第十三單倍體誘導(dǎo)和育種細(xì)胞工程

第十三章單倍體誘導(dǎo)和育種

主要內(nèi)容植物小孢子發(fā)育過程花粉和花藥培養(yǎng)條件花粉和花藥培養(yǎng)方法單倍體誘導(dǎo)的應(yīng)用植物單倍體的概念和來源

相關(guān)概念植物減數(shù)分裂后形成的雌雄配子，其染色體數(shù)只有體細(xì)胞的一半，將這具有單套染色體的細(xì)胞稱為單倍體細(xì)胞。單倍體細(xì)胞在人工離體條件下培養(yǎng)，使其單性發(fā)育成植物體，這種只具有單套染色體的植物稱為單倍體植物。單倍體的主要類型

具有來自二倍體染色體數(shù)目一半的單倍體（也稱一倍體）和具有來自多倍體種染色體數(shù)目一半的多倍單倍體。單倍體的一般概念是適用于起源于孢子體發(fā)生和含有一半染色體的任何植物。單倍體育種：將具有單套染色體的單倍體植物，經(jīng)人工染色體加倍，使其成為純和二倍體，從中篩選優(yōu)良個體，直接繁育成新品種，或具有單一優(yōu)良性狀的個體，作為雜交育種的原始材料。人工誘導(dǎo)單倍體發(fā)生形式

孤雄生殖－離體培養(yǎng)花藥或花粉，誘發(fā)小孢子單性發(fā)育成單倍體植物。（廣泛使用）孤雌生殖－離體培養(yǎng)未受精的子房或胚珠，誘發(fā)卵細(xì)胞單性發(fā)育成植物體。（誘發(fā)頻率低）第一節(jié)植物小孢子發(fā)育過程藥隔：花藥中部，由薄壁細(xì)胞構(gòu)成，內(nèi)有維管束花藥花粉囊（4或2）囊壁花粉粒表皮纖維層花藥的結(jié)構(gòu)花粉母細(xì)胞到成熟花粉粒過程1）四分體孢子時期：（第一期）花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂四分體（未成熟的花粉粒、小孢子，n）2）單核期（第二期）四分體后，小孢子分開，中央有核液泡增大，液泡將花粉粒擠向一邊單核早期：細(xì)胞小，核大，無液泡，居中，單核中期：細(xì)胞大，核大，有液泡，居中，單核晚期：液泡增大，核靠邊（單核靠邊期）

3）雙核期（第三期）核：大核：營養(yǎng)細(xì)胞小核：生殖細(xì)胞—分裂--兩個精子（雄配子）三核花粉。

多數(shù)在單核靠邊期培養(yǎng)為最佳。一、植物的花粉發(fā)育②花粉粒的形成花粉母細(xì)胞（小孢子母細(xì)胞）減數(shù)分裂①經(jīng)歷時期：四分體時期、單核期、雙核期四分體時期（進(jìn)入單核期）有絲分裂單核靠邊期(小孢子)單核居中期(小孢子)小孢子（單核花粉粒）精子精子有絲分裂花粉管細(xì)胞核生殖細(xì)胞核生殖細(xì)胞營養(yǎng)細(xì)胞雙核期兩個精子和一個營養(yǎng)核的基因型相同1花粉母細(xì)胞4個小孢子減分有分4個花粉管細(xì)胞核4個生殖細(xì)胞核有分8個精子花粉粒類型一個成熟的花粉粒即為雄配子體，有兩種情況：二核花粉粒:成熟的花粉粒中，只含花粉管細(xì)胞核和生殖細(xì)胞核。（精子在花粉管中形成）三核花粉粒:有些植物的花粉，在成熟前，生殖細(xì)胞進(jìn)行一次有絲分裂，形成兩個精子，這樣的花粉在成熟時，含有一個營養(yǎng)核和兩個精子。第二節(jié)花藥和花粉培養(yǎng)一、花藥培養(yǎng)

1964年：Guha&Maheshwari南洋金花花藥培養(yǎng)發(fā)育成胚；1967年：Bourgin&Nitsch花藥培養(yǎng)獲得煙草植株；1973年：我國首次報道了小麥花藥培養(yǎng)獲得再生植株；目前：許多農(nóng)作物及經(jīng)濟(jì)植物通過花粉培養(yǎng)都能誘導(dǎo)成植株。（一）再生方式1.器官再生：容易發(fā)生倍性的變化。2.胚狀體再生特點(diǎn)：

（1）兩極性

（2）與外植體維管束無聯(lián)系花藥再生植株的方式

（二）材料的選取最常用的方法有醋酸洋紅法（三）材料的消毒1、酒精處理①花蕾用體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精浸泡30秒，立即取出。②無菌水清洗③無菌吸水紙吸干花蕾表面的水分2、消毒液處理（四）接種和培養(yǎng)①放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的氯化汞溶液中2-4分鐘（也可質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的次氯酸鈣溶液或飽和漂白粉溶液）②無菌水沖洗3-5次用于培養(yǎng)花藥，實(shí)際上多數(shù)未熟，由于它的外面有花萼、花瓣或穎片保護(hù)，通常處于無菌狀態(tài)，所以只要將整個花蕾或幼穗消毒即可。在無菌條件下除去萼片和花瓣用鑷子取出花藥②要徹底去除花絲，因為與花絲相連的花藥不利于愈傷組織或胚狀體的形成立即將花藥接種于培養(yǎng)基上，通常每瓶接種花藥7-10個。1、剝?nèi)』ㄋ帰傥饟p傷花藥，以免誘導(dǎo)出非花粉愈傷組織2、接種注意：①培養(yǎng)條件：溫度控制在25℃左右，不需要光照。幼小植株形成后才需要光照。

3、培養(yǎng)②培養(yǎng)：一般經(jīng)過20-30天培養(yǎng)后，會發(fā)現(xiàn)花藥開裂，長出愈傷組織或釋放出胚狀體長出愈傷組織則將愈傷組織及時轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上，以便進(jìn)一步分化出再生植株③注意：如果花藥開裂釋放出胚狀體，則一個花藥內(nèi)就會產(chǎn)生大量幼小植株，必須在花藥開裂后盡快將幼小植株分開，分別移植到新的培養(yǎng)基上，否則這些植株將很難分開。在花藥培養(yǎng)中，特別是通過愈傷組織形成的花粉植株，常常會出現(xiàn)染色體倍性的變化（主要原因是營養(yǎng)核和生殖核融合造成的）4、鑒定和篩選花藥培養(yǎng)的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：

1.不需要進(jìn)行游離花粉的處理。

2.不需要特殊的培養(yǎng)方法。缺點(diǎn)：

1.花藥體細(xì)胞形成二倍體植株。

2.對后代要進(jìn)行進(jìn)一步的篩選。二花粉培養(yǎng)（一）定義：指把花粉從花藥中分離出來，以單個花粉粒為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)，獲得單倍體植株的技術(shù)。花粉培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：1.排除了體細(xì)胞的影響。2.花粉較小，所需器皿和培養(yǎng)空間較小。3.花粉可以成為基因工程的受體?；ǚ叟囵B(yǎng)的缺點(diǎn)1.需要對花粉進(jìn)行收集（1）擠壓法（2）散落法（3）器械法2.需要特別的培養(yǎng)方法（二）裸子植物的花粉培養(yǎng)研究較少，容易發(fā)生突變常用植物有：麻黃；銀杏；紫杉；榧麻黃會自動裂開。銀杏和榧需收集后才能進(jìn)行。（三）被子植物的花粉培養(yǎng)較難進(jìn)行，需要特殊處理懸滴培養(yǎng)看護(hù)培養(yǎng)（濾紙）植板培養(yǎng)（混合瓊脂固體培養(yǎng)基）看護(hù)培養(yǎng)法

取出花粉，制成每ml含有20個花粉粒的細(xì)胞懸浮液?？醋o(hù)培養(yǎng)時，把花藥放在瓊脂培養(yǎng)基表面上，然后在每個花藥上覆蓋一小塊圓片濾紙。用移液管吸取1滴已準(zhǔn)備好的花粉粒懸浮液，滴在每個小圓片濾紙上培養(yǎng)，在25℃和一定光照強(qiáng)度下，大約一個月長出細(xì)胞群。由于完整的花藥發(fā)育過程釋放出有利于花粉發(fā)育的物質(zhì)，并通過濾紙供給花粉，促進(jìn)了花粉的發(fā)育。植板培養(yǎng)法含義：是將花粉懸浮液與融化的瓊脂培養(yǎng)基均勻混合后平鋪一薄層在培養(yǎng)皿底上的培養(yǎng)方法。該方法是Bergmann(1960年)首創(chuàng)。

特點(diǎn)：可以定點(diǎn)觀察；花粉粒外壁漲破，細(xì)胞團(tuán)被釋放出來。培養(yǎng)細(xì)胞氣體交換不暢。花藥材料的選取關(guān)鍵選取處于合適發(fā)育期的花粉，離體培養(yǎng)后才能啟動花粉發(fā)育。實(shí)踐表明，從減數(shù)分裂期至雙核期的花粉，均有可能誘導(dǎo)離體孤雄發(fā)育。大多數(shù)園藝植物的花粉培養(yǎng)，成功率最高的時期為單核期，或單核中晚期?；ǚ叟囵B(yǎng)選幼年樹花蕾取下花蕾（鏡檢）預(yù)培養(yǎng)數(shù)天取花藥接種分離花粉藥壁向花粉提供營養(yǎng)物質(zhì)；通過藥壁吸收、貯存和轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中的外源物質(zhì)低溫預(yù)處理消毒過濾離心再生圖1．單核中期的小孢子；圖2．花藥預(yù)培4d后，在液體培養(yǎng)基中的小孢子，A,活的；D,死的；圖3．分裂成兩個細(xì)胞的小孢子；圖4．分裂成兩個營養(yǎng)細(xì)胞和兩個生殖細(xì)胞的小孢子；圖5．分裂成4細(xì)胞的小孢子；圖6．分裂成8細(xì)胞的小孢子；圖7．分裂成多細(xì)胞團(tuán)；圖8．多細(xì)胞團(tuán)從萌發(fā)孔突出來，GA,萌發(fā)孔；圖9．球型胚；圖10．細(xì)胞從裂開的花粉溝突出來，PD,花粉溝；圖11．同時產(chǎn)生球型胚(GE)和愈傷組織（C）；圖12．肉眼可見愈傷組織；圖13．球型胚又愈傷化；圖14．愈傷組織上分化不定芽；圖15．發(fā)育成小苗。（四）小孢子母細(xì)胞培養(yǎng)目的：研究減數(shù)分裂和發(fā)育，獲得單倍體材料。分離困難進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，首先要解決的問題是怎樣快速有效地把小孢子從花藥中分離出來。對多數(shù)作為來說，小孢子分離體系還沒有建立起來。油菜小孢子培養(yǎng)：在含有13％蔗糖的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行研磨，洗滌，培養(yǎng)。第三節(jié)花藥和花粉的培養(yǎng)方法一、材料的選擇二、材料的預(yù)處理三、培養(yǎng)基四、接種和再生植株培育一、材料的選擇1.遺傳差異2.母本的生理狀態(tài)3.花粉的發(fā)育時期1.遺傳差異（1）種屬差異不同物種之間花藥培養(yǎng)的反應(yīng)存在很大的差異。同一屬內(nèi)不同種或品種之間也存在差異。容易誘導(dǎo)：煙草、水稻。不易誘導(dǎo)：郎氏煙草花粉。（2）基因型不同基因型植株的花藥對培養(yǎng)的反應(yīng)不同。

雜種比純種容易誘導(dǎo)?；ǚ叟囵B(yǎng)力（愈傷組織的誘導(dǎo)率、分化率、胚狀體誘導(dǎo)率、植株誘導(dǎo)率）是受多基因控制的數(shù)量性狀，因而隨著基因型的差異而有很大的變化。2.母本的生理狀態(tài)早期花蕾（生活力高）、健壯母本。氮素水平（饑餓狀態(tài)）高緯度、高海拔田間栽培3.花粉的發(fā)育時期花粉發(fā)育的任何時期都可以經(jīng)過培養(yǎng)產(chǎn)生愈傷組織或胚狀體，花粉發(fā)育的過程中，只有某一個時期對離體刺激最敏感。小孢子發(fā)育時期：單核早期單核居中期單核靠邊期雙核期三核期

1.小孢子不同發(fā)育時期對胚狀體和愈傷組織誘導(dǎo)率不同。2.不同植物種類，誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生和愈傷組織形成，均有其適宜的小孢子發(fā)育期對大多數(shù)植物來說，單核中期和晚期是誘導(dǎo)花粉胚或愈傷組織的最佳時期，尤其單核靠邊期是誘導(dǎo)的關(guān)鍵時刻。舉例：玉米：單核中期煙草：單核中期至雙核早期

Sunderland(1971)對煙草不同花粉發(fā)育時期的培養(yǎng)反應(yīng)進(jìn)行了觀察：花粉發(fā)育時期胚狀體誘導(dǎo)頻率(％)減數(shù)分裂期0單核早期14單核晚期40雙核早期55花藥在接種以前一般需先用醋酸洋紅染色壓片鏡檢，以確定花粉的發(fā)育時期，并找出花粉的發(fā)育時期與花蕾或幼穗大小、顏色等形態(tài)學(xué)性狀的相關(guān)性，便于取材。外觀依據(jù)花蕾未開放；花蕾長度。在水稻中，以單核靠邊期的花粉對誘導(dǎo)單倍體植株較為適宜，在外部形態(tài)上可根據(jù)葉枕距為5-15cm，穎片淡黃綠色、雄蕊長度接近穎片長度的1/2這些條件鑒定。二、材料的預(yù)處理1.低溫處理2.高溫處理3.離心處理4.激光照射5.乙烯利處理6.甘露醇處理接種前后對花藥采用高、低溫、高糖等逆境預(yù)處理，能使綠苗產(chǎn)量大量增加。逆境預(yù)處理促進(jìn)花粉脫分化和再分化1.低溫處理低溫預(yù)處理是指在接種之前將材料用0℃以上低溫處理一段時間后再行接種；低溫預(yù)處理可以提高花粉胚的誘導(dǎo)。各種植物要求預(yù)處理的溫度和時間不同。以1-5℃預(yù)低溫處理小麥幼穗，能提高花粉愈傷組織的產(chǎn)量。在4℃下冷凍石刁柏花蕾，預(yù)處理4天、8天和12天，愈傷組織誘導(dǎo)率比室溫對照分別提高2.4倍、1.9和1.5倍。

關(guān)于低溫的作用機(jī)理，不同的研究者提出了不同的解釋。（1）低溫條件下改變了小孢子第一次有絲分裂的軸向，從而促使小孢子發(fā)育啟動（2）冷處理的作用，在于其能夠使絕大多數(shù)花粉保持存活并完成誘導(dǎo)過程。但總的看來，其結(jié)果多數(shù)是小孢子改變原來的發(fā)育方向，而轉(zhuǎn)向胚胎發(fā)生和孢子體發(fā)育2.高溫處理引起微管的溶解，使紡錘體解體，導(dǎo)致小孢子核的不正常分裂。培養(yǎng)溫度是影響花藥反應(yīng)的一個重要因素。小麥要求先高溫培養(yǎng)64天之后，再轉(zhuǎn)入28-30℃下培養(yǎng)。一直高溫培養(yǎng)效果并不好。較高的溫度雖能誘導(dǎo)較高頻率的花粉愈傷組織，但愈傷組織分化白化苗的頻率也高?？刂婆囵B(yǎng)溫度仍是減少白化苗的一個有效措施。3.離心處理單核后期10000-11000r/min，30min原因：花粉孤立；改變軸向4.激光照射促進(jìn)愈傷組織芽分化5.乙烯利處理1.Bennert:促進(jìn)花粉細(xì)胞核分裂2.王敬駒：形成愈傷組織6.甘露醇處理實(shí)驗：（1）甘露醇：預(yù)培養(yǎng)（2）甘露醇+蔗糖（3）蔗糖原因：造成碳饑餓，維持滲透壓三、培養(yǎng)基（一）基本培養(yǎng)基（二）條件培養(yǎng)基（一）基本培養(yǎng)基1.常用的培養(yǎng)基優(yōu)MS、nitsch、B5、N6等培養(yǎng)基。2.MS培養(yǎng)基用得最廣泛。3.禾本類植物N6培養(yǎng)基效果較好。我國科學(xué)工作者對水稻、小麥的花藥培養(yǎng)基做了改進(jìn)，研制出N6培養(yǎng)基。在N6培養(yǎng)基上，水稻花粉的出愈率大幅度提高。4.馬鈴薯提取液為基本成分的馬鈴薯培養(yǎng)基，現(xiàn)在被廣泛地應(yīng)用于小麥花藥培養(yǎng)，效果良好。（1）碳源蔗糖最常用，高濃度利于誘導(dǎo)愈傷組織，抑制花藥體細(xì)胞增殖。作用：碳源和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)。煙草的最適蔗糖濃度為3％，水稻為3％-6％，玉米則為12％-15％。朱至清等(1990)報道在過濾滅菌的條件下，若以0.21mg/L葡萄糖取代液體培養(yǎng)基中同等濃度的蔗糖，小麥花粉胚的誘導(dǎo)頻率可增加2-10倍。麥芽糖也有效果。（2）激素往往是必需的，常用細(xì)胞分裂素，配合生長素因植物種類差異而選擇。一般在禾本科植物中，常用1-5mg/L2,4-D或NAA誘導(dǎo)花粉愈傷組織形成，再將愈傷組織轉(zhuǎn)移至降低或去除生長素或補(bǔ)加細(xì)胞分裂素類物質(zhì)的分化培養(yǎng)基上，以誘導(dǎo)器官分化和再生植株形成。（3）附加成分谷氨酰胺，活性炭等誘導(dǎo)愈傷組織Vc，聚乙烯吡咯烷酮等抗氧化劑防止褐化（二）條件培養(yǎng)基定義：組織培養(yǎng)物產(chǎn)生分泌物進(jìn)入培養(yǎng)基，使得培養(yǎng)基條件化，成為條件培養(yǎng)基。條件培養(yǎng)基可以促進(jìn)培養(yǎng)細(xì)胞的分裂和分化?；ㄋ幒妥臃恐参锝M織在培養(yǎng)的過程中分泌的某些物資對細(xì)胞的分裂和生長普遍起作用。四、接種和再生植株培育1.材料的滅菌處理2.培養(yǎng)條件（溫度和光照）3.花粉植株的培育4.花粉植株的鑒定5.單倍體植物的染色體加倍1.材料的滅菌處理1）漂白粉2）次氯酸鈉3）升汞4）沖洗5）接種：密度2.培養(yǎng)條件（溫度和光照）較高的溫度：28－30℃不同的植物光照不一樣3.花粉植株的培育植株產(chǎn)生方式：花粉胚和愈傷組織誘導(dǎo)（1）花粉胚誘導(dǎo)移栽困難，注意保濕和遮陰（2）愈傷組織誘導(dǎo)

誘導(dǎo)愈傷組織需要注意溫度總結(jié)影響花粉花藥培養(yǎng)的因素1基因型2植株生長條件和生理狀態(tài)3花粉發(fā)育時期4預(yù)處理5培養(yǎng)基6培養(yǎng)條件－光照（黑暗條件下，小植株能從花藥培養(yǎng)中發(fā)育出來。光條件下花藥能培養(yǎng)出更多更壯的苗）7花藥壁因素4.單倍體的鑒定（1）花粉單倍體植株的鑒定必要性1）體細(xì)胞的干擾：花藥的結(jié)構(gòu)復(fù)雜（藥壁、藥隔、花絲等體細(xì)胞同樣具有被誘導(dǎo)成株的可能）2）生殖細(xì)胞的自發(fā)加倍（2）鑒定方法形態(tài)鑒定（形態(tài)特征、結(jié)實(shí)性、花粉粒著色和大小、氣孔大小數(shù)目）細(xì)胞學(xué)鑒定（染色體觀察）雜交鑒定（自交鑒定、雜交鑒定）分子鑒定（生化標(biāo)記、分子標(biāo)記）單倍體植物與它們的二倍體相比較，有三個明顯的特點(diǎn)：體細(xì)胞染色體數(shù)減半；生長發(fā)育弱，體形小、各器官明顯減?。淮菩叟渥訃?yán)重敗育，有的甚至不能進(jìn)入有性世代。5.單倍體植物的染色體加倍（1）意義離體條件下，由花粉發(fā)育而來的植物，其染色體只有一套，減數(shù)分裂不能形成正常配子。故單倍體植物是不育的。對其進(jìn)行染色體加倍，使其成為可育的二倍體。（2）單倍體植物的染色體加倍方法常用化學(xué)誘變劑：秋水仙素；對二氯苯；8-羥基喹啉方法：（1）小苗浸泡法（2）生長錐處理法（3）培養(yǎng)基加倍法方法－化學(xué)誘變小苗浸泡－將再生小植株從試管中取出，無菌條件下用秋水仙素直接浸泡，然后再轉(zhuǎn)移至新鮮的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。生長錐處理－用秋水仙素水溶液直接浸生長點(diǎn)培養(yǎng)基加倍－將單倍體植株的任何一部分作為外植體，種植在附加一定濃度秋水仙素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間后，轉(zhuǎn)入無秋水仙素的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。單倍體植株，一旦加倍成功就是一株純合二倍體，可以正常開花結(jié)實(shí)，繁殖后代。這樣的材料可直接試管繁殖應(yīng)用于生產(chǎn)，或者作為常規(guī)育種的原始材料?；ǚ叟囵B(yǎng)及單倍體應(yīng)用存在的問題1.誘導(dǎo)頻率低2.體細(xì)胞干擾問題3.倍性變異4.白化苗問題植物組織培養(yǎng)技術(shù)與花藥花粉培養(yǎng)技術(shù)的異同點(diǎn)項目相同點(diǎn)不同點(diǎn)植物組織培養(yǎng)技術(shù)（狹義）離體的植物組織經(jīng)脫分化形成愈傷組織，再分化成叢芽，誘導(dǎo)出根，然后進(jìn)行移栽。外植體為體細(xì)胞，染色體數(shù)無需加倍花藥培養(yǎng)技術(shù)取材為花藥花粉，培養(yǎng)的為單倍體幼苗，植株弱小，高度不育，必須用秋水仙素處理，使染色體加倍，恢復(fù)正常植株的染色體數(shù)，而且為純種第四節(jié)單倍體在植物育種中的應(yīng)用

將具有單套染色體的單倍體植物，經(jīng)人工染色體加倍，使其成為純合二倍體。從中選出具有優(yōu)良性狀的個體，直接繁育成新品種；或選出具有單一優(yōu)良性狀的個體，作為雜交育種的原始材料。

單倍體育種的優(yōu)越性單倍性植物不能結(jié)籽，生長勢弱，沒有單獨(dú)的利用價值，但其經(jīng)染色體加倍后成為純合的雙二倍體，因此可縮短育種年限，加快育種進(jìn)程，在雜交育種、誘變育種、遠(yuǎn)緣雜交及雜種優(yōu)勢的利用等多方面具有重要意義。1.控制雜種分離縮短育種周期在雜交育種中，由于雜種后代不斷分離，要得到一個穩(wěn)定的品系，一般需要4～6代的時間。再加上品種評比試驗等工作，對于一年生植物，要培養(yǎng)出一個穩(wěn)定的新品種，就需要6～7年甚至8～9年的時間。而對多年生植物，常規(guī)方法培養(yǎng)出新品種就需要更長的時間。大大縮短育種周期。2.排除顯隱性基因干擾，提高選擇效率如果