第六章 分子生物學(xué)研究法

2023/2/41第六章分子生物學(xué)研究法（下）——基因功能研究技術(shù)2023/2/412023/2/42第六章分子生物學(xué)研究法（下）2023/2/42

從20世紀(jì)中葉開(kāi)始，分子生物學(xué)研究得到高速發(fā)展，主要原因之一是研究方法，特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進(jìn)步。

基因操作主要包括DNA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、核酸序列分析以及基因人工合成、定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增等，是分子生物學(xué)研究的核心技術(shù)。2023/2/43第六章分子生物學(xué)研究法（下）內(nèi)容：基因表達(dá)研究技術(shù)基因敲除技術(shù)蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)基因芯片及數(shù)據(jù)分析其他分子生物學(xué)技術(shù)2023/2/432023/2/44第一節(jié)基因表達(dá)研究技術(shù)1.基因表達(dá)系列分析技術(shù)（SAGE）SAGE是以DNA序列測(cè)定為基礎(chǔ)分析全基因組表達(dá)模式的技術(shù)。任何長(zhǎng)度超過(guò)9-10個(gè)堿基的核苷酸片段都可能代表一種特異性的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，因此，根據(jù)某個(gè)序列占總標(biāo)簽數(shù)的比例可分析所對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)頻率。LongSAGE技術(shù)。標(biāo)簽來(lái)自轉(zhuǎn)錄物3’端一段21bp的序列，可以進(jìn)行快速分析并與基因組序列數(shù)據(jù)相匹配。其原理與ShortSAGE方法類似，只是用了不同的IIS類標(biāo)簽酶（MmeI），并將程序做了相應(yīng)修改。2023/2/442023/2/45常規(guī)SAGE方法（shortSAGE）基本流程2023/2/46第一節(jié)基因表達(dá)研究技術(shù)2RNA的選擇性剪接技術(shù)RNA的選擇性剪接是指用不同的剪接方式從一個(gè)mRNA前體產(chǎn)生不同的mRNA剪接異構(gòu)體的過(guò)程?？煞譃椋浩胶饧羟?、5’選擇性剪切、3’選擇性剪切、外顯子遺漏型剪切及相互排斥性剪切。常用RT-PCR法研究某個(gè)基因是否存在選擇性剪切。2023/2/46果蠅Dscam基因可以通過(guò)可變剪接產(chǎn)生38000多種可能的mRNA異構(gòu)體2023/2/47選擇性剪切的不同類型RT-PCR檢測(cè)5個(gè)擬南芥轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基因的選擇性剪切2023/2/48第一節(jié)基因表達(dá)研究技術(shù)3.原位雜交技術(shù)原位雜交（ISH）是用標(biāo)記的核酸探針，經(jīng)放射自顯影或非放射檢測(cè)體系，在組織、細(xì)胞、間期核及染色體上對(duì)核酸進(jìn)行定位和相對(duì)定量研究的一種手段，分為RNA和染色體原位雜交兩大類。RNA原位雜交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）標(biāo)記的特異性探針與被固定的組織切片反應(yīng)，若細(xì)胞中存在與探針互補(bǔ)的mRNA分子，兩者雜交產(chǎn)生雙鏈RNA，可通過(guò)放射性標(biāo)記或經(jīng)酶促免疫顯色，對(duì)該基因的表達(dá)產(chǎn)物做出定性定量分析。2023/2/482023/2/49mRNA的互補(bǔ)鏈，雜交信號(hào)集中于纖維細(xì)胞中。負(fù)對(duì)照，mRNA的同義鏈,無(wú)雜交信號(hào)正對(duì)照，UBQ10雜交信號(hào)遍布于整個(gè)胚珠2023/2/410第一節(jié)基因表達(dá)研究技術(shù)3.原位雜交技術(shù)熒光原位雜交（FISH）首先對(duì)寡核苷酸探針做特殊的修飾和標(biāo)記，然后用原位雜交法與靶染色體或DNA上特定的序列結(jié)合，再通過(guò)與熒光素分子相耦聯(lián)的單克隆抗體來(lái)確定該DNA序列在染色體上的位置。2023/2/4102023/2/411第一節(jié)基因表達(dá)研究技術(shù)4.基因定點(diǎn)突變技術(shù)通過(guò)改變基因特定位點(diǎn)核苷酸序列來(lái)改變所編碼的氨基酸序列，用于研究某個(gè)（些）氨基酸殘基對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、催化活性以及結(jié)合配體能力的影響，也可用于改造DNA調(diào)控元件特征序列、修飾表達(dá)載體、引入新的酶切位點(diǎn)等。目前，主要采用兩種PCR方法，重疊延伸技術(shù)和大引物誘變法，在基因序列中進(jìn)行定點(diǎn)突變。2023/2/4112023/2/412寡核苷酸介導(dǎo)的DNA突變技術(shù)2023/2/413重疊延伸介導(dǎo)的定點(diǎn)誘變大引物誘變法2023/2/414第二節(jié)基因敲除技術(shù)1.基本原理經(jīng)典遺傳學(xué)（Forwardgenetics）是從一個(gè)突變體的表型出發(fā)，研究其基因型，進(jìn)而找出該基因的編碼序列?，F(xiàn)代遺傳學(xué)（Reversegenetics，反向遺傳學(xué)）首先從基因序列出發(fā)，推測(cè)其表現(xiàn)基因敲除（geneknock-out）又稱基因打靶，通過(guò)外源DNA與染色體DNA之間的同源重組，進(jìn)行精確的定點(diǎn)修飾和基因改造，具有專一性強(qiáng)、染色體DNA可與目的片段共同穩(wěn)定遺傳等特點(diǎn)。型，進(jìn)而推導(dǎo)出該基因的功能。2023/2/4141.基本原理基因敲除分為完全基因敲除和條件型基因敲除（又稱不完全基因敲除）兩種。完全基因敲除是指通過(guò)同源重組法完全消除細(xì)胞或者動(dòng)物個(gè)體中的靶基因活性條件型基因敲除是指通過(guò)定位重組系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)特定時(shí)間和空間的基因敲除。噬菌體的Cre/Loxp系統(tǒng)、Gin/Gix系統(tǒng)、酵母細(xì)胞的FLP/FRT系統(tǒng)和R/RS系統(tǒng)是現(xiàn)階段常用的四種定位重組系統(tǒng)，尤以Cre/Loxp系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。2023/2/4152023/2/4152023/2/416用取代型（a）或插入型（b）載體進(jìn)行完全基因敲除實(shí)驗(yàn)2023/2/417正負(fù)篩選法（PNS法）篩選已發(fā)生同源重組的細(xì)胞第二節(jié)基因敲除技術(shù)2.高等動(dòng)物基因敲除技術(shù)真核生物基因敲除的技術(shù)路線主要包括構(gòu)建重組基因載體，用電穿孔、顯微注射等方法把重組DNA導(dǎo)入胚胎干細(xì)胞純系中，使外源DNA與胚胎干細(xì)胞基因組中相應(yīng)部分發(fā)生同源重組，將重組載體中的DNA序列整合到內(nèi)源基因組中并得以表達(dá)。顯微注射命中率較高，技術(shù)難度相對(duì)大些。電穿孔法命中率比顯微注射低，操作使用方便。胚胎干細(xì)胞（ES細(xì)胞）分離和體外培養(yǎng)的成功奠定了哺乳動(dòng)物基因敲除的技術(shù)基礎(chǔ)。2023/2/4182023/2/4182023/2/419模式動(dòng)物小鼠中完全基因敲除的主要技術(shù)策略與應(yīng)用。第二節(jié)基因敲除技術(shù)3.植物基因敲除技術(shù)T-DNA插入失活技術(shù)是目前在植物中使用最為廣泛的基因敲除手段。利用根癌農(nóng)桿菌T-DNA介導(dǎo)轉(zhuǎn)化，將帶有報(bào)告基因的DNA序列整合到基因組DNA上，如果這段DNA插入到目的基因內(nèi)部或附近，就會(huì)影響該基因的表達(dá)，從而使該基因“失活”。2023/2/4202023/2/4202023/2/421植物基因敲除及突變體篩選a.引物設(shè)計(jì)。LP和RP分別代表插入基因兩端的引物，LB是指載體上的一段引物，目的基因片段(設(shè)為900bp)。旁鄰序列是經(jīng)測(cè)序后獲得的DNA序列。

b.PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果。分別代表野生型、雜合子和純合子PCR條帶。第三節(jié)蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)1.酵母單雜交系統(tǒng)酵母單雜交系統(tǒng)是上世紀(jì)90年代中發(fā)展起來(lái)的研究DNA-蛋白質(zhì)之間相互作用的新技術(shù)，可識(shí)別穩(wěn)定結(jié)合于DNA上的蛋白質(zhì)，在酵母細(xì)胞內(nèi)研究真核生物中DNA-蛋白質(zhì)之間的相互作用，并通過(guò)篩選DNA文庫(kù)直接獲得靶序列相互作用蛋白的編碼基因。將已知順式作用元件構(gòu)建到最基本啟動(dòng)子（Pmin）的上游，把報(bào)告基因連接到Pmin下游。將編碼待測(cè)轉(zhuǎn)錄因子cDNA與已知酵母轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（AD）融合表達(dá)載體導(dǎo)入酵母細(xì)胞，該基因產(chǎn)物如果能夠與順式作用元件相結(jié)合，就能激活Pmin啟動(dòng)子，使報(bào)告基因得到表達(dá)。2023/2/4222023/2/4222023/2/423從擬南芥cDNA文庫(kù)中篩選與順式元件DRE結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子示意圖。

酵母單雜交的基本原理示意圖第三節(jié)蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)2.酵母雙雜交系統(tǒng)真核生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子具有組件式結(jié)構(gòu)（modular）特征，這些蛋白往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域，其中DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（bindingdomain，BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activationdomain，AD）是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必須的。BD能與特定基因啟動(dòng)區(qū)結(jié)合，但不能激活基因轉(zhuǎn)錄，由不同轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的BD和AD所形成的雜合蛋白卻能行使激活轉(zhuǎn)錄的功能。2023/2/4242023/2/4242023/2/425

酵母雙雜交的基本原理示意圖第三節(jié)蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)3.體外蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)FarWestern印跡技術(shù)用32P標(biāo)記的體外表達(dá)蛋白作探針,直接檢測(cè)與該蛋白發(fā)生相互作用的蛋白或表達(dá)該蛋白的cDNA。2023/2/4262023/2/426第三節(jié)蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)3.體外蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)GST融合蛋白沉降技術(shù)利用GST對(duì)谷胱甘肽偶聯(lián)的瓊脂糖球珠的親和性，從混合蛋白質(zhì)樣品中純化得到相互作用蛋白。2023/2/4272023/2/427第三節(jié)蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)3.體外蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)蛋白質(zhì)芯片技術(shù)蛋白質(zhì)芯片可以用來(lái)大規(guī)模篩選蛋白之間的相互作用。將熒光標(biāo)記的探針蛋白與蛋白質(zhì)芯片孵育，洗脫非特異性結(jié)合的蛋白后，可以通過(guò)掃描芯片上的熒光點(diǎn)檢測(cè)到穩(wěn)定的相互作用蛋白點(diǎn)。2023/2/4282023/2/428第三節(jié)蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)3.體外蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)等離子表面共振技術(shù)將誘餌蛋白結(jié)合于葡聚糖表面并固定于納米級(jí)厚度的金屬膜上。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物經(jīng)過(guò)時(shí)，如果有蛋白質(zhì)同“誘餌”蛋白發(fā)生相互作用，那么兩者的結(jié)合將使金屬膜表面的折射率上升，導(dǎo)致共振角度的改變。2023/2/4292023/2/429第三節(jié)蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)3.體外蛋白質(zhì)相互作用技術(shù)免疫共沉淀技術(shù)將靶蛋白的抗體連接到固體基質(zhì)上，再將可能與靶蛋白發(fā)生相互作用的待篩選蛋白加入反應(yīng)體系中，用低離心力沉淀或微膜過(guò)濾法在固體基質(zhì)和抗體的共同作用下將蛋白復(fù)合物沉淀到試管的底部或微膜上。2023/2/4302023/2/430第三節(jié)蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)4.細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用研究——熒光共振能量轉(zhuǎn)移法（FRET）FRET熒光能量轉(zhuǎn)移有三個(gè)基本條件：給體與受體在合適的距離（1～10nm）；給體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有一定的重疊（這是能量匹配的條件）；給體與受體的偶極具有一定的空間取向（這是偶極-偶極耦合作用的條件）。2023/2/4312023/2/431第三節(jié)蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)5.RNAi（RNA干涉）技術(shù)及其應(yīng)用RNAi技術(shù)利用雙鏈小RNA高效、特異性降解細(xì)胞內(nèi)同源mRNA從而阻斷靶基因表達(dá)，使細(xì)胞出現(xiàn)靶基因缺失的表型。RNAi的命名來(lái)源于安德魯·法爾1998年在《自然》雜志上的論文。研究發(fā)現(xiàn)，雙鏈RNA是RNAi的觸發(fā)物，引發(fā)與之互補(bǔ)的單鏈RNA（ssRNA,single-strandedRNA）的降解。經(jīng)過(guò)Dicer（一種具有RNAaseIII活性的核酸酶）的加工，細(xì)胞中較長(zhǎng)的雙鏈RNA（30個(gè)核苷酸以上）首先被降解形成21～25個(gè)核苷酸的小分子干擾核糖核酸（siRNA，shortinterferingRNA），并有效定位目標(biāo)mRNA。2023/2/4322023/2/4322023/2/433

RNAi作用機(jī)制示意圖。第三節(jié)蛋白質(zhì)及RNA相互作用技術(shù)5.RNAi（RNA干涉）技術(shù)及其應(yīng)用siRNA是引發(fā)轉(zhuǎn)錄后基因沉默中序列特異性RNA降解的重要中間媒介，它具有特殊的結(jié)構(gòu)特征，即5’端磷酸基團(tuán)和3’端的羥基，其兩條鏈的3’端各有兩個(gè)堿基突出于末端。由siRNA中的反義鏈參與指導(dǎo)合成被稱為RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）的核蛋白體，再由RISC介導(dǎo)切割目的mRNA分子中與siRNA反義鏈互補(bǔ)的區(qū)域，從而實(shí)現(xiàn)干擾靶基因表達(dá)的功能。2023/2/4342023/2/434第四節(jié)基因芯片及數(shù)據(jù)分析基因芯片及數(shù)據(jù)分析基因芯片（DNAchip），又稱DNA微陣列（DNAmicroarray）技術(shù)是能同時(shí)監(jiān)測(cè)大量靶基因表達(dá)的實(shí)驗(yàn)手段，從而迅速準(zhǔn)確地在基因組水平上闡述不同生物組織或細(xì)胞中各種轉(zhuǎn)錄本的變化規(guī)律。2023/2/4352023/2/4352023/2/436基因芯片及數(shù)據(jù)分析簡(jiǎn)易基因芯片使用機(jī)械臂把DNA片段點(diǎn)在玻璃片或尼龍膜上，經(jīng)過(guò)物理吸附作用達(dá)到固定化。也可以直接在玻璃板表面進(jìn)行化學(xué)合成，從而得到寡聚核苷酸芯片。將芯片與待研究的cDNA

或其它樣品雜交，經(jīng)過(guò)計(jì)算機(jī)掃描和數(shù)據(jù)處理，便可以觀察到大規(guī)模的基因群在不同組織或同一組織不同發(fā)育時(shí)期或不同生理?xiàng)l件下的表達(dá)模式?；蛐酒捎糜谶M(jìn)行基因診斷。先建立正常人特定組織、器官的基因芯片，給出標(biāo)準(zhǔn)雜交信號(hào)圖，用可疑病人的cDNA做探針與之雜交，確定哪些基因的表達(dá)受抑制或激活。2023/2/436第五節(jié)其他分子生物學(xué)技術(shù)1.凝膠滯緩實(shí)驗(yàn)?zāi)z滯緩試驗(yàn)（gelretardationassay），又叫作DNA遷移率變動(dòng)試驗(yàn)（DNAmobilityshiftassay），是用于體外研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用的一種特殊的凝膠電泳技術(shù)。在凝膠電泳中，由于電場(chǎng)的作用，裸露的DNA朝正電極移動(dòng)的距離與其分子量的對(duì)數(shù)成反比。如果此時(shí)DNA分子與某種蛋白質(zhì)相結(jié)合，那么，由于分子量增大，它在凝膠中的遷移作用便會(huì)受到阻滯，在特定電壓和時(shí)間內(nèi)朝正電極移動(dòng)的距離也就相應(yīng)縮短了。2023/2/4372023/2/4