微生物的選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)(第2課時(shí))【高效課堂+備課精研】 高二生物 精講課件（人教版2019選擇性必修3）

第2節(jié)

微生物的培養(yǎng)技術(shù)及應(yīng)用二微生物的選擇培養(yǎng)和計(jì)數(shù)（第2課時(shí)）1.間接計(jì)數(shù)法——稀釋涂布平板法（1）原理

當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)單菌落，來源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。通過統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌。稀釋103倍稀釋104倍稀釋105倍空白對(duì)照三、微生物的數(shù)量測(cè)定（2）計(jì)數(shù)原則①

一般選擇菌落數(shù)為30～300的平板計(jì)數(shù)。②

在同一稀釋度下，應(yīng)至少對(duì)3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出平均值。③

適當(dāng)?shù)南♂尪?、涂布是否均勻是成功統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的關(guān)鍵。分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，要考慮重復(fù)組結(jié)果是否接近，如果相差太大，意味著操作有誤，需重新實(shí)驗(yàn)。1.間接計(jì)數(shù)法——稀釋涂布平板法（3）結(jié)果分析①統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目少；②統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是用活菌數(shù)來表示。原因：當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落。三、微生物的數(shù)量測(cè)定（4）計(jì)算公式每克樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×MC代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)；M代表稀釋倍數(shù)。V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(mL)；（5）使用范圍

可以用來測(cè)定土壤、水、食品等樣品中的細(xì)菌、酵母菌、芽孢和孢子等的數(shù)量，但不適于測(cè)定樣品中的放線菌、絲狀真菌等絲狀體微生物的數(shù)量。例1.某同學(xué)在稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中測(cè)得平板上菌落數(shù)的平均數(shù)為234，那么每g樣品中的菌落數(shù)是（涂布平板時(shí)所用稀釋液的體積為0.1mL)()A.2.34×108

B.2.34×109

C.234

D.23.4B學(xué)以致用某兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測(cè)定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)。從對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計(jì)結(jié)果：甲同學(xué)在該濃度下涂布了一個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)為230；乙同學(xué)在該濃度下涂布了A、B、C三個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別為21、212、256，該同學(xué)以這三個(gè)平板上菌落數(shù)的平均值163作為統(tǒng)計(jì)結(jié)果。請(qǐng)?jiān)u價(jià)這兩位同學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效性：1.甲同學(xué)________________________________；2.乙同學(xué)_____________________________________________；實(shí)驗(yàn)操作不合理，未設(shè)置重復(fù)實(shí)驗(yàn)組結(jié)果計(jì)算不合理，21與另外兩組數(shù)值相差太大，應(yīng)舍去學(xué)以致用2.直接計(jì)數(shù)法——顯微鏡直接計(jì)數(shù)（1）原理

利用特定的__________或____________在______下觀察、計(jì)數(shù)，然后再計(jì)算________的樣品中微生物的數(shù)量；

*血細(xì)胞計(jì)數(shù)板常用對(duì)相對(duì)較大的酵母菌細(xì)胞、霉菌孢子等；

細(xì)菌計(jì)數(shù)板可對(duì)細(xì)菌等較小的細(xì)胞進(jìn)行觀察和計(jì)數(shù)。（2）優(yōu)點(diǎn)________（3）缺點(diǎn)①統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般是_________________，不能區(qū)分死菌與活菌。②個(gè)體小的細(xì)菌在顯微鏡下難以觀察。

③不適于對(duì)運(yùn)動(dòng)細(xì)菌的計(jì)數(shù)。細(xì)菌計(jì)數(shù)板血細(xì)胞計(jì)數(shù)板顯微鏡一定體積快速、直觀活菌數(shù)和死菌數(shù)的總和三、微生物的數(shù)量測(cè)定計(jì)數(shù)區(qū)放大后的計(jì)數(shù)室(4)計(jì)數(shù)方法：每毫升原液所含細(xì)菌數(shù)＝每小格平均細(xì)菌數(shù)×400×10000×稀釋倍數(shù)注意：統(tǒng)計(jì)結(jié)果一般是活菌數(shù)和死菌數(shù)的總和。（“染色排除法”）三、微生物的數(shù)量測(cè)定2.直接計(jì)數(shù)法——顯微鏡直接計(jì)數(shù)內(nèi)容直接計(jì)數(shù)法間接計(jì)數(shù)法主要用具計(jì)數(shù)依據(jù)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)計(jì)算公式顯微鏡、細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板涂布器細(xì)菌個(gè)數(shù)培養(yǎng)基上菌落數(shù)計(jì)數(shù)方便、操作簡(jiǎn)單計(jì)數(shù)的是活菌不能區(qū)分死菌與活菌操作較復(fù)雜且有一定誤差每毫升原液含菌株數(shù)＝400×10000×每小格平均菌株數(shù)×稀釋倍數(shù)每毫升原液含菌株數(shù)＝平均菌落數(shù)/所用涂布液體積×稀釋倍數(shù)三、微生物的數(shù)量測(cè)定（1）從土壤中分離出能夠分解尿素的細(xì)菌（2）統(tǒng)計(jì)每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細(xì)菌絕大多數(shù)微生物都能利用葡萄糖，但是只有能合成_____的微生物才能分解尿素，利用

的_____培養(yǎng)基，可以從土壤中分離出

的細(xì)菌。脲酶以尿素作為唯一氮源選擇分解尿素CO(NH2)2+H2O2NH3+CO2

脲酶土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.實(shí)驗(yàn)原理

常見的分解尿素的微生物：芽孢桿菌、小球菌、棒狀桿菌等細(xì)菌，某些真菌和放線菌也能分解尿素。實(shí)驗(yàn)流程：樣品稀釋涂布平板微生物的培養(yǎng)與觀察

菌落計(jì)數(shù)土壤取樣制備培養(yǎng)基土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)①取樣地點(diǎn)要求：酸堿度接近中性的潮濕土壤。

（細(xì)菌適宜在該環(huán)境中生長(zhǎng)）②取樣過程：鏟去表層土（一般3cm左右）。

（細(xì)菌絕大部分分布在距地表3～8cm的土壤層。）

土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)3.實(shí)驗(yàn)步驟（1）土壤取樣注意事項(xiàng)：取土樣時(shí)用的鐵鏟和取樣袋在使用前都需要滅菌。操作完成后，一定要洗手。葡萄糖10.0g尿素1.0gKH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g瓊脂15.0g蒸餾水1000ml（2）制備培養(yǎng)基①選擇培養(yǎng)基：以尿素為唯一氮源②牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：作為對(duì)照組，來判斷選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)3.實(shí)驗(yàn)步驟怎樣證明此培養(yǎng)基具有選擇性呢？以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基

是分離尿素細(xì)菌判斷該培養(yǎng)基有無選擇性實(shí)驗(yàn)組對(duì)照組培養(yǎng)基類型是否接種

目的

結(jié)果只生長(zhǎng)尿素細(xì)菌生長(zhǎng)多種微生物是土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)①

測(cè)細(xì)菌數(shù)：一般用104、105、106稀釋液。②

測(cè)放線菌數(shù)：一般用103、104、105稀釋液。③

測(cè)真菌數(shù)：一般用102、103、104稀釋液。（3）樣品的稀釋與涂布平板

不同微生物在土壤中含量不同，分離不同的微生物采用不同的稀釋度，以保證獲得菌落數(shù)在30～300之間適于計(jì)數(shù)的平板。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)在初次實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于稀釋的范圍沒有把握，怎樣做才能保證從中選擇出菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)？思考

選擇一個(gè)比較寬的范圍，將1×103～1×107倍稀釋的稀釋液分別涂布到平板上培養(yǎng)，以保證能從中選擇出菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。3.實(shí)驗(yàn)步驟組別具體組別具體操作作用實(shí)驗(yàn)組實(shí)驗(yàn)組1涂布接種的選擇培養(yǎng)基三次重復(fù)排除偶然因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，用以分離并計(jì)數(shù)能分解尿素的細(xì)菌。實(shí)驗(yàn)組2涂布接種的選擇培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)組3涂布接種的選擇培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)組4涂布接種的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)組4與實(shí)驗(yàn)組1、2、3組對(duì)比用以驗(yàn)證選擇培養(yǎng)基是否具有選擇作用。對(duì)照組對(duì)照組1不涂布接種的選擇培養(yǎng)基對(duì)照組1與實(shí)驗(yàn)組1、2、3組對(duì)比用以驗(yàn)證選擇培養(yǎng)基中是否含有雜菌。對(duì)照組2不涂布接種的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基對(duì)照組2與實(shí)驗(yàn)組4對(duì)比用以驗(yàn)證牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中是否含有雜菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)組1、2、3分離得到尿素分解菌的單菌落；第4組得到多種菌落；第5、6組正常情況下無菌落。本實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組設(shè)計(jì)如下：土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)①本實(shí)驗(yàn)使用的平板和試管較多，為了避免混淆，最好在使用前做好標(biāo)記。例如，在標(biāo)記培養(yǎng)皿時(shí)應(yīng)該注明組別、培養(yǎng)日期和平板上培養(yǎng)樣品的稀釋度等。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)（3）樣品的稀釋與涂布平板注意事項(xiàng)：②建立“有菌觀念”。實(shí)驗(yàn)室、實(shí)驗(yàn)器材(取土樣的小鐵鏟、盛土樣的紙袋等)、操作者、空氣中都存在微生物，都有污染的可能，必須進(jìn)行嚴(yán)格的消毒、滅菌，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程(稱取土樣、稀釋土壤溶液等)要在酒精燈火焰旁進(jìn)行。3.實(shí)驗(yàn)步驟③本實(shí)驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)，需要事先規(guī)劃時(shí)間，以便提高實(shí)驗(yàn)效率，在操作時(shí)有條不紊。①

培養(yǎng)條件：不同種類的微生物，往往需要不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間。細(xì)菌一般在30～37℃的溫度下培養(yǎng)1～2d。②

觀察：每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果。防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。③

一般來說，在相同的培養(yǎng)條件下，同種微生物表現(xiàn)出穩(wěn)定的菌落特征，如形狀、大小和顏色等。（4）微生物的培養(yǎng)與觀察3.實(shí)驗(yàn)步驟土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)

（1）結(jié)合對(duì)照組，分析培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出一些菌落。

如果沒有接種的培養(yǎng)基上沒有菌落生長(zhǎng)，說明培養(yǎng)基沒有被雜菌污染。如果接種后的完全培養(yǎng)基上的菌落數(shù)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，說明選擇培養(yǎng)基篩選出了一些尿素分解菌。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)4.結(jié)果分析與評(píng)價(jià)

（2）你是否獲得了某一稀釋度下菌落數(shù)為30~300的平板？在這一稀釋度下，是否至少有2個(gè)平板的菌落數(shù)接近？

如果得到了兩個(gè)或多個(gè)菌落數(shù)為30～300的平板，說明稀釋度合適，操作比較成功，能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù)。土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)4.結(jié)果分析與評(píng)價(jià)（3）你統(tǒng)計(jì)的每克土樣中能分解尿素的細(xì)菌的菌落數(shù)是多少？與其他同學(xué)統(tǒng)計(jì)的結(jié)果接近嗎？如果差異很大,可能是什么原因引起的？

如果是用同一土樣進(jìn)行的操作，數(shù)據(jù)應(yīng)該比較接近。如果差異很大，就需要從操作是否規(guī)范、培養(yǎng)基配制是否合理等方面查找原因。內(nèi)容現(xiàn)象結(jié)論有無雜菌污染的判斷對(duì)照的培養(yǎng)皿中無菌落生長(zhǎng)培養(yǎng)基中菌落數(shù)偏高菌落形態(tài)多樣，菌落數(shù)偏高選擇培養(yǎng)基的篩選作用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落數(shù)目大于選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目樣品的稀釋操作得到3個(gè)或3個(gè)以上菌落數(shù)目在30~300的平板重復(fù)組的結(jié)果若選取同一土樣，統(tǒng)計(jì)結(jié)果應(yīng)接近土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)4.結(jié)果分析與評(píng)價(jià)未被雜菌污染被雜菌污染培養(yǎng)基中混入其他雜菌選擇培養(yǎng)基具有篩選作用操作成功

本活動(dòng)只是初步篩選了能分解尿素的細(xì)菌,對(duì)分離的菌種進(jìn)行鑒定還需要借助生物化學(xué)的方法。你可以查閱相關(guān)資料,進(jìn)一步設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來鑒定自己分離的菌種。

細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解為氨，氨會(huì)使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)，pH升高，因此可以通過檢測(cè)培養(yǎng)基pH的變化來判斷是否發(fā)生了該化學(xué)反應(yīng)，進(jìn)而判斷該菌是否為尿素分解細(xì)菌。原理土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)5.進(jìn)一步探究脲酶的檢測(cè)土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù)5.進(jìn)一步探究方法

在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果pH升高，指示劑將變紅。這樣，我們就可以初步鑒定該種細(xì)菌能夠分解尿素。液體培養(yǎng)基：可以直接看液體的變色情況。固體培養(yǎng)基：可以觀察菌落周圍是否出現(xiàn)紅色環(huán)帶，紅色環(huán)帶直徑與菌落直徑比值越大，說明分解能力越強(qiáng)。課堂小結(jié)1.研究人員用無機(jī)鹽、瓊脂和石油配制的培養(yǎng)基從被石油污染的土壤中篩選出了一種石油降解菌。判斷下列相關(guān)表述是否正確。（1）這種培養(yǎng)基是一種選擇培養(yǎng)基。（

）（2）利用這種石油降解菌可以降解石油。修復(fù)土壤。（

）（3）相對(duì)于未被污染的土壤,從被石油污染的土壤中更容易分離到石油降解菌。（

）√√√練習(xí)與應(yīng)用一、概念檢測(cè)2.用稀釋涂布平板法來統(tǒng)計(jì)樣品中的活菌數(shù)時(shí)，通過統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)就能推測(cè)出樣品中的活菌數(shù),原因是（

）A.菌落中的細(xì)菌數(shù)目是固定的B.平板上的一個(gè)菌落就是一個(gè)細(xì)菌C.通過此方法統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)與活菌的實(shí)際數(shù)目相同D.平板上的一個(gè)菌落一般來源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌D練習(xí)與應(yīng)用一、概念檢測(cè)1.反芻（chú）動(dòng)物，如牛和羊具有特殊的器官一瘤胃。在瘤胃中生活著多種微生物，其中許多微生物能分解尿素。請(qǐng)你設(shè)計(jì)一個(gè)實(shí)驗(yàn)從瘤胃中分離出能夠分解尿素的微生物。

反芻動(dòng)物的瘤胃中有大量的微生物，其中就有分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多為厭氧菌，接觸空