高三生物一輪復(fù)習(xí)課件【知識建構(gòu)+精講精練】基因工程的基本工具和基本操作程序

基因工程的基本工具和基本操作程序基因工程

基因工程是指按照人們的愿望，通過轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。從技術(shù)操作層面看，由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫作重組DNA技術(shù)。（章首頁）01基因工程(重組DNA技術(shù)/轉(zhuǎn)基因技術(shù))的概念理解操作環(huán)境生物體外操作對象基因操作水平DNA分子水平基本過程剪切→拼接→導(dǎo)入→表達(dá)原理基因重組結(jié)果創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品分子運(yùn)輸車分子手術(shù)刀分子縫合針限制性內(nèi)切核酸酶----“分子手術(shù)刀”主要來自原核生物數(shù)千種▲限制酶不是一種酶，而是一類酶。來源種類特點(diǎn)GAATTCCTTAAG能識別雙鏈

DNA分子的特定核苷酸序列，并使每一條鏈中特定部位的磷酸二酯鍵斷開。02結(jié)果產(chǎn)生黏性末端或平末端GAATTCCTTAAG限制性內(nèi)切核酸酶----“分子手術(shù)刀”作用部位識別序列長度特定切點(diǎn)上的磷酸二酯鍵大多數(shù)是6個核苷酸序列磷酸二酯鍵02限制性內(nèi)切核酸酶----“分子手術(shù)刀”EcoRⅠ中軸線粘性末端平末端SamⅠ02限制性內(nèi)切核酸酶----“分子手術(shù)刀”注意①能被限制性酶特異性識別的切割位點(diǎn)一般都具有回文序列：即在切割位點(diǎn)，DNA一條鏈正向讀的堿基序列與另一條反向讀的堿基序列完全一致。②在切割含目的基因的DNA分子時，需要在目的基因的兩端都用限制性核酸內(nèi)切酶切割，會產(chǎn)生4個末端。02DNA鏈接酶----“分子縫合針”將雙鏈DNA雙鏈片段“縫合”起來，恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵。E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶從大腸桿菌中分離得到只能鏈接互補(bǔ)黏性末端從T4噬菌體中分離得到黏性末端與平末端均可連接，但連接平末端的效率相對比較低。作用種類03DNA鏈接酶----“分子縫合針”E.coliDNA連接酶&T4DNA連接酶E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶磷酸二酯鍵作用部位★DNA連接酶沒有識別特異性03DNA鏈接酶----“分子縫合針”★思考：DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？為什么？相同點(diǎn)：都是催化磷酸二酯鍵形成的酶不同點(diǎn)：DNA聚合酶連接的是游離的脫氧核苷酸，需要模板；DNA連接酶連接的是DNA片段。03DNA鏈接酶----“分子縫合針”名稱作用部位作用結(jié)果限制酶磷酸二酯鍵將DNA切成兩個片段DNA連接酶磷酸二酯鍵將兩個DNA片段連接為一個DNA分子DNA聚合酶磷酸二酯鍵將單個脫氧核苷酸依次連接到單鏈末端DNA(水解)酶磷酸二酯鍵將DNA片段水解為單個脫氧核苷酸解旋酶堿基對之間的氫鍵將雙鏈DNA分子局部解旋為單鏈，形成兩條長鏈歸納總結(jié)幾種相關(guān)酶的比較03基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體----“分子運(yùn)輸車”質(zhì)粒是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨(dú)立于真核細(xì)胞細(xì)胞核或原核細(xì)胞擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。質(zhì)粒04基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體----“分子運(yùn)輸車”作用將目的基因轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞&在受體細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量復(fù)制通常是用質(zhì)粒，噬菌體、動植物病毒也可以。種類04基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體----“分子運(yùn)輸車”便于插入（攜帶）目的基因☆真正被用作載體的質(zhì)粒，都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上進(jìn)行過人工改造的。運(yùn)載體需具備的條件①能在受體細(xì)胞中穩(wěn)定保存并復(fù)制②有一個至多個限制酶切割位點(diǎn)③具有標(biāo)記基因，便于篩查含有重組DNA分子的細(xì)胞④對受體細(xì)胞無害、易分離04基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體----“分子運(yùn)輸車”載體上標(biāo)記基因的標(biāo)記原理普通培養(yǎng)基不含抗生素選擇培養(yǎng)基50μg/ml四環(huán)素04DNA的粗提取與鑒定05一、實(shí)驗(yàn)原理①利用DNA、RNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)在理化性質(zhì)方面的差異進(jìn)行提取和分離

DNA在不同NaCl溶液中的溶解度不同，可溶于2M的NaCl溶液中

DNA不溶于（冷）酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精②在一定的溫度下（沸水?。?，DNA遇二苯胺試劑會呈現(xiàn)藍(lán)色①研磨：10g香蕉果肉＋10mL研磨液，充分研磨。②過濾：雙層尼龍紗布過濾。③離心：3000r/min離心2min，取上清液。④加冷酒精：入等體積冷酒精，靜置3～5min，用玻璃棒沿一個方向攪拌卷起絲狀物。研磨液成分作用SDS使蛋白質(zhì)變性EDTA抑制DNA酶活性Tris-HCl緩沖液穩(wěn)定DNANaCl溶解DNA二、實(shí)驗(yàn)步驟DNA的粗提取與鑒定05二、實(shí)驗(yàn)步驟⑤鑒定：絲狀物或沉淀物＋二苯胺試劑2mL混勻，95℃沸水浴加熱10min，冷卻后觀察到藍(lán)色（二苯胺試劑2mL不加DNA做對照）。從左至右：少量DNA、大量DNA、空白對照DNA的粗提取與鑒定06例1.下表為常用的限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶)及其識別序列和切割位點(diǎn)，由此推斷以下說法中，錯誤的是（）注：Y為C或T，R為A或G。A.HindⅡ、SmaⅠ兩種限制酶切割后形成平末端B.Sau3AⅠ限制酶的切割位點(diǎn)在識別序列的外部C.BamHⅠ和Sau3AⅠ兩種限制酶切割后形成相同的黏性末端D.一種限制酶一定只能識別一種核苷酸序列限制酶名稱識別序列和切割位點(diǎn)限制酶名稱識別序列和切割位點(diǎn)BamHⅠG↓GATCCKpnⅠGGTAC↓CEcoRⅠC↓AATTCSau3AⅠ↓GATCHindⅡGTY↓RACSmaⅠCCC↓GGGCDNA的粗提取與鑒定06例2.第三代疫苗——DNA疫苗是指將編碼保護(hù)性抗原蛋白的基因(如圖甲)插入到適宜的質(zhì)粒(如圖乙)中得到的重組DNA分子，將其導(dǎo)入人體內(nèi)，在人體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的產(chǎn)物可直接誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答，且可持續(xù)一段時間。限制性內(nèi)切核酸酶的切點(diǎn)分別是BglⅡ、EcoRⅠ和Sau3AⅠ。下列分析錯誤的是（）A.構(gòu)建DNA疫苗時，可用BglⅡ和

Sau3AⅠ切割目的基因和質(zhì)粒B.圖乙中只用EcoRⅠ切割后的質(zhì)粒，含有2個游離的磷酸基團(tuán)C.用EcoRⅠ切割目的基因和質(zhì)粒，再用DNA連接酶連接，只產(chǎn)生1種連接產(chǎn)物D.抗原基因在體內(nèi)表達(dá)時不需要解旋酶C基因工程的基本操作程序目的基因的篩選與獲取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測與鑒定07從生物材料獲取目的基因基因工程的基本操作程序071.目的基因的篩選與獲取生物材料DNARNA一定大小范圍的DNAcDNA逆轉(zhuǎn)錄基因組文庫cDNA文庫基因文庫獲取目的基因PCR導(dǎo)入受體菌中保存限制酶酶切包括已知序列：人工合成①從相關(guān)的已知結(jié)構(gòu)和功能清晰的基因中進(jìn)行篩選是較為有效的方法之一。②利用序列數(shù)據(jù)庫和序列比對工具進(jìn)行篩選。①人工合成目的基因②用PCR特異性地快速擴(kuò)增目的基因NCBIGeneBankBLAST聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）根據(jù)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外（PCR擴(kuò)增儀）提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，對目的基因的核苷酸序列進(jìn)行大量復(fù)制的技術(shù)?；蚬こ痰幕静僮鞒绦?71.目的基因的篩選與獲取▲引物:在DNA復(fù)制時，DNA聚合酶不能直接從模板鏈的一端直接開始合成子鏈，必須由引物提供3′端之后才能開始連接脫氧核苷酸。是能與DNA母鏈互補(bǔ)配對的一小段短單鏈核酸序列.基因工程的基本操作程序071.目的基因的篩選與獲取--PCR思考用PCR可以擴(kuò)增mRNA嗎？不能！由于RNA不穩(wěn)定，需要將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后再進(jìn)行擴(kuò)增單鏈RNA逆轉(zhuǎn)錄酶雜交雙鏈DNA鏈RNA鏈核酸酶H單鏈DNADNA聚合酶雙鏈DNAPCR擴(kuò)增DNA模板Step1：加熱至90℃以上使雙鏈分開Step2:冷卻至50℃左右使引物與DNA結(jié)合引物Step3:DNA合成+DNA聚合酶+dATP+dGTP+dCTP+dTTP第一輪的產(chǎn)物①變性90℃以上②復(fù)性③延伸冷卻加熱50℃左右引物模板結(jié)合72℃左右DNA從5’端到3’端延伸。72℃時，基因工程的基本操作程序071.目的基因的篩選與獲取--PCR①變性②復(fù)性③延伸循環(huán)基因工程的基本操作程序071.目的基因的篩選與獲取--PCR思考獲取目的基因時至少要經(jīng)過幾次循環(huán)才能分離出目的基因？三次才能得到目的基因如何對產(chǎn)物進(jìn)行檢測鑒定？思考如何對產(chǎn)物進(jìn)行檢測鑒定？瓊脂糖凝膠電泳基因工程的基本操作程序071.目的基因的篩選與獲取--PCR

DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下,這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷,在電場的作用下,這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就叫電泳。思考如何對產(chǎn)物進(jìn)行檢測鑒定？瓊脂糖凝膠電泳凝膠中的DNA分子通過染色，可以在波長為300納米的紫外燈下被檢測出來。

DNA分子具有可解離的基團(tuán)，在一定的pH下，這些基團(tuán)可以帶上正電荷或負(fù)電荷，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與它所帶電荷相反的電極移動，這個過程就叫電泳。基因工程的基本操作程序071.目的基因的篩選與獲取--PCR基因工程的基本操作程序072.基因表達(dá)載體的構(gòu)建(核心工作)游離的DNA片段進(jìn)入受體細(xì)胞，一般會直接被分解，就算可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)，游離的DNA片段也無法隨著細(xì)胞分裂進(jìn)行復(fù)制，導(dǎo)致子代細(xì)胞不再含有目的基因。解決辦法？思考質(zhì)粒細(xì)菌染色體植物染色體細(xì)胞核表達(dá)載體基因表達(dá)載體的作用：①讓目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并遺傳給下一代；②使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。☆基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心工作。啟動子：一段特殊DNA序列，位于基因的上游，是RNA聚合酶的識別和結(jié)合位點(diǎn)，啟動轉(zhuǎn)錄過程。終止子：一段特殊DNA序列，位于基因的上游，終止轉(zhuǎn)錄?；蚬こ痰幕静僮鞒绦?72.基因表達(dá)載體的構(gòu)建(核心工作)基因工程的基本操作程序072.基因表達(dá)載體的構(gòu)建(核心工作)思考限制酶的選擇構(gòu)建載體時，需要用同種限制酶切割載體和目的基因，以獲得相同的黏性末端，便于兩者順利連接。但是由于被切割后的質(zhì)粒本身也具備相同的黏性末端，所以會有一定概率的自身環(huán)化，你有辦法解決這個問題嗎？請?zhí)岢鲎约旱目捶??；蚬こ痰幕静僮鞒绦?72.基因表達(dá)載體的構(gòu)建(核心工作)基因工程的基本操作程序073.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞細(xì)胞種類植物細(xì)胞動物細(xì)胞微生物細(xì)胞常用方法農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法顯微注射法Ca2+處理法（感受態(tài)細(xì)胞法）受體細(xì)胞體細(xì)胞受精卵原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程以農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法為例：將目的基因插入Ti質(zhì)粒的T-DNA上→農(nóng)桿菌→導(dǎo)入植物細(xì)胞→整合到受體細(xì)胞的DNA上→表達(dá)將含有目的基因的表達(dá)載體提純→取受精卵→顯微注射→受精卵發(fā)育→獲得具有新性狀的動物Ca2+處理細(xì)胞→感受態(tài)細(xì)胞→重組表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合→感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子基因工程的基本操作程序073.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌生活在土壤中的微生物，自然條件下可侵染雙子葉植物和裸子植物，而對大多數(shù)單子葉植物沒有侵染能力。農(nóng)桿菌細(xì)胞內(nèi)含有Ti質(zhì)粒，當(dāng)它侵染植物細(xì)胞后，能將Ti質(zhì)粒上的T-DNA（可轉(zhuǎn)移的DNA）轉(zhuǎn)移到被侵染的細(xì)胞，并且將其整合到該細(xì)胞的染色體DNA上?；蚬こ痰幕静僮鞒绦?73.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法122.將新鮮的從葉片上取下的圓形小葉與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)，然后篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞，并再生成植株；1.將花序直接浸沒在含農(nóng)桿菌的溶液中一段時間，然后培養(yǎng)植株并獲得種子，再進(jìn)行篩選、鑒定。基因工程的基本操作程序073.將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞基因工程的基本操作程序074.目的基因的檢測與鑒定分子水平檢測目的基因DNA分子雜交檢測mRNA檢測表達(dá)的蛋白質(zhì)分子雜交抗原—抗體雜交PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)標(biāo)記基因標(biāo)記基因檢測目的基因DNA分子雜交檢測mRNA檢測表達(dá)的蛋白質(zhì)分子雜交抗原—抗體雜交基因工程的基本操作程序074.目的基因的檢測與鑒定分子水平PCR檢測普通培養(yǎng)基不含抗生素選擇培養(yǎng)基50μg/ml四環(huán)素抗性鑒定基因工程的基本操作程序074.目的基因的檢測與鑒定個體水平抗蟲鑒定棉鈴蟲棉鈴蟲（死亡）基因工程的基本操作程序074.目的基因的檢測與鑒定個體水平05PCR片段擴(kuò)增及電泳鑒定例4.利用重疊延伸PCR技術(shù)進(jìn)行定點(diǎn)突變可以實(shí)現(xiàn)對纖維素酶基因進(jìn)行合理性改造，其過程如下圖所示。下列分析不正確的是（）A.PCR1過程中的產(chǎn)物AB是依賴引物a和引物