液相色譜常見故障

液相色譜常見故障診狀

可能的原因

解決方法

(一)保留時間變化1.柱溫變化柱恒溫

2.等度與梯度間未能充分平衡至少用10倍柱體積的流動相平衡柱

3.緩沖液容量不夠用>25mmol/L的緩沖液

4.柱污染每天沖洗柱

5.柱內(nèi)條件變化穩(wěn)定進(jìn)樣條件,調(diào)節(jié)流動相

6.柱快達(dá)到壽命采用保護(hù)柱(二)保留時間縮短1.流速增加檢查泵,重新設(shè)定流速

2.樣品超載降低樣品量

3.鍵合相流失流動相PH值保持在3~7.5

檢查柱的方向

4.流動相組成變化防止流動相蒸發(fā)或沉淀

5.溫度增加柱恒溫(三)保留時間延長

1.流速下降管路泄漏,更換泵密封圈,

排除泵內(nèi)氣泡

2.硅膠柱上活性點(diǎn)變化用流動相改性劑,如加三乙胺,或采用堿至鈍化柱

3.鍵合相流失同前(二)34.流動相組成變化同前(二)45.溫度降低同前(二)5(四)

出現(xiàn)肩峰或分叉1.樣品體積過大用流動相配樣,總的樣品體積小于第一峰的15%2.樣品溶劑過強(qiáng)采用較弱的樣品溶劑3.柱塌陷或形成短路通道更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件4.柱內(nèi)燒結(jié)不銹鋼失效更換燒結(jié)不銹鋼,加在線過濾器,過濾樣品5.進(jìn)樣器損壞更換進(jìn)樣器轉(zhuǎn)子(五)鬼峰1.進(jìn)樣閥殘余峰每次用后用強(qiáng)溶劑清洗閥,改進(jìn)閥和樣品的清洗2.樣品中未知物處理樣品3.柱未平衡重新平衡柱,用流動相作樣品溶劑

(尤其是離子對色譜)4.三氟乙酸(TFA)氧化(肽譜)每天新配,用抗氧化劑5.水污染(反相)通過變化平衡時間檢查水質(zhì)量，用HPLC級的水(六)

基線噪聲1.氣泡(尖銳峰)流動相脫氣,加柱后背壓2.污染(隨機(jī)噪聲)清洗柱,凈化樣品,用HPLC級試劑3.檢測器燈連續(xù)噪聲更換氘燈4.電干擾(偶然噪聲)采用穩(wěn)壓電源,檢查干擾的來源(如水浴等)5.檢測器中有氣泡流動相脫氣,加柱后背壓(七)峰拖尾1.柱超載降低樣品量,增加柱直徑采用較高容量的固定相2.峰干擾清潔樣品,調(diào)整流動相3.硅羥基作用加三乙胺,用堿致鈍化柱增加緩沖液或鹽的濃度降低流動相PH值,鈍化樣品4.同前(四)4同前(四)45.同前(四)35.同前(四)36.死體積或柱外體積過大連接點(diǎn)降至最低,對所有連接點(diǎn)作合適調(diào)整,盡可能采用細(xì)內(nèi)徑的連接管7.柱效下降用較低腐蝕條件,更換柱,采用保護(hù)柱(八)峰展寬1.進(jìn)樣體積過大同(四)12.在進(jìn)樣閥中造成峰擴(kuò)展進(jìn)樣前后排出氣泡以降低擴(kuò)散3.數(shù)據(jù)系統(tǒng)采樣速率太慢設(shè)定速率應(yīng)是每峰大于10點(diǎn)4.檢測器時間常數(shù)過大設(shè)定時間常數(shù)為感興趣第一峰半寬的10%5.流動相粘度過高增加柱溫,采用低粘度流動相6.檢測池體積過大用小體積池,卸下熱交換器7.保留時間過長等度洗脫時增加溶劑含量也可用梯度洗脫8.柱外體積過大將連接管徑和連接管長度降至最小9.樣品過載進(jìn)小濃度小體積樣品泵的操作與維護(hù)正如人的心臟一樣,高效液相色譜儀中的高壓恒流泵必須能可靠的運(yùn)轉(zhuǎn).但是要做到長時間低維護(hù)的可靠運(yùn)轉(zhuǎn),就需要對泵有足夠的了解,并注意與之有關(guān)的事項.

1.通常的設(shè)計

目前作為商品出售的高壓恒流泵多為往復(fù)式柱塞泵,結(jié)構(gòu)原理如圖1所示.凸輪與連桿將電機(jī)的圓周運(yùn)動轉(zhuǎn)變?yōu)橹麠U的線性運(yùn)動,在有單向閥的結(jié)構(gòu)中,柱塞桿將常壓下儲液瓶中的流動相吸至泵腔后再送出,其耐壓可達(dá)41MPa.通過改變凸輪的形狀和電機(jī)的轉(zhuǎn)速及柱塞桿的尺寸可以將流動相的脈動降至最小.如果對泵的各個部分都有清楚的認(rèn)識,將來排出操作過程中出現(xiàn)的故障就很簡單了.單向閥:泵頭通常由兩部分組成--單向閥和密封圈-柱塞桿.

是單向閥的示意圖.該單向閥一般由閥體\塑料\或陶瓷閥座和紅寶石球組成.在壓力的作用下寶石球離開閥座流動相流過單向閥;反之,在反向力的作用下,寶石球回到閥座上此時流動相不再流過單向閥.顯然寶石球與閥座之間的配合必須非常適合才能防止流動相的泄漏.為了保證單向閥不發(fā)生泄漏,一些單向閥中安裝了兩套寶石球和閥座,也有一些單向閥是將寶石球用一個合適的彈簧壓在閥座上.在不同的應(yīng)用領(lǐng)域,單向閥閥體的材料有所不同,例如考慮生物兼容性的系統(tǒng),單向閥的閥體往往采用金屬鈦,而不用不銹鋼.為了降低成本和減少維護(hù)費(fèi)用,一些生產(chǎn)廠商還采用了可置換式的卡套式塑料單元件,當(dāng)然其功能仍保持不變柱塞桿與密封圈:柱塞桿在泵頭內(nèi)做前后的往復(fù)運(yùn)動,完成將流動相吸入泵頭然后再輸出的過程.柱塞桿的典型材料藍(lán)寶石,不銹鋼或其他材質(zhì)的柱塞桿往往用于一些特殊的領(lǐng)域.泵頭內(nèi)的密封圈是防止流動相從柱塞桿的周圍流走而設(shè)計的.

是柱塞桿的運(yùn)動過程示意圖.

在吸液過程中由于柱塞桿的運(yùn)動而在泵腔內(nèi)形成負(fù)壓.此時因色譜柱的,泵頭外的壓力顯然高于泵頭內(nèi),在這兩種壓差下出口單向閥的寶石球落回到閥座上;而對于入口單向閥,因為外界大氣壓大于泵腔內(nèi)的壓力,寶石球離開閥座,流動相順利的進(jìn)入泵腔.與此相反的輸液過程見圖3-b.由于柱塞桿的運(yùn)動使壓力增加,入口單向閥的寶石球落回到閥座,入口單向閥處于關(guān)閉狀態(tài);當(dāng)泵頭內(nèi)的壓力繼續(xù)增加,并且超過了泵頭外的色譜柱的反壓時,出口單向閥開啟,流動相輸出.進(jìn)樣閥在進(jìn)樣過程中，必須是非常清潔的，否則得不到較好的結(jié)果。進(jìn)樣閥切換到進(jìn)樣位置（Inject）后，要在此位置保持一段時間，使流動相充分沖洗樣品定量管，這樣可以保證有較高的精確度，而且不用另外再沖洗樣品定量管。這種由色譜儀器控制的沖洗顯然要比手動沖洗更好些。注意：沖洗需要的流動相體積至少為所進(jìn)樣品體積的10倍。例如，如果取20μL樣品至100μL樣品定量管中，而流動相此時的流速為1mL/min，則需要在進(jìn)樣位置至少保持12s，即：20μL×10/1000μL·min-1=0.2min=12s。

當(dāng)樣品定量管經(jīng)過充分的沖洗后，可以將旋柄轉(zhuǎn)回取樣位置（Load），也可以繼續(xù)保持在進(jìn)樣位置，到下次取樣前才切換回取樣位置。在切換回取樣位置時，將樣品進(jìn)樣針或微量樣品進(jìn)樣針從進(jìn)樣閥中拔出。

為防止交叉污染，正常情況下不必每次進(jìn)樣后都沖洗進(jìn)樣閥注射針導(dǎo)入口。進(jìn)樣閥內(nèi)根據(jù)專利設(shè)計的直接連接進(jìn)樣孔，可以使注射針頭的前端直接連接到樣品定量管的末端，沒有其他空間供樣品殘留。這樣在下一次進(jìn)樣時，就不會有上一次殘留的樣品進(jìn)入樣品定量管。但是在進(jìn)樣針頭插入或拔出過程中，會有痕量的樣品沉積在針頭密封區(qū)域。精密的測定顯示這種殘留有1nL~10nL。這表明進(jìn)20μL樣品，會殘留0.005%~0.05%。每次進(jìn)樣后沖洗注射針導(dǎo)入口可以將此殘留沖洗干凈。沖洗注射針導(dǎo)入口的過程為：設(shè)定流動相的流速為0.1mL/min~1mL/min，將注射針導(dǎo)入口沖洗頭（Rheodyne部件號7125-054）連接到一只體積相對較大的注射器上，用大量的流動相只在進(jìn)樣位置清洗注射針導(dǎo)入口。這樣進(jìn)入進(jìn)樣閥中的液體繞過樣品定量管由樣品溢出管5#口排出。這一過程可以將注射針導(dǎo)入口、引導(dǎo)管、注射針導(dǎo)入管和注射針密封圈徹底清洗。而采用注射器完全插入式的沖洗方式，則不能全部清洗上述部分的表面。在取樣位置將注射針插入注射針導(dǎo)入口時，針頭推動注射針密封圈內(nèi)少量樣品液體（上一次沖洗注射針導(dǎo)入管留下的）進(jìn)入樣品定量管。當(dāng)該樣品液體與所用的流動相組成不同，且同時采用部分充滿定量管進(jìn)樣方式時，在高靈敏度的檢測器上可能出現(xiàn)怪峰。所以沖洗注射針時最好用流動相沖洗。如果已發(fā)現(xiàn)有嚴(yán)重的交叉污染現(xiàn)象，請檢查是否有下列原因造成：

ⅰ.使用的注射針頭長度不夠（針頭的長度至少要5cm），注射針末端不能到達(dá)定子表面。

ⅱ.注射針沒有充分插入注射針導(dǎo)入口。

ⅲ.注射針導(dǎo)入口內(nèi)的污染物或針頭密封磨損下來的削片，使注射針頭末端不能接觸定子表面。

如果不考慮交叉污染，每進(jìn)樣10次或20次最好沖洗一下注射針導(dǎo)入口，這樣可以保證注射針導(dǎo)入管內(nèi)充滿流體。在注射針插入或拔出的過程中，清洗注射針頭或稀釋污染這一區(qū)域的樣品的同時也使注射針導(dǎo)入口和樣品