酶聯(lián)免疫吸附測定123

酶聯(lián)免疫吸附測定

（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,

ELISA

）

抗原-抗體反應的特點與影響因素反應條件：

自身因素:環(huán)境因素:適宜溫度電解質酸堿度特點：

特異性可逆性最適比例CompanyLogo凝集反應(agglutination):顆粒性抗原與抗體的反應。沉淀反應(precipitation):可溶性抗原與抗體的反應。補體參與的反應免疫標記技術（immunolabellingtechnique）:用示蹤物質標記抗原或抗體，進行抗原-抗體反應的檢測。

抗原-抗體反應的基本檢測方法CompanyLogo用示蹤物質標記抗體或抗原，使其與相應的抗原或抗體反應，使微量的、不可見的反應成為可見的或可測定的。CompanyLogo用FITC-抗IgM單抗計數(shù)B細胞免疫熒光技術CompanyLogo課程內容ELISA的原理ELISA的分類間接ELISA的具體操作ELISA在醫(yī)學中的應用實例CompanyLogoELISA的原理

1.抗原抗體反應的特異性2.抗原或抗體的固相化3.抗原或抗體的酶標記ECompanyLogo間接ELISA實驗目的：小鼠IgG免疫兔，檢測兔血清中抗小鼠IgG抗體的效價實驗材料：包被抗原：小鼠血清待檢抗體/一抗：兔抗小鼠IgG酶標抗體/二抗：HRP-驢抗兔IgG聚苯乙烯酶標板水浴箱

移液器槍頭包被液：pH9.6的碳酸鹽緩沖液

封閉液/

封：5%脫脂奶粉(ALB)稀釋液/?。簆H7.40.05M的PBS（磷酸鹽緩沖液）

洗液：PBST（PBS+0.05%吐溫20）

顯色液：四甲替聯(lián)苯胺(TMB)

終止液/終：2M硫酸陽性反應的最大稀釋度為待測樣品的效價。鼠IgG(抗原)兔抗小鼠IgG(一抗)HRP-驢抗兔IgG(二抗)免疫兔免疫驢CompanyLogo操作步驟包被：1：2000稀釋的正常小鼠血清，4℃過夜封閉：5%脫脂奶粉，37℃，20min加待檢抗體：倍比稀釋兔抗鼠IgG抗血清，37℃15min加酶標抗體：1:5000稀釋的HRP標記的驢抗兔IgG抗血清(已稀釋好)，37℃15min加底物液顯色→→→→洗滌：3次，1min/次洗滌：3次，1min/次洗滌：3次，1min/次→終止液終止顯色（黃）空白對照無顯色待測樣品顯色明顯(藍)EEEE底物液底物、終止液加50ul／孔封一抗二抗無色避光從此步開始本次實驗！CompanyLogo倍比稀釋法與加樣除第一列孔外，先在其余每孔加100ul稀釋液(稀)；在第一列孔加入200ul一抗；取100ul加入第二列孔，混勻從第二列孔取100ul液體至第三列孔；。。。。。。AB123456789101112blank

每孔終體積為100ul,上下兩排一致一抗1:5001:1000…….1:2000100μL100μL100μLCompanyLogoELISA的分類（一）直接法（二）間接法（三）雙抗體夾心法（四）競爭法CompanyLogo（一）直接法CompanyLogo間接法的原理為利用酶標記的二抗以檢測已與固相結合的受檢一抗，故稱為間接法。其優(yōu)點在于只要變換包被抗原就可利用同一酶標二抗建立檢測相應一抗的方法?？捎糜趥魅静〉脑\斷。（二）間接法（測抗體）酶標二抗一抗AgwashBSAwashwashTMB血清CompanyLogo（三）雙抗體夾心法（測抗原）只要獲得針對受檢抗原的特異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶標Ab而建立此法。此法適用于檢驗各種蛋白質等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。包被Ab酶標AbAgTMBwashwashwash血清CompanyLogo（四）競爭法（HBcAb

）

當抗原材料中的干擾物質不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體；如HBeAb，HBcAb；

小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個以上的位點，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。小分子激素、藥物等ELISA測定多用此法。

washTMBHBcAg酶標HBcAbwashHBcAb血清CompanyLogo病原微生物及其抗體檢測如:肝炎病毒,SARS等

臨床疾病診斷中的應用蛋白質測定:各種免疫球蛋白、補體、腫瘤標記物ELISA在醫(yī)學中的應用CompanyLogoTMB+H2O2聯(lián)苯醌

+2H2O酶催化底物液顯色ECompanyLogo結果的判定肉眼判定結果：于白色背景上直接肉眼觀察。顏色越深，反應越強；陰性反應為無色或極淺。而樣品顯色明顯且逐漸變淺，根據(jù)顏色的深淺，以“＋”、“－”表示。測定A值：在酶標儀上，根據(jù)不同底物設定波長（TMB底物為450n