體外gRNA快速合成及檢測的方法,分子生物學論文

體外gRNA快速合成及檢測的方法,分子生物學論文基因定點敲除技術(shù)通過對染色體上基因特異位點進行定點突變，使其功能喪失，進而到達研究其功能的目的。一些利用基因敲除技術(shù)開創(chuàng)建立的動物疾病模型對醫(yī)學研究的發(fā)展做出了重要奉獻。傳統(tǒng)基因敲除技術(shù)于上世紀80年代末由Smithies等[1]創(chuàng)立，通過同源重組手段將構(gòu)建的外源DNA片段插入并替換相應(yīng)染色體上特定的區(qū)段，到達基因敲除的目的。這一技術(shù)的應(yīng)用使人類能夠有目的地研究基因功能和與之相關(guān)的疾病之間的直接關(guān)系。然而由于同源重組技術(shù)需要載體構(gòu)建、ES細胞打靶、挑選、顯微注射、小鼠鑒定等一系列較為復雜的操作步驟，并且成本較高、周期較長，大大限制了這一技術(shù)的應(yīng)用。針對同源重組的缺點，科學家一直在探尋求索用其他更簡便的技術(shù)來實現(xiàn)基因敲除。先后發(fā)明了ENU隨機突變、基因捕獲、ES細胞基因敲除細胞庫等方式方法和手段，但由于技術(shù)手段和操作成本的限制，這些技術(shù)都不能完全替代傳統(tǒng)的同源重組技術(shù)。2018年以后出現(xiàn)了一系列新的基因編輯技術(shù)，包括ZFN、TALEN和CRISPR/Cas9,創(chuàng)始了基因敲除〔敲入〕新的時代。這些新基因編輯技術(shù)作用原理類似，即通過核酸酶在目的基因的DNA雙鏈上制造切口，然后利用生物體本身的修復機制以同源重組或者非同源末端連接的方式實現(xiàn)修復，進而到達基因失活的目的。作為一種最新的基因編輯技術(shù)，CRISPR/Cas9技術(shù)通過gRNA辨別特異的靶序列，同時介導Cas9核酸酶在DNA的特異位點上制造切口[2],然后利用生物體本身的修復機制進行DNA修復。這一經(jīng)過中可能造成堿基改變、增加、缺失等突變現(xiàn)象，進而實現(xiàn)對目的基因的敲除與修飾[3].CRISPR/Cas9系統(tǒng)的高效基因組編輯功能已被成功應(yīng)用于多種生物。包括人類細胞,斑馬魚[5]、小鼠[6,7]、大鼠[8]、植物[9,10]及細菌[11].眾所周知，生物體的一個性狀往往由多個基因共同決定，傳統(tǒng)的基因敲除費時費力卻只能一次敲除一個相關(guān)基因，而CRISPR/Cas9系統(tǒng)華而不實一個最重要的特點便是可在多個不同gRNA的引導下由Cas9核酸酶一次靶向敲除多個基因組位點[12,13].與其他基因編輯技術(shù)相比，CRISPR/Cas9系統(tǒng)具有其獨特的優(yōu)勢：首先，其RNA辨別DNA機制即核酸之間的互相辨別，避免了DNA甲基化造成的影響。其次，與ZFN和TALEN相比，具有一樣或更高層次的基因編輯效率，尤其在點突變方面優(yōu)于ZFN和TALEN[14,15].第三，設(shè)計簡單快速，無需重復構(gòu)建核酸內(nèi)切酶表示出載體，適用于任何分子生物學實驗室。當下基因編輯技術(shù)迅速發(fā)展，CRISPR/Cas9技術(shù)以其優(yōu)勢必將迅速推動基因組功能的研究。快速獲取目的gRNA并檢測驗證其活性將會推動這項技術(shù)的發(fā)展。本文旨在建立一種體外gRNA快速合成及檢測的方式方法，這一方式方法的建立將減少利用該系統(tǒng)實現(xiàn)基因編輯的時間，快速實現(xiàn)目的基因的敲除。1材料和方式方法1.1材料8周齡SPF級C57小鼠，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供【SCXK〔京〕2020-0004】，PCR儀〔Bio-RadT100TMThermalCycler〕、Tanon全自動數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)〔上海天能公司〕、NanoDrop2000超微量分光光度計〔Thermo〕、T7轉(zhuǎn)錄試劑盒〔Ambion_mMESSAGE_mMACHINE_T7〕、RNA純化試劑盒〔MEGAclearTMKit,Ambion〕、PCR產(chǎn)物純化試劑盒〔QIAquickPCRPurificationKit〕、無核酸酶水、dNTPmixture、高保真酶Taq酶〔Sigma〕、Cas9核酸酶〔北京唯尚立德生物科技有限公司〕1.2gRNA靶點選擇及其寡核苷酸鏈合成利用設(shè)計能夠結(jié)合NKp46外顯子Exon3上的gRNA〔20nt〕.引物及gRNA通用模板由Invitrogen公司合成。1.3gRNA轉(zhuǎn)錄模板的PCR擴增利用NKp46gRNA特異的上游引物mNKp46_g1F和gRNA通用下游引物gRNA-R,以人工合成的gRNA通用模板DNA片段為模板，通過PCR擴增得到NKp46基因特異的gRNA轉(zhuǎn)錄模板。詳細反響條件如下：〔94℃30s,60℃10s,72℃30s〕35,72℃10min,4℃保存。取5L電泳檢測PCR產(chǎn)物，確定得到目的DNA片段，大小為123bp.1.4gRNA模板的體外轉(zhuǎn)錄在得到gRNA轉(zhuǎn)錄模板后利用純化試劑盒進行g(shù)RNA轉(zhuǎn)錄模板的純化。將純化后的產(chǎn)物用T7RNAkit轉(zhuǎn)錄試劑盒〔Ambion_mMESSAGE_mMA-CHINE_T7〕進行NKp46gRNA體外轉(zhuǎn)錄并利用RNA純化試劑盒〔MEGAclearTMkit,Ambion〕將轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行純化。合成的gRNA通過NanoDrop2000超微量分光光度計檢測檢測濃度及純度。分裝并-80℃凍存。1.5gRNA體外活性及特異性檢測將得到的gRNA與Cas9核酸酶以及目的DNA混合孵育，電泳后觀察條帶大小并觀察片段灰度來確定切割效率。反響體系：dsDNA〔4L〕,gRNA〔體外轉(zhuǎn)錄〕〔1L〕,Cas9核酸酶〔1L〕,10buffer〔2L〕,ddH2O〔12L〕,反響總體系〔20L〕根據(jù)上述反響體系，混合好反響溶液，37℃30min,65℃5min.2結(jié)果2.1小鼠NKP46基因gRNA靶點選擇NKp46基因存在于嚙齒類動物〔大鼠和小鼠〕和靈長類動物，如黑猩猩和短尾猿中。同時NKp46是唯一能被小鼠細胞上表示出配體所辨別的人類NK細胞激活受體。為了研究NKP46基因在病毒感染經(jīng)過中的作用，我們希望通過Cas9技術(shù)開創(chuàng)建立NKP46敲除小鼠。設(shè)計得到gRNA,見表1.本文以小鼠NKP46基由于例設(shè)計gRNA.共選擇了2條gRNA序列：gRNA1GGTGAACATCTGGTGTCAGG,gRNA2CTCGGTGAACATCTGGTGTC這兩個gRNA位于Nkp49基因組上外顯子Exon3處。2.2NKp46gRNA體外擴增模板的設(shè)計gRNA轉(zhuǎn)錄模板的構(gòu)造：T7啟動子、前導序列〔20nt〕、保守序列。體外擴增模板序列是固定的即gRNA轉(zhuǎn)錄模板的保守序列GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT,該片段能夠構(gòu)成gRNA的發(fā)卡構(gòu)造，是所有g(shù)RNA都包括的一部分。2.3上游引物gRNA-F的設(shè)計將得到的20nt的序列前端加上一段T7啟動子序列TAATACGACTCACTATAGGG并在末尾加上與gRNA固有序列前端相同的幾個堿基GTTT-TAGAGCTAG,最終設(shè)計得到一個53nt的片段。根據(jù)該方式方法設(shè)計并合成了靶向小鼠NKP46基因的mNKp46_g1F.mNKp46_g1F將作為轉(zhuǎn)錄模板合成經(jīng)過中的上游引物，介入PCR反響。由于體外轉(zhuǎn)錄試劑盒在轉(zhuǎn)錄完成后會在5端多出3個G所以在設(shè)計選擇靶向gRNA時能夠選擇起始位置帶G的序列，這樣能夠最大限度的減少體外轉(zhuǎn)錄的影響，它的構(gòu)成〔圖1〕mNKp46_g1FTAATACGACTCACTATAGGGTGAACATCTGGTGTCAGGGTTTTAGAGCTAG2.4gRNA合成的通用下游引物。gRNA-R的設(shè)計AAAAAAAGCACCGACTCGGT-GCCACTTTTTC,該序列與gRNA模板3端互補。2.5靶向小鼠NKP46基因的gRNA的轉(zhuǎn)錄模板在體外完成擴增該經(jīng)過特別簡單只需一步PCR反響就能夠迅速得到足夠濃度的帶有T7promoter的gRNA的轉(zhuǎn)錄模板，介入反響的上游引物已經(jīng)根據(jù)上述方式方法設(shè)計合成，華而不實下游引物和模板由于是通用的不具有特異性，不需要每次都合成。當研究者更換目的基因，只需設(shè)計合成一條新的上游引物即可，下游引物及模板不需要重復合成，特別的簡單經(jīng)濟。擴增經(jīng)過〔見圖2〕.然后體外轉(zhuǎn)錄得到足夠濃度gRNA的靶向NKP46基因的gRNA.2.6體外利用Cas9核酸酶檢測驗證該方式方法確實能夠得到高特異性及活性的gRNA設(shè)計體外檢測引物mNk46_gSFTCCAAACACGTGCATGTTACACATG,mNk46_gSRCCCAGCTTTGACTCTCTTGTCCATC以小鼠DNA作為模板，利用該引物能夠擴增NKP46基因，作為體外酶切檢測的片段。該片段中包含gRNA的靶點，利用這種體外檢測方式方法，能夠迅速對設(shè)計合成的gRNA的特異性及活性進行檢測，通過電泳能夠觀察剪切條帶的大小，以驗證靶點位置能否正確，進一步能夠通過T-A克隆檢測切開位置。本文設(shè)計的靶向NKP46的gRNA在靶點位置切開，使得全長1297bp檢測條帶，被切成兩條帶，大小分別為804bp和493bp〔圖3A〕.通過對灰度的計算〔圖3B〕,計算得到轉(zhuǎn)錄后原濃度的gRNA以及稀釋一倍的gRNA,剪切效率都為100%,由此能夠證明該方式方法設(shè)計合成gRNA特異性及活性較高，同時體外檢測快速檢測的方式方法大大提高了gRNA檢測的效率。3討論常規(guī)獲取gRNA要構(gòu)建表示出載體，需要把gRNA的轉(zhuǎn)錄模板連接到載體上，經(jīng)過涂板挑選單克隆再搖菌后提取質(zhì)粒，最后還要酶切使質(zhì)粒線性化才能得到gRNA的體外轉(zhuǎn)錄模板，得到gRNA最少也需要3d的時間。而本文建立的這種方式方法將極大地節(jié)約轉(zhuǎn)錄gRNA的時間，一步PCR反響就能夠得到足夠濃度的轉(zhuǎn)錄模板，僅需半天時間就能夠得到需要的gRNA.本文建立的這種活性及特異性檢測方式方法，能夠在體外迅速驗證gRNA的其活性及特異性。將Cas9核酸酶、gRNA、PCR擴增的靶基因片段混合孵育，通過瓊脂糖凝膠電泳能夠特別清楚的觀察到剪切位置并通過對電泳照片的灰度比擬能夠進一步計算剪切效率。建立的這種快速利用CRISPR/Cas9技術(shù)實現(xiàn)基因編輯的方式方法，最具特色的是gRNA的獲得及體外酶切檢測。與常規(guī)方式方法相比我們