專題1-第1節(jié)-DNA重組技術(shù)的基本工具

專題4

基因工程第1節(jié)基因工程的理論基礎(chǔ)和技術(shù)2023/2/5

基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施工的，因此又叫做DNA重組技術(shù)。基因工程的別名：操作水平：原理：結(jié)果：基因重組重組基因通過基因工程使大腸桿菌生產(chǎn)人胰島素。

一基因工程理論基礎(chǔ)（1）DNA是主要的遺傳物質(zhì)；基因是DNA分子上具有遺傳功能的DNA片段；染色體（染色質(zhì)）是由DNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成的（2）DNA有規(guī)則的雙螺旋結(jié)構(gòu)，進(jìn)行半保留復(fù)制；

一基因工程理論基礎(chǔ)1’2’3’4’5’脫氧核苷酸的結(jié)構(gòu)2023/2/5磷酸二酯鍵DNA分子結(jié)構(gòu)DNA分子進(jìn)行半保留復(fù)制（3）中心法則的提出和遺傳密碼的破譯。

一基因工程理論基礎(chǔ)基因的表達(dá)包括遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和遺傳信息的翻譯基因工程培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟：關(guān)鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)提取出來關(guān)鍵步驟二：抗蟲基因與運(yùn)載體DNA連接關(guān)鍵步驟三：抗蟲基因?qū)胧荏w(棉花)細(xì)胞解決培育抗蟲棉的關(guān)鍵步驟需要哪些工具？關(guān)鍵步驟一的工具：關(guān)鍵步驟二的工具：關(guān)鍵步驟三的工具：基因的剪刀——限制性內(nèi)切酶基因的針線——DNA連接酶基因的運(yùn)載工具——運(yùn)載體二基因工程操作的技術(shù)DNA分子的切割技術(shù)DNA分子的運(yùn)載工具DNA分子的連接技術(shù)別名來源種類作用作用結(jié)果閱讀課本“限制性核酸內(nèi)切酶——分子手術(shù)刀”的相關(guān)內(nèi)容，填寫下表自主學(xué)習(xí)一DNA分子切割技術(shù)主要從原核生物中分離純化而來限制酶或限制性內(nèi)切酶已經(jīng)分離出大約4000種，如EcoRI、SmaI限制酶2023/2/5限制酶存在于原核生物中的作用是什么？

限制酶就是細(xì)菌的一種防御性工具，當(dāng)外源DNA侵入時(shí)，會(huì)利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA，而對自身DNA不起作用，從而達(dá)到保護(hù)自身的目的。2023/2/516仔細(xì)觀察各限制酶識(shí)別的特定序列有何特點(diǎn)？限制酶的識(shí)別序列限制酶所識(shí)別的序列的特點(diǎn)是：呈現(xiàn)堿基互補(bǔ)對稱，無論是偶數(shù)個(gè)堿基還是奇數(shù)個(gè)堿基，都可以找到一條中心軸線，中軸線兩側(cè)的雙鏈DNA上的堿基是反向?qū)ΨQ重復(fù)排列的，稱為回文序列2023/2/5別名來源種類作用作用結(jié)果閱讀課本“限制性核酸內(nèi)切酶——分子手術(shù)刀”的相關(guān)內(nèi)容，填寫下表自主學(xué)習(xí)一主要從原核生物中分離純化而來已經(jīng)分離出大約4000種，如EcoRI、SmaI限制酶1、識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列限制酶或限制性內(nèi)切酶2023/2/5G1’2’3’4’5’1’2’3’4’5’A3’,5’-磷酸二酯鍵3’端5’端3’端5’端限制酶的作用部位——磷酸二酯鍵2023/2/5中軸線在G與A之間切割大腸桿菌的一種限制酶(EcoRⅠ)只能識(shí)別GAATTC序列，并在G脫氧核苷酸和A脫氧核苷酸之間切開。EcoRI限制酶的作用2023/2/5

黏性末端黏性末端EcoRI限制酶的切割

被限制酶切開的DNA兩條單鏈的切口，帶有幾個(gè)伸出的核苷酸，他們之間正好互補(bǔ)配對，這樣的切口叫黏性末端。2023/2/5

SmaI只能識(shí)別CCCGGG序列，并在C脫氧核苷酸和G脫氧核苷酸之間切開。中軸線SmaI限制酶的作用在G與C之間切割2023/2/5平末端平末端SmaI限制酶的切割當(dāng)限制酶從識(shí)別序列的中心軸線處切開時(shí)，切開的DNA兩條單鏈的切口，是平整的，這樣的切口叫平末端。2023/2/5別名來源種類作用作用結(jié)果閱讀資料P2頁“限制性核酸內(nèi)切酶——分子手術(shù)刀”的相關(guān)內(nèi)容，填寫下表自主學(xué)習(xí)一主要從原核生物中分離純化而來大約4000種，例如EcoRI、SmaI限制酶1.識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列2.使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開。形成兩種末端：黏性末端或平末端限制酶或限制性內(nèi)切酶（專一性）2023/2/5CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAG練習(xí)使用EcoRI剪切目的基因CTTCATGAATTCCCTAAGAAGTACTTAAGGGATTGGCATCTTAAAATTCCGTAG

目的基因黏性末端2023/2/5★延伸：在一段DNA序列中獲得某個(gè)特定性狀的基因片段必須要用限制酶切幾次？共產(chǎn)生幾個(gè)黏性末端或平末端？酶切兩次共產(chǎn)生四個(gè)黏性末端或平末端運(yùn)載體作用運(yùn)載體的必要條件運(yùn)載體種類閱讀課本“分子運(yùn)輸車——運(yùn)載體”的相關(guān)內(nèi)容，填寫下表自主學(xué)習(xí)二1）具多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接。2）能夠在受體細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定地保存。3）具有某些標(biāo)記基因，便于進(jìn)行鑒定和選擇。4）必須是安全的，對受體細(xì)胞無害。5）載體DNA應(yīng)大小適中，以便于提取和操作1）作為運(yùn)載工具，將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞中2）在受體細(xì)胞內(nèi)對目的基因進(jìn)行大量復(fù)制①細(xì)菌的質(zhì)粒②病毒：λ噬菌體衍生物、動(dòng)植物病毒等。2023/2/5擬核有標(biāo)記基因的存在，可用含青霉素的培養(yǎng)基鑒別。能復(fù)制并帶著插入的目的基因一起復(fù)制質(zhì)粒：是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡單、獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，并具有自我復(fù)制能力的很小的雙鏈環(huán)狀DNA分子。最常用運(yùn)載體——質(zhì)粒有切割位點(diǎn)2023/2/5把切下來的DNA片段拼接成新的DNA，即將脫氧核糖和磷酸連接起來催化形成磷酸二酯鍵DNA連接酶的作用2023/2/529類型來源功能相同點(diǎn)差別E·coliDNA連接酶T4DNA連接酶大腸桿菌T4噬菌體催化形成磷酸二酯鍵只能連接黏性末端能連接黏性末端和平末端(效率較低)分子縫合針——DNA連接酶的類型2023/2/5兩DNA片段要具有互補(bǔ)的黏性末端才能拼起來DNA連接酶的縫合作用可把黏性末端之間的縫隙“縫合”起來，注意：DNA連接酶可連接雙鏈DNA中的DNA單鏈缺口，但不能連接單鏈DNA！2023/2/5DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎？T4DNA連接酶還可把平末端之間的縫隙“縫合”起來，但效率較低DNA連接酶的縫合作用2023/2/5AATTAATTAATTDNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶DNA聚合酶的作用2023/2/5DNA連接酶DNA聚合酶相同點(diǎn)作用實(shí)質(zhì)化學(xué)本質(zhì)不同點(diǎn)模板作用對象作用結(jié)果 用途都能催化形成磷酸二酯鍵都是蛋白質(zhì)

不需要需要形成完整的重組DNA分子形成DNA的一條鏈基因工程DNA復(fù)制DNA連接酶與DNA聚合酶的比較只能將單個(gè)核苷酸連接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯鍵在兩個(gè)DNA片段之間形成磷酸二酯鍵例：限制性內(nèi)切酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—G↓GATCC—，限制性內(nèi)切酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—↓GATC—。在質(zhì)粒上有酶Ⅰ的一個(gè)切點(diǎn)，在目的基因的兩側(cè)各有一個(gè)酶Ⅱ的切點(diǎn)。（1）請畫出質(zhì)粒被限制酶Ⅰ切割后所形成的黏性末端。（2）請畫出目的基因兩側(cè)被限制酶Ⅱ切割后所形成的黏性末端。（3）在DNA連接酶作用下，上述兩種不同限制酶切割后形成的黏性末端能否連接？為什么？

可以連接。因?yàn)橛缮鲜鰞煞N不同限制酶切割后形成相同的黏性末端（或是可以互補(bǔ)的）小試身手可連接：具有互補(bǔ)的黏性末端的DNA末端；同一種限制性內(nèi)切酶切割得到的DNA末端2023/2/5限制酶在DNA的任何部位都能將DNA切開嗎？以下是四種不同限制酶切割形成的DNA片段：（1）...CTGCA(2)...AC(3)...GC(4)...G

...G...TG...CG...CTTAA

(5)G...(6)...GC(7)GT...(8)AATTC...ACGTC......CGCA...G...你能用DNA連接酶將它們連接起來嗎？_____和_____能連接形成__________________和_____能連接形成__________________和_____能連接形成__________________和_____能連接形成_____________15...CTGCAG......GACGTC...27...ACGT......TGCA...36...GCGC......CGCG...48...GAATTC......CTTAAG...轉(zhuǎn)基因抗蟲棉培育流程核心步驟植物：農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法實(shí)驗(yàn)分析：小結(jié)基因工程的工具限制酶來源：主要存在于原核生物中特點(diǎn)：具有專一性(識(shí)別序列)功能：識(shí)別；切開DNA分子的磷酸二酯鍵結(jié)果：形成黏性末端或平末端DNA連接酶功能：連接磷酸二酯鍵種類E.coliDNA連接酶T4DNA連接酶載體具備的條件結(jié)構(gòu)簡單,大小適中能在受體細(xì)胞中自我復(fù)制并穩(wěn)定存在具一個(gè)至多個(gè)限制酶切位點(diǎn)具標(biāo)記基因安全無害種類：質(zhì)粒、λ噬菌體衍生物、動(dòng)植物病毒1.判斷質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接DNA連接酶使黏性末段的堿基之間形成氫鍵練習(xí)×√×1）以下說法正確的是（）

A、所有的限制酶只能識(shí)別一種特定的核苷酸序列

B、質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體

C、運(yùn)載體必須具備的條件之一是：具有多個(gè)限制酶切點(diǎn)，以便與外源基因連接

D、基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來C練習(xí)2）不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是

A、能復(fù)制（）

B、