實(shí)驗(yàn)三瓊脂糖凝膠電泳

實(shí)驗(yàn)二、瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是分子克隆的核心技術(shù)之一，用于分離、鑒定和純化DNA片段。凝膠中DNA的位置可以用低濃度的熒光插入染料染色直接觀察。1、學(xué)習(xí)瓊脂糖凝膠電泳分離DNA的原理和方法2、檢測(cè)質(zhì)粒DNA的純度、濃度和分子量一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康沫傊鞘且环N天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，沸水中溶解，45℃開(kāi)始形成多孔性剛性濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA，其分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。瓊脂糖凝膠電泳法分離DNA，主要是利用分子篩效應(yīng)，遷移速度與分子量的對(duì)數(shù)值成反比關(guān)系。溴化乙錠(EB)為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EB-DNA復(fù)合物，其發(fā)射的熒光強(qiáng)度較游離狀態(tài)EB發(fā)射的熒光強(qiáng)度大10倍以上，且熒光強(qiáng)度與DNA的含量成正比。用肉眼觀察，可檢測(cè)到5ng以上的DNA。（GoldviewI的原理可能類(lèi)似）質(zhì)粒DNA有環(huán)狀超螺旋、開(kāi)環(huán)、和線性三種構(gòu)型，電泳時(shí)其遷移率各不同(超螺旋>線性>開(kāi)環(huán))。二、實(shí)驗(yàn)原理不同濃度瓊脂糖凝膠的分離范圍1、0.8%：500bp-15kb2、1.0%：250bp-12kb3、1.2%：150bp-6kb4、1.5%：80bp-4kb注意：高電壓影響凝膠的分離范圍，使分辨率下降！上次實(shí)驗(yàn)提取的質(zhì)粒pSK（3kb）

和MP3（6kb）

三、實(shí)驗(yàn)材料關(guān)于質(zhì)粒大小在電泳中的鑒定：酶切后線性化條帶電泳時(shí)所處的位置指示質(zhì)粒的大小。該質(zhì)粒載體用的是pUC的復(fù)制子，拷貝數(shù)能達(dá)到500-700個(gè)。四、儀器設(shè)備五、實(shí)驗(yàn)用具微波爐

電泳儀

微型電泳槽

紫外透射檢測(cè)儀

凝膠成像儀移液器吸管頭若干

加樣板量筒100ml1三角瓶500ml1六、試劑瓊脂糖

5TBE電泳緩沖液

10載樣緩沖液（loadingbuffer）

GoldViewI型核酸染色劑（10000）DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DNAmarker）：MarkerIII10載樣緩沖液：10

mMEDTA，0.25%溴酚藍(lán)，50%蔗糖

七、實(shí)驗(yàn)步驟（一）制膠（1%agarosegel）

（二）點(diǎn)樣

（三）電泳（四）觀察1、稱(chēng)取1g瓊脂糖加入盛有100ml0.5TBE電泳緩沖液的250ml三角瓶中，搖勻，用電子天平稱(chēng)三角瓶的總重量。在微波爐上加熱至瓊脂糖完全溶解，放在天平上加蒸餾水至原重量。冷卻到約60℃后，加入10l的GoldviewI，并搖勻。2、將溶解的瓊脂糖（約50℃）倒入制膠模具中，直至厚度為4-6mm，插入適當(dāng)?shù)氖嶙?，在室溫下冷卻凝固。3、充分凝固后小心垂直向上拔出梳子，以保證點(diǎn)樣孔完好。將凝膠置入電泳槽中，加0.5TBE電泳緩沖液至液面覆蓋凝膠1-2mm。（一）制膠（二）點(diǎn)樣用微量取液器（P20）吸取質(zhì)粒DNA樣品2l于點(diǎn)樣板小孔中，再加入8lTE及1l的載樣緩沖液，混勻后，小心加入點(diǎn)樣孔，藍(lán)色樣品混合物將沉入點(diǎn)樣孔下部。同時(shí)點(diǎn)5lMarkerⅢ作為分子量標(biāo)準(zhǔn)。打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，調(diào)節(jié)電壓至3-5V/cm，可見(jiàn)到溴酚藍(lán)條帶由負(fù)極向正極移動(dòng)，約一小時(shí)后即可觀察。（三）電泳（四）觀察將電泳好的凝膠置于紫外透射檢測(cè)儀上，戴上防護(hù)觀察罩，打開(kāi)紫外燈，可見(jiàn)到綠色核酸條帶，根據(jù)條帶粗細(xì)和熒光強(qiáng)度，可粗略估計(jì)該樣品DNA的濃度。同時(shí)根據(jù)已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)DNA，通過(guò)線性DNA條帶的相對(duì)位置初步估計(jì)樣品的分子量。1、用微波爐煮膠時(shí)，膠液的量不應(yīng)超過(guò)三角瓶容量的1/3，否則易溢出。2、煮好的膠應(yīng)冷卻至50℃左右時(shí)再倒，以免制膠板變形，并減少漏膠的機(jī)會(huì)。3、倒膠注意厚度(4-6mm)，充分凝固后再拔出梳子，以保持齒孔形狀完好。也可待膠稍凝固后，放入4℃冰箱10分鐘，以加速膠的凝固。4、加樣前趕走點(diǎn)樣孔中的氣泡，點(diǎn)樣時(shí)吸管頭垂直，切勿碰壞凝膠孔壁，以免使帶型不整齊。5、一般情況下不必每點(diǎn)一個(gè)樣品都換槍頭，吸電泳緩沖液（正極）洗幾次即可再點(diǎn)下一個(gè)樣品。6、

凝膠中含有GoldViewI，切勿直接用手接觸膠，廢棄膠應(yīng)集中處理，勿亂丟。注意事項(xiàng)常用電泳緩沖液配方TAE是Tris-乙酸，緩沖容量小，但是溶解度大，易于儲(chǔ)存；TBE是Tris-硼酸，緩沖容量大，但是溶解度小，不易長(zhǎng)期儲(chǔ)存，易產(chǎn)生沉淀；分離大片段最好用TAE，小片段用TBE；

TBE存在硼離子，會(huì)對(duì)一些酶的活性稍有影響。TAE和TBE的主要區(qū)別有的10×loadingbuffer中多了一樣SDS（1%），它會(huì)使酶類(lèi)（如Taq酶和限制性內(nèi)切酶）變性，有終止酶促反應(yīng)的作用。但在電泳時(shí)（以PCR產(chǎn)物為例），在電泳泳道上會(huì)產(chǎn)生一片彌散，如果電泳跑的距離短，和多出來(lái)一條帶沒(méi)有什么區(qū)別（大概1000bp左右）。不加SDS的凝膠加樣緩沖液只有電泳指示劑和沉淀樣品的作用。常用6×凝膠加樣緩沖液配方Loadingbuffer的功能：第一、指示劑溴酚藍(lán)和二甲苯青起到指示的作用，顯示電泳的進(jìn)程，以便我們適時(shí)終止電泳；第二、甘油或者蔗糖可以加大樣品密度，使樣品密度大于TAE或TBE，從而沉降到點(diǎn)樣孔中，防止樣品飄出點(diǎn)樣孔。另外，有的Buffer是加有SDS的，一般都會(huì)寫(xiě)明。SDS主要是促使聚合酶變性，因?yàn)闆](méi)有除盡的聚合酶會(huì)結(jié)合在DNA雙鏈上影響它的遷移速率。前沿指示劑溴酚藍(lán)溶液在酸性條件下為黃色，堿性條件下為藍(lán)色。因?yàn)樘崛〉暮怂嵋话愣际侨芙庠趬A性的TE緩沖液里，所以與loadingbuffer混合后變?yōu)樗{(lán)色。Marker跟DNA用一樣的上樣緩沖液，跑出來(lái)的結(jié)果才好，如果marker預(yù)先混合了上樣緩沖液，DNA樣品的上樣緩沖液還是盡可能找跟marker預(yù)混的上樣緩沖液一致。EDTA是螯合劑，可以螯合鈣和鎂等金屬離子，能夠使金屬依賴型核酸酶失活，從而防止DNA和RNA降解。PCR產(chǎn)物電泳一般用6×loadingbuffer就可以；酶切產(chǎn)物電泳和回收一般用10×loadingbuffer以減少上樣體積。在紫外照射透視下，與雙鏈DNA結(jié)合的吖啶橙呈現(xiàn)綠色熒光，而結(jié)合RNA或單鏈DNA的吖啶橙則呈現(xiàn)紅色熒光。不同波長(zhǎng)的紫外光短波紫外光：254nm中波紫外光：302nm長(zhǎng)波紫外光：365nm1、為什么分光光度計(jì)測(cè)定的濃度很高，但電泳檢測(cè)濃度卻很低？第一次電泳第二次電泳第一次電泳第二次電泳2011年結(jié)果GoldViewIGoldViewIIPlasmidDNA

Line1,λ-DNAEcoRI/HindⅢMarker;

Line2,PUC18(2686bp);

Line3,EcoRIdigestionofPUC18;

Line4,Cambia3301(11220bp);

Line5,EcoRIdigestionofCambia3301質(zhì)粒DNA三種構(gòu)型：環(huán)狀超螺旋、開(kāi)環(huán)和線性。質(zhì)粒電泳三條帶：超螺旋、開(kāi)環(huán)和復(fù)制中間體（即2個(gè)沒(méi)有復(fù)制完全的質(zhì)粒連在了一起）。同一種酶切后電泳譜帶的規(guī)律：從高分子量到低分子量條帶亮度逐漸減弱由于DNAMarker與酶切產(chǎn)物所含成分不同，因此遷移率不一定相同！質(zhì)粒酶切電泳結(jié)果的分析注意：如何判斷單酶切是否完全？如何判斷雙酶切是否完全？

注意：同樣的marker點(diǎn)在不同的膠孔中，電泳遷移率有差異。因?yàn)殡娪緯r(shí)有邊緣效應(yīng)，邊上的跑得快；跑膠時(shí)間長(zhǎng)了會(huì)發(fā)熱，整快膠受熱不均時(shí)也會(huì)出現(xiàn)這種現(xiàn)象。但因?yàn)槌樘豳|(zhì)粒時(shí)各人的操作差異,造成CCC/OC/L等多種構(gòu)型，條帶多少不一，亮暗也不一。但最典型的有三條：超螺旋、開(kāi)環(huán)和復(fù)制中間體。如果RNaseA添加過(guò)少或者質(zhì)量不高，會(huì)導(dǎo)致RNA降解不完全，會(huì)有一條遠(yuǎn)離點(diǎn)樣孔跑的最快的殘余RNA條帶；根據(jù)RNA降解程度不同，條帶亮度會(huì)有很大差異。提取過(guò)程中加溶液震蕩劇烈會(huì)導(dǎo)致基因組片段斷裂成很小的片段，因此質(zhì)粒中含有基因組的短片段會(huì)導(dǎo)致一些電泳條帶的出現(xiàn)。還有電泳時(shí)間的長(zhǎng)短造成各條帶的移動(dòng)距離也不一，一般較難判斷是對(duì)是錯(cuò)。電泳跑的時(shí)間較短，盡管能分出大小，但習(xí)慣上跑開(kāi)點(diǎn)對(duì)分辨差別不大的條帶有好處，短膠容易出現(xiàn)誤判。

堿裂解法抽提質(zhì)粒電泳會(huì)出現(xiàn)幾條帶？1、對(duì)于反復(fù)使用的瓊脂糖凝膠，DNA的電泳效果有所降低，如要獲得最佳的電泳圖片，請(qǐng)使用新配置的凝膠和電泳緩沖液。2、膠厚度不宜超過(guò)0.5cm，膠太厚會(huì)影響檢測(cè)的靈敏度。3、加入GoldView的瓊脂糖凝膠反復(fù)融化可能會(huì)對(duì)核酸檢測(cè)的靈敏度產(chǎn)生一定影響。4、電泳時(shí)使用新制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。注意電泳緩沖液多次使用后，離子強(qiáng)度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA電泳產(chǎn)生條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。5、必須保證瓊脂糖充分完全熔解，否則，會(huì)造成電泳圖像模糊不清。6、電泳槽中緩沖液使用次數(shù)過(guò)多，緩沖能力下降。特別是TAE緩沖液，一般用2-3次就要更換，TBE緩沖液則可使用10次左右。7、