin)等

國內(nèi)紅曲的生產(chǎn)現(xiàn)在普遍采用固態(tài)發(fā)酵的方法。紅曲固體發(fā)酵

第19頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三紅曲固態(tài)發(fā)酵固態(tài)發(fā)酵的定義：微生物在幾乎沒有游離可流動水的培養(yǎng)基上的生長過程及生物反應過程。第20頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三影響紅曲發(fā)酵的因素（1）菌種：應選擇生長快、適應性強、產(chǎn)紅色素明顯的菌株；（2）原料：一般選用無黏性的梗米或秈米，其淀粉含量高、營養(yǎng)豐富，且可吸收適量水分。米的含水量對發(fā)酵影響很大，起始水分含量低，紅曲色素易生成；水分含量高，會抑制色素合成。一般米中含水量以25%～30%為宜；（3）補水：紅曲霉在生長繁殖過程中，需要補充適量水分，尤其在生長旺盛期補水顯得更為重要；（4）濕度：空氣相對濕度關系到水分的蒸發(fā)，對發(fā)酵的影響也很大，一般RH控制在85%以上；（5）溫度：能在20～37℃范圍內(nèi)生長，通常冷卻至30℃左右即可接種，采用30℃發(fā)酵；（6）通氣：紅曲霉是一種好氧性微生物，因此培養(yǎng)過程中要注意保持良好的通氣。第21頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三1.碳氮源和生長素

紅曲霉能利用多種糖類生長，一般說來，淀粉、糊精、葡萄糖等都是良好的碳源，而在對麥芽糖、蔗糖等的利用上各菌株間差異很大。另外，適于紅曲霉生長的碳源并不一定有利于色素的產(chǎn)生，如紅曲霉Monascussp.3.973菌株用合成培養(yǎng)基（糖5％，NaNO31％，KH2PO40.5%，MgSO4·7H2O0.25％，F(xiàn)eCl3微量，150mL三角瓶內(nèi)裝25mL培養(yǎng)基）培養(yǎng)時，若以麥芽糖為碳源，可得生物量（干重）0.1g，稀釋100倍后的發(fā)酵液其吸光度（A505nm）為0.860；而以木糖為碳源時，生物量僅0.04g，但是1%發(fā)酵液的吸光度（A505nm）可達1.850，說明生長與色素的產(chǎn)生之間不呈正相關。

就氮源而言，NaNO3、NH4NO3、（NH4）2SO4和蛋白胨等都是紅曲霉生長的良好氮源，然而菌體生長與色素生成之間也不呈正相關。泛酸鈣、對氨基苯甲酸、維生素B6、肌醇等含氮物質(zhì)具有促進某些菌株生長及色素生成的作用。補充點：培養(yǎng)條件對菌體生長及紅曲色素形成的影響第22頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三培養(yǎng)條件對菌體生長及紅曲色素形成的影響2.溫度和pH

雖然不同的紅曲霉菌株其最適生長溫度和最適生長pH有所不同，但大多數(shù)菌株的適溫為30～35℃，25℃以下或40℃以上生長緩慢。最適pH為3.0～5.0，pH3.0以下生長緩慢，pH5.0以上則不適于產(chǎn)生色素。3.無機鹽類

高濃度的CoCl2（10－4）、CuCl2（10－6）和ZnCl2（10－3）對大多數(shù)紅曲霉株的生長有抑制作用，低濃度的CoCl2（10－5）、CuCl2（10－7）和ZnCl2（10－5）可促進色素生成。第23頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三二、實驗器材與試劑1、制曲原料:優(yōu)質(zhì)秈米。2、蒸鍋、三角瓶、玻璃棒、移液管（滅菌），超凈工作臺。第24頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三工藝流程：

菌種→選育→斜面培養(yǎng)→搖瓶培養(yǎng)→液體種子發(fā)酵大米→清理→浸泡→清洗→蒸飯→冷卻→接種→固體培養(yǎng)→干燥→粉碎→紅曲色素提取第25頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三三、實驗步驟1．浸米:取1/3袋左右的大米，25℃以上浸米約20h,大米吸收水分約在28%～30%。2．蒸米:將浸好的米用清水淋去米漿水,瀝干,即可蒸米。上汽火力要強,加水40%，121℃，蒸30分鐘，待全部圓氣以后，飯粒呈玉色,粒粒疏松,不結團塊。3．攤涼接種:將蒸熟的曲料倒在超凈工作臺上迅速打碎團塊,攤平冷卻到30～32℃。每組準備好500ml三角瓶裝5-10厘米左右米飯。然后在無菌操作臺上接種，接種量2%～10%，接種前用具消毒滅菌，在酒精燈火焰上方操作接種。充分翻拌混合均勻,操作要迅速,以減少雜菌污染。第26頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三4．發(fā)酵培養(yǎng):

接好種的三角瓶在恒溫恒濕生長培養(yǎng)箱中，30～35℃培養(yǎng)5～8d。

每天翻曲一次，觀察到曲粒表面略有干皮、少數(shù)曲粒略有微紅斑點等現(xiàn)象時即可“吃水”，使曲粒吸收一定水分,以利菌絲逐漸向內(nèi)生長。

吃水方法:一邊拌曲，一邊向曲盤中噴灑無菌水,使曲粒表面潤濕并微有發(fā)脹。培養(yǎng)3天后米粒逐漸成紅色。觀察記錄色素產(chǎn)生的過程。培養(yǎng)5-7天后，固態(tài)發(fā)酵結束的紅曲置于鼓風干燥箱內(nèi)50-60℃鼓風干燥。第27頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三5．成品質(zhì)量檢查

外觀檢查

:曲粒表層光滑紫紅,曲粒中心呈玉色,不得有空心和紅心。曲粒斷面菌絲均勻，具有紅曲特有的曲香,不得有酸氣等不正常氣味。

生物與理化項目檢查:水分12%以下,容量(l00mL)44.5～46.5g,淀粉含量５９％～６２%,無細菌和其他霉菌污染。第28頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三四、注意事項

1、浸米時用醋酸調(diào)PH至5.0-5.5左右，有利于發(fā)酵產(chǎn)品色價的提高。2、清洗時要至無混濁。3、蒸飯時，要熟過心，但不能結團。

4、接種時注意無菌操作。5、注意控制過程中的溫度。第29頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三一、實驗原理

大米經(jīng)紅曲菌固體發(fā)酵后產(chǎn)生了一系列紅曲菌的代謝產(chǎn)物,但這些產(chǎn)物的量非常少,大米仍占固體發(fā)酵產(chǎn)物的絕大部分體積,為了降低運輸成本,常常要對紅曲菌的代謝產(chǎn)物進行提取和濃縮。紅曲的代謝產(chǎn)物中既有水溶性組分,也有脂溶性組分,因此可用80%的丙酮(丙酮:水=80：20)抽提。用HCl或NaOH處理可以將其中的酸溶性組分、堿溶性組分和中性組分分開。

紅曲色素的提取及紅曲色價測定第30頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三一、實驗原理

選擇溶劑一般要注意以下四點：①溶劑對所需成分的溶解度要大，對雜質(zhì)溶解度要小，或反之。②溶劑不能與天然藥物成分產(chǎn)生化學反應，即使反應亦屬于可逆性的。③溶劑要經(jīng)濟易得，并具有一定的安全性。④沸點宜適中，便于回收反復使用。紅色素能溶于80%的乙醇中，可通過萃取從米粒中提取出來,紅曲色素在505nm處有最大的吸收峰,可用分光光度計來測定。第31頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三二、實驗器材與試劑1、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,分液漏斗，分光光度計,水浴鍋,量筒等。2、酸乙酯,丙酮，80%乙醇等第32頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三

三.實驗步驟12

紅曲色素的提取紅曲色價測定第33頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三一般提取方法：萃取法組織培養(yǎng)法粉碎法壓榨法酶反應法微生物發(fā)酵法人工合成法

紅曲色素的提取第34頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三紅曲色素的提取第35頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三具體步驟：1、取200g固體發(fā)酵之紅曲,在植物粉碎機中將其粉碎；第36頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三2、將紅曲粉放于500mL三角瓶中,加入提取液(丙酮:水=80:20)200-300mL；

第37頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三3、室溫下?lián)u動10-15min左右，過濾；4、在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中減壓蒸去丙酮(尚有水分，60℃)；第38頁，共44頁，2023年，2月20日，星期三5、用lmol/LHCl調(diào)殘留液(約l00mL)的pH至3.0,加至分液漏斗中；加入150ml的醋酸乙酯（EtOAc