楊璐-化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析法檢測(cè)梅毒螺旋體抗體(西北大學(xué)碩士學(xué)位畢業(yè)PPT)2011.6

化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析法檢測(cè)梅毒螺旋體抗體答辯人：楊璐導(dǎo)師：崔亞麗教授李如琳副教授

西北大學(xué)Contents1.背景介紹3.全文總結(jié)2.實(shí)驗(yàn)部分梅毒

●

梅毒螺旋體

●嚴(yán)重性傳播疾病

●發(fā)病率不斷上升

2010年4月國(guó)家衛(wèi)生部全國(guó)法定傳染病疫情報(bào)告：全國(guó)乙類(lèi)法定傳染病發(fā)病第３位梅毒檢測(cè)：●孕前檢查

●供血者血液常規(guī)篩選檢查西北大學(xué)醫(yī)院常用梅毒螺旋體免疫學(xué)檢測(cè)方法快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)（RPR）和甲苯胺紅試驗(yàn)(TRUST)初篩假陽(yáng)性高判斷主觀(guān)梅毒螺旋體血球凝集試驗(yàn)（TPHA）和梅毒螺旋體明膠凝集試驗(yàn)（TPPA）

確認(rèn)

判斷主觀(guān)操作繁瑣要求嚴(yán)格梅毒ELISA實(shí)驗(yàn)靈敏度有待進(jìn)一步提高

西北大學(xué)化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)免疫分析系統(tǒng)化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)（抗原、抗體，免疫反應(yīng)）★免疫分析高特異性及化學(xué)發(fā)光高靈敏度于一體（酶的化學(xué)發(fā)光底物或氧化劑）西北大學(xué)梅毒螺旋體抗體化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)靈敏度極高自動(dòng)化化學(xué)發(fā)光技術(shù)

●靈敏度極高

●較寬線(xiàn)性范圍

●精密度高

●容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化★廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、食品、分析化學(xué)等領(lǐng)域西北大學(xué)化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)梅毒的商品化試劑盒國(guó)外：

Abbott：ARCHITECTSyphilisTP磁粒

國(guó)內(nèi)：北京科美東雅生物技術(shù)有限公司：梅毒螺旋體抗體化學(xué)發(fā)光試劑盒酶標(biāo)板

西北大學(xué)聚乙烯酶標(biāo)板●板表面包被面積有限●反應(yīng)空間有限●靈敏度受限化學(xué)發(fā)光固相載體的選擇磁性微?！癖缺砻娣e大●分散性好●易分離●靈敏度更高西北大學(xué)金磁微?；瘜W(xué)發(fā)光檢測(cè)方法GoldMag-AS微米金磁微粒1.生物分子固定化容量大

2.超順磁性，易分離

西北大學(xué)包被反應(yīng)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)原理西北大學(xué)第一部分方法的優(yōu)化1HRP標(biāo)記抗原稀釋液的確定2包被抗原最佳用量及酶標(biāo)抗原最佳工作濃度的確定3樣本稀釋液的確定4保護(hù)劑的選擇西北大學(xué)HRP標(biāo)記抗原稀釋液的確定aPBST+20%小牛血清bPBST+0.1%BSAcPBST+0.5%BSAdPBST+1%BSAePBST+1.5%BSA降低非特異性吸附：

加入非特異性蛋白與表面活性劑陰性樣本的發(fā)光值西北大學(xué)包被抗原和酶標(biāo)抗原最佳工作濃度的確定

抗原包

被量(ng/孔)酶標(biāo)抗原稀釋度

701402102803501:2000PN660271652562954603945677336671:3000PN21742744571735502494644947601:4000PN13746543501538501816563171541:5000PN1404247850118142554342943341:6000PN12142319386574249434201927最佳抗原包被量：210ng/孔；最佳酶標(biāo)抗原工作濃度：1：3000西北大學(xué)樣本稀釋液的確定陽(yáng)性血清稀釋倍數(shù)檢測(cè)結(jié)果1×PBS生理鹽水PBS+0.1%BSA

正常人血清1:25++++1:50++++1:100++++1:200++++1:400++++1:800++++1:1600++++1:3200++++1:6400+-+-++1:12800--++1:25600--+-+-1:51200----最佳樣本稀釋液：PBS+0.1%BSA檢測(cè)靈敏度與正常人血清相當(dāng)西北大學(xué)保護(hù)劑的選擇保護(hù)劑X對(duì)HRP標(biāo)記抗原的保護(hù)作用良好HRP標(biāo)記抗原置于37℃、放置6天西北大學(xué)保護(hù)劑X對(duì)包被抗原金磁微粒的保護(hù)作用包被抗原金磁微粒置于37℃、放置6天穩(wěn)定性很好西北大學(xué)保護(hù)劑Proclin300與保護(hù)劑X的對(duì)比實(shí)驗(yàn)選定濃度為0.05%的Proclin300作為保護(hù)劑西北大學(xué)保護(hù)劑Proclin300對(duì)HRP標(biāo)記抗原的保護(hù)作用含0.05%Proclin300的HRP標(biāo)記抗原置于37℃、放置6天西北大學(xué)第一部分實(shí)驗(yàn)小結(jié)

在初步建立的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)梅毒螺旋體抗體方法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化，確定各最佳工作條件如下：1.HRP標(biāo)記抗原稀釋液：PBST+1%BSA作為HRP標(biāo)記抗原稀釋液；2.抗原包被量：210ng/孔(7μg/mg)；3.酶標(biāo)抗原稀釋濃度：1:3000時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最佳；4.血清樣本稀釋液：PBS+0.1%BSA；5.保護(hù)劑：濃度為0.05%Proclin300的PBS緩沖液。西北大學(xué)4參考值6對(duì)比實(shí)驗(yàn)1穩(wěn)定性3標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)25精密度特異性第二部分實(shí)驗(yàn)方法的評(píng)價(jià)西北大學(xué)穩(wěn)定性化學(xué)發(fā)光試劑分別置于4℃冰箱和37℃生化培養(yǎng)箱中放置6天將陽(yáng)性血清分別稀釋50倍、100倍、200倍、400倍后進(jìn)行檢測(cè)西北大學(xué)精密度國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（≤15%）批內(nèi)差：

2.86%～5%次數(shù)檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性檢測(cè)平均值RSD（%）1PN542315573523624915605715574715594923586052PN59982359232363941561251558762359721560483.103PN60741562491563022365151561561560221562192.864PN62871561662367432365341559832360122362884.775PN59232357991564011561372361171560932360783.38西北大學(xué)批間差：

5.1%～9.7%西北大學(xué)次數(shù)

檢測(cè)結(jié)果

批次1批次2批次3陽(yáng)性檢測(cè)平均值RSD（%）1PN389515391884829154822154487846921544419.72PN432915405284723154810154541154752845346.53PN3987841891544288478384431154246843446.24PN3995840968462415474284267843681543496.75PN401615397984572154226841461541441541815.1質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品10次重復(fù)測(cè)定結(jié)果質(zhì)控品：抗-TP標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（2NCU/mL）相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差：5.42%西北大學(xué)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)將梅毒螺旋體抗體質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品（4NCU/mL）梯度稀釋?zhuān)?.25～4NCU/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性良好Y=599.1X-165.9R2=0.9980西北大學(xué)參考值（臨界值確定）檢測(cè)100例臨床陰性血清樣本臨界值：⑴P/N≥2.8，計(jì)算得出該方法的臨界值為：COV=72.8⑵P≥X+3SD，計(jì)算可得臨界值為：COV=47.6⑶P/N≥2.1，計(jì)算可得臨界值為：COV=54.6發(fā)光值=54.6西北大學(xué)特異性陰性符合率均為100%·80例臨床血清樣本·20例乙肝陽(yáng)性血清樣本（TP陰性）·20例丙肝陽(yáng)性血清樣本（TP陰性）本次實(shí)驗(yàn)：COV=N×2.1=54.6發(fā)光值西北大學(xué)乙肝陽(yáng)性樣本檢測(cè)結(jié)果丙肝陽(yáng)性樣本檢測(cè)結(jié)果COV=54.6COV=54.6發(fā)光值發(fā)光值乙肝血清樣本丙肝血清樣本陰性符合率均為100%西北大學(xué)化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析法與商品化化學(xué)發(fā)光試劑盒對(duì)比靈敏度比商品化化學(xué)發(fā)光試劑盒提高4倍陽(yáng)性血清稀釋倍數(shù)檢測(cè)結(jié)果商品化試劑盒化學(xué)發(fā)光磁酶免法(MECLIA)1:100++1:200++1:400++1:800++1:1600++1:3200++1:6400-+1:12800-+1:25600-+-1:51200--西北大學(xué)

化學(xué)發(fā)光磁酶免法（COV=N×2.1=53.2）商品化化學(xué)發(fā)光試劑盒COV=N×2.1=26151）特異性對(duì)比實(shí)驗(yàn)：二者相當(dāng)，陰性符合率均100%發(fā)光值發(fā)光值20例陰性血清樣本20陰性血清樣本COV=53.2COV=26151西北大學(xué)西北大學(xué)第二部分實(shí)驗(yàn)小結(jié)國(guó)家法規(guī)：《體外診斷試劑注冊(cè)管理辦法》·分析性能評(píng)估資料：分析靈敏度、分析特異性、檢測(cè)范圍批內(nèi)不精密度、批間不精密度等項(xiàng)目·參考值（參考范圍）確定·穩(wěn)定性研究資料《發(fā)光免疫分析試劑生產(chǎn)及質(zhì)量控制技術(shù)指導(dǎo)原則》根據(jù)各個(gè)試劑盒的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或者制檢規(guī)程進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)指標(biāo)一般包括準(zhǔn)確性、靈敏度、特異性、精密性（批內(nèi)差）、相關(guān)性等，均應(yīng)達(dá)到相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。穩(wěn)定性：4℃，及37℃加速破壞性實(shí)驗(yàn)，均顯示保存穩(wěn)定性良好；精密度：批內(nèi)差在2.86～5%，批間差在5.1～9.7%，對(duì)質(zhì)控品重復(fù)10次檢測(cè)，變異系數(shù)為5.42%，均達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（≤15%）方法評(píng)價(jià)結(jié)果西北大學(xué)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：在0.25～4NCU/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性范圍良好臨界值：臨界值為陰性對(duì)照血清均值的2.1倍特異性：檢測(cè)臨床TP抗體陰性血清，陰性符合率為100%，特異性良好對(duì)比實(shí)驗(yàn)：靈敏度較商品化化學(xué)發(fā)光試劑盒提高4倍，特異性二者相當(dāng)西北大學(xué)●穩(wěn)定性●精密度●線(xiàn)性范圍●參考值●特異性●對(duì)比實(shí)驗(yàn)●HRP標(biāo)記抗原稀釋液●抗原包被量●酶標(biāo)抗原稀釋濃度●血清樣本稀釋液●保護(hù)劑對(duì)方法進(jìn)行比較全面的評(píng)價(jià)方法的進(jìn)一步優(yōu)化初步建立的化學(xué)發(fā)光磁酶免疫分析法全文總結(jié)：西北大學(xué)試劑盒研制成功中試放大梅毒抗體臨床科研血清盤(pán)梅毒螺旋體抗體診斷試劑國(guó)家參考品臨床試驗(yàn)西北大學(xué)主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究資料

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