現(xiàn)代分子生物學技術(shù)基礎(chǔ)之 DNA、RNA的分析及轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析技術(shù)

現(xiàn)代分子生物學技術(shù)基礎(chǔ)

DNA、RNA的分析及轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析技術(shù)

斑點雜交

Southern印跡雜交一核酸雜交Northern印跡雜交

基因芯片等

變性梯度凝膠電泳(DGGE)二突變篩查技術(shù)單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)

變性高效液相色譜（DHPLC）化學切割錯配（CCM）蛋白質(zhì)短截檢測（PPT）等三DNA測序

四轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析一、核酸雜交

用標記的核酸探針鑒定復雜核酸分子中密切相關(guān)的DNA、RNA的方法。

主要涉及技術(shù)：斑點雜交：

Southern印跡雜交

Northern印跡雜交原位雜交

DNA微陣列技術(shù)

1核酸雜交的概念和基本原理將標記的核酸探針變性，與變性后的靶DNA/RNA通過鹼基互補配對結(jié)合，形成雜種分子的過程。其目的是鑒定分析復雜的靶DNA/RNA中與探針同源的核酸片段。

2核酸探針（nucleicacidprobe）1）概念:核酸探針：是指與目的基因或DNA/RNA特異互補的一段核酸片段。探針可是單鏈或雙鏈，但工作的探針必須為單鏈。2）種類：

DNA探針

cDNA探針

RNA探針

3）探針標記：將探針標記上一種標識物以便于雜交后檢測。

（1)常用的標識物及檢測：同位素：32P

,35S

,3H-dNTP等；檢測方法：放射自顯影優(yōu)點：靈敏度較高不足：放射性物質(zhì)容易衰變；且易導致放射污染

非同位素：標記物：地高辛-dUTP，生物素-dUTP。檢測方法:非同位素標記的探針經(jīng)顯色或化學發(fā)光法等檢測優(yōu)點:無放射污染,保存時間較長缺點:

靈敏度較低10①

缺口平移法（NickTranslation）原理及過程：反應(yīng)體系中DNA酶I隨機在探針DNA上打開缺口；DNA聚合酶I具有5′→3′外切酶活性，在缺口處按5′→3′方向切除單核苷酸；DNA聚合酶I還具有5′→3′聚合酶活性，在缺口處3′端加入底物中單核苷酸，彌補缺口處核苷酸鏈。隨反應(yīng)進行，底物中被標記單核苷酸隨機摻入。DNA聚合酶I兩種作用交替進行，探針即被標記。（2）探針標記主要方法

NickTranslationOHpOH+PPDNAdNTP，DNA酶I，DNA聚合酶I32P-dNTPBio-dNTP12②.隨機引物法（六核苷酸引物標記法）

原理及過程：利用E.coliDNA聚合酶I的Klenow亞單位，合成含有標記核苷酸的DNA鏈。Klenow具有5′→3′聚合酶活性。待標記DNA（探針）變性成單鏈，引物與模板結(jié)合。在Klenow酶催化下，按5′→3′方向合成DNA新鏈。反應(yīng)體系中含有標記的dNTP,隨機摻入新合成DNA鏈中，探針被標記。③

應(yīng)用多聚核苷酸激酶進行DNA末端標記：常用于寡核苷酸探針的標記。根據(jù)已知基因序列合成一段長約15-50個bp的核苷酸探針。

多聚核苷酸激酶能將dATPγ位的同位素32P置換DNA5′端的P。。④其他：

填充末端標記法等1）

斑點雜交：獲取靶DNA（如人類全基因組DNA）的溶液，點樣于一硝酸纖維素膜或尼龍膜上，干燥、固定、雜交。

靶DNA序列的變性：點樣前熱處理或點樣后堿溶液處理。

3核酸雜交的主要方法

等位基因特異性寡核苷酸探針雜交（allele-specific-oligonucleotide,ASO）

適用于基因突變部位和性質(zhì)已完全明確的突變檢測。合成ASO探針，大小20bp左右，標記后用于雜交檢測。檢測點突變時一般需合成兩種探針：設(shè)計：正常探針：只與正?；蛐蛄须s交形成穩(wěn)定雜交體突變探針：只與突變基因序列雜交穩(wěn)定雜交體

PCR技術(shù)可結(jié)合ASO，即PCR-ASO技術(shù)，以ASO探針檢測擴增后產(chǎn)物——突變基因檢測。2

）Southern和Northern印跡雜交

通過凝膠電泳按片段大小分離核酸,然后檢測：為核酸雜交的主要方法

（1)Southern印跡雜交

因EdwinM.Southern建立的技術(shù)而命名,用于鑒定DNA片段的分子雜交技術(shù)。1)原理：堿基互補2)步驟：

DNA提?。禾崛〗M織或細胞的基因組DNA

DNA分離：限制酶消化DNA，凝膠電泳分離大小不同的DNA片段Southern印跡雜交DNA變性：凝膠中的DNA在堿性溶液中變性轉(zhuǎn)膜：將變性的DNA片段從凝膠原位轉(zhuǎn)移印跡在硝酸纖維素膜或尼龍膜上。雜交：將標記的探針變性，同固著的靶DNA片段雜交，與靶DNA中的互補DNA序列形成異源雙鏈。Southern印跡雜交洗膜：未結(jié)合的多余DNA探針以及非特異性結(jié)合的DNA探針通過洗膜去除放射自顯影：將雜交的膜進行放射自顯影。結(jié)果分析：依雜交信號在膜上的位置判定DNA大小、信號強度推測DNA拷貝數(shù)22-+Southernblot探針

應(yīng)用：基因的定性及定量分析(2)基因突變分析:缺失、插入,影響到酶切位點的點突變

(3)RFLP連鎖分析（2）Northern印跡雜交是一種類似Southern印跡雜交用來鑒定特定mRNA的方法，可以獲得特異基因表達的信息?；驹砼cSouthern印跡雜交一致，只是靶核酸為RNA。步驟：RNA提?。簭拇郎y組織或細胞提取總RNA或mRNARNA分離：甲醛變性凝膠電泳按照分子量大小分離RNA轉(zhuǎn)膜：RNA從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上雜交：用標記的特異基因探針檢測待測組織或細胞中該基因表達情況洗膜:去除未結(jié)合及非特異性結(jié)合的探針

應(yīng)用

（1）檢測mRNA分子大?。ㄒ离s交帶位置）（2）mRNA的含量，即基因表達水平高低（依雜交帶密度）

3)原位雜交

（1）染色體原位雜交：利用一個標記的DNA探針與已經(jīng)原位變性的染色體DNA雜交。常用的技術(shù)為熒光原位雜交(fluorescenceinsituhybridization，F(xiàn)ISH)基本原理：應(yīng)用地高辛或生物素標記探針DNA，變性成單鏈后與變性后的染色體或細胞核靶DNA雜交。在熒光顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果應(yīng)用：①基因定位②檢測染色體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常,進行遺傳病的診斷和產(chǎn)前診斷（2）組織原位雜交：利用一個標記的探針與組織切片上的RNA雜交。組織切片可由石蠟包埋或冰凍切片（3）整裝原位雜交（wholemountinsitu）：在一個完整胚胎中研究基因表達

DNA微陣列(DNAmicroarrays)技術(shù):反向核酸雜交方法。

4)DNA微陣列基因芯片（又稱DNA芯片，DNA微陣列），在一固體支持物上集成了大量密集、有序排列的基因探針，也稱微陣列.與樣品中同源核酸分子通過堿基互補配對進行雜交，實現(xiàn)生物基因信息的高通量檢測。同步比較分析成千上萬基因的信息，對揭示生命現(xiàn)象的規(guī)律具有重要作用。已成為當前生命科學研究的熱點之一。36基因芯片的應(yīng)用：1、基因表達分析2、基因變異篩查：

單核苷酸多態(tài)性（SNP）

突變檢測等二突變篩查技術(shù)1

變性梯度凝膠電泳

2

單鏈構(gòu)象多態(tài)性３變性高效液相色譜

4等位基因特異性PCR

５蛋白質(zhì)短截檢測６化學切割錯配1變性梯度凝膠電泳（Denaturringgradientgelelectrophoresis,DGGE）：基本原理：不同DNA序列開始變性時對變性劑濃度的要求不同，利用變性劑濃度呈梯度增加的凝膠來分離DNA片段的凝膠系統(tǒng)。

在變性劑梯度由低到高的聚丙烯酰胺凝膠電泳中，對變性劑濃度要求較低的DNA片段先部分解鏈，電泳速度減慢；與后解鏈片段的電泳遷移速度產(chǎn)生差異，電泳帶位置不同，可將正常和突變DNA進行分離

為使DNA片段在變性梯度凝膠電泳中保持部分解鏈，避免完全解鏈所致的片段長度決定遷移，常在引物5′端增加40bp的GC重復序列（即GC夾）。DGGE與PCR結(jié)合---PCR-DGGE特點:檢測片斷范圍為100-500bp。檢出率高,無需放射標記。需特殊的制膠設(shè)備；需合成帶GC夾的引物。應(yīng)用:DNA中單個堿基替代、微小缺失或插入檢測。突變篩查技術(shù)2單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SingleStrandConformationalPolymorphism，SSCP）原理：單鏈DNA由于堿基序列不同可引起構(gòu)象差異，該差異使相同或相近長度的單鏈DNA電泳遷移率不同。與PCR技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，稱為PCR-SSCP技術(shù)檢測片斷長度：最好小于300bp.

策略:在疑有突變的DNA片段附近設(shè)計一對引物，進行PCR擴增。產(chǎn)物經(jīng)甲酰胺等變性，在中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳。突變所引起的DNA構(gòu)象差異將表現(xiàn)為電泳帶位置差異，從而作出判斷。應(yīng)用：DNA中單個堿基替代，微小缺失或插入檢測。SSCP３.變性高效液相色譜(DenaturingHighPerformanceLiquidChromatography，DHPLC）：利用高效液相色譜原理，PCR擴增后的DNA片斷經(jīng)DNA分離柱分離，經(jīng)流動相洗脫的核酸片段通過紫外或熒光檢測器檢測轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號儲存于計算機中，進行分析。

DNA柱分離原理:DNA在：非變性條件下按照片斷長度分離雙鏈DNA,適合做片斷大小分析;部分變性條件下可檢測變異(突變或多態(tài));完全變性條件下用于分離、純化單鏈核酸片段DHPLC分析DNA變異的原理：工作溫度(柱溫)是決定DHPLC敏感性的最關(guān)鍵因素。在DNA部分變性條件下，變異型和野生型DNA可形成同源和異源雙鏈．其在色譜柱上保留時間存在差異，異源雙鏈因存在錯配區(qū)而更易變性，在色譜柱保留時間短于同源雙鏈而先被洗脫下來，從而在色譜圖中表現(xiàn)為雙峰或多峰的洗脫曲線，據(jù)此可以分辨出變異型DNA.在經(jīng)歷95℃變性再緩慢復性后,存在多態(tài)或突變位點的靶序列PCR產(chǎn)物會雜交形成雜合雙鏈(heteroduplex)和純合雙鏈(homoduplex)混合物

TEAA(三乙銨醋酸鹽)DHPLC的特點：靈敏，準確；分析速度快，單個樣本的分析時間僅需幾分鐘；容易實現(xiàn)自動化操作；適用于較大樣本中基因突變的篩查檢測變異的PCR產(chǎn)物長度范圍最好在200～500bpDHPLC的應(yīng)用：

DNA片斷中突變的檢測和篩查；

多態(tài)的研究和基因型分析如SNP；甲基化分析；基因表達分析；寡核苷酸的純化與分析；

4等位基因特異性PCR（Amplificationrefractorymutationsystem,ARMS）--檢測已知突變的一種方法。５蛋白質(zhì)短截檢測（Proteintruncationtest，PPT）應(yīng)用:檢測因移碼突變、剪接位點突變或無義突變所致的蛋白質(zhì)截短。６化學切割錯配（Chemicalcleavagemismatch，CCM）

三、DNA測序

是指測定DNA克隆片段的精確核苷酸序列。最常用的方法是Sanger方法，即雙脫氧鏈末端終止法?；驹恚?/p>

待測DNA為模板，應(yīng)用DNA聚合酶，在合成DNA新鏈的過程中，分別摻入四種2′3′-雙脫氧核苷酸(ddATP,ddGTP,ddCTP,dTTP)，摻入的ddNTP無法形成磷酸二酯鍵而終止DNA鏈的延伸；將產(chǎn)生不同長度的DNA片段，在變性凝膠電泳中呈梯狀帶型，可以直接讀出DNA序列。Dideoxynucleotideblockschainelongationhttp://www.cbs.dtu.dk/staff/dave/roanoke/fig5_38.jpghttp://www.cbs.dtu.dk/staff/dave/roanoke/fig5_38.jpgDNA自動測序（第一代測序）第二代測序技術(shù)是對傳統(tǒng)測序的革命性改變。一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，稱為高通量測序技術(shù)?？蓪σ粋€物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細致全貌的分析，又稱深度測序(deepsequencing)。

Sanger測序法一次讀取1、2條序列

毛細管測序法一次讀取96條序列.

二代測序一次讀取幾百萬條序列，是一次革命性變革?，F(xiàn)有的二代測序技術(shù)平臺主要包括454(GS-FLX),Solexa,SOLID,polonator

測序原理：合成法測序連接法測序第二代測序技術(shù)不僅保持高準確度，而且大大降低測序成本、極大提高測序速度。其測序結(jié)果長度較短，比較適合于對已知序列的基因組進行重新測序，在對全新的基因組進行測序時還需要結(jié)合第一代測序技術(shù)。第三代測序的技術(shù)平臺之一，

納米孔單分子技術(shù)提高讀取長度，減少測序后的拼接工作量，實現(xiàn)對未知基因組進行測序。

將基因組DNA打碎成小片段，制成液滴分散于納米孔，孔底部錨定DNA聚合酶。當熒光標記的dNTP與測序模板結(jié)合，熒光被激發(fā)和檢測，然后DNA聚合酶將熒光標記切割、釋放，DNA聚合酶轉(zhuǎn)入下一位置四、轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控是細胞對內(nèi)、外刺激發(fā)生應(yīng)答的方式，涉及到基因組DNA和一系列結(jié)合蛋白的相互作用。為深入研究基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子機制，須研究DNA與蛋白質(zhì)相互作用，弄清楚特定基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域與哪種/些轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生了特異性結(jié)合。并需檢測相關(guān)基因啟動子的活性。1）DNA與蛋白質(zhì)相互作用的研究，生物信息學：預(yù)測DNA上可與特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的保守序列。電泳泳動遷移檢測(ElectrophoretjcMobilityShiftAssay，EMSA)染色質(zhì)免疫沉淀（ChromatinImmuno-precipitation，ChIP)DNasel足紋（跡）法酵母單雜交等；2）報告基因檢測分析

1電泳泳動遷移檢測(EMSA)EMSA：ElectrophoresisMobilityShiftAssayDNA片段與蛋白質(zhì)結(jié)合后，其在凝膠中的遷移率明顯降低，據(jù)此可檢測DNA和蛋白質(zhì)的相互作用（invitro)。RegulatoryRegionCodingSequenceGeneRegulationbyTranscriptionFactorsTheProbeDoublestrandedoligonucleotides

containingatranscriptionfactorbindingsite5’-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3’3’-TCAACTCCCCTCAAAGGGTCCG-5’Bindingmotif

主要步驟：

標記探針同核蛋白反應(yīng)電泳放射自顯影EMSA:PrincipleR.Voll09/01Adouble-strandedoligonucleotidecontainigaNF-B-bindingsiteislabeled

witharadioactiveisotopeandincubatedwithanuclearextract.Duringgel-electrophoresis,NF-Bboundtotheoligonucleotidecausesashiftcomparedtothefreeprobe.NF-BFreeProbeRadioaktivelylabeledoligonucleotidewithNF-B-bindingsite(probe)andboundNF-B

RadioactivelylabeledoligonucleotidewithNF-B-bindingsite(probe)EMSA超泳動supershift另外還需通過應(yīng)用核心序列突變的探針、以及未標記探針與標記探針的競爭等實驗進一步證明轉(zhuǎn)錄因子與探針的特異結(jié)合。2染色質(zhì)免疫沉淀(ChromatinImmunoprecipitation，ChlP)基本原理:在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－DNA復合物，細胞內(nèi)存在的許多DNA與蛋白質(zhì)間的相互作用被保留下來。細胞裂解后,用超聲波或酶將染色質(zhì)隨機切斷為一定長度范圍的小片段，再經(jīng)免疫學方法沉淀目的蛋白質(zhì)與DNA的復合體，特異性地富集與目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過對目的DNA片斷的純化與檢測，獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息(invivo)。應(yīng)用：ChIP不僅可以檢測體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關(guān)系。ChromatinImmuno-precipitation(ChIP)若ChIP技術(shù)與二代測序技術(shù)結(jié)合，稱為ChIP-Sequencing，可以分析某種特異DNA結(jié)合蛋白在全基因組范圍內(nèi)的DNA結(jié)合位點、組蛋白修飾、核小體定位等?？蓱?yīng)用到任何基因組序列已知的物種，可確切得到每一個片段的信息。是真核生物基因表達調(diào)控研究的常用方法報告基因(reportergene)是一種編碼易被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因。將報告基因編碼序列與待測基因的表達調(diào)控序列融合，在調(diào)控序列控制下進行表達，利用其表達產(chǎn)物來標定待測基因的表達調(diào)控。3.報告基因檢測作為報告基因，應(yīng)具備以下幾個條件：(1)已被克隆和全序列已測定；(