第9章 生物大分子進(jìn)化

第9章生物大分子進(jìn)化內(nèi)容自然界生物大分子進(jìn)化1生物大分子進(jìn)化方法2生物大分子進(jìn)化的概念和思路3分子多樣性的建立4

分子庫的放大5標(biāo)記和區(qū)分蛋白質(zhì)分子6挑選和篩選7應(yīng)用實(shí)例89.1自然界的生物大分子進(jìn)化達(dá)爾文(1809～1882)

出生于英國西部一個世代為醫(yī)的家庭。乘貝格爾號艦作了歷時5年的環(huán)球航行，對動植物和地質(zhì)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行了大量的觀察和采集。

19世紀(jì)中期，達(dá)爾文，在物種起源書中提到了進(jìn)化論。物種進(jìn)化的兩個因素：遺傳突變自然選擇自然選擇：

環(huán)境條件對于生物的變異進(jìn)行選擇而導(dǎo)致適者生存、不適者被淘汰的過程。

突變不被淘汰遺傳信息儲存在基因組中；基因組序列在自然情況下存在隨機(jī)突變概率；突變可遺傳給子代；增加種群的基因多樣性。優(yōu)勢基因頻率增加進(jìn)化

自然選擇生物大分子進(jìn)化DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子的功能從無到有從簡單到復(fù)雜從低級到高級自然界的生物大分子多樣性和RNA世界假說生物大分子的進(jìn)化基因數(shù)量龐大RNA剪切，表達(dá)產(chǎn)生不同的蛋白蛋白質(zhì)剪切酶將蛋白質(zhì)連接在一起；翻譯后修飾；多樣性RNA世界假說

DNARNA蛋白質(zhì)

1981年度諾貝爾化學(xué)獎獲得者吉爾伯特（W.Gilbert）提出了“RNA世界”的假說。指的是“在生命起源的某個時期，生命體僅由RNA組成。遺傳信息的傳遞建立于RNA的復(fù)制，其復(fù)制機(jī)理與當(dāng)今DNA復(fù)制機(jī)理相似，作為生物催化的、由基因編碼的蛋白質(zhì)還不存在”。

容易發(fā)生突變，因此在攜帶遺傳信息的能力方面，RNA不如DNA；RNA又由于組成沒有蛋白質(zhì)復(fù)雜，不可能形成如蛋白質(zhì)那么多樣的結(jié)構(gòu)，因此在功能分子的作用方面，RNA又不如蛋白質(zhì)。

RNA可自我復(fù)制RNA具有催化功能當(dāng)DNA和蛋白質(zhì)功能完善后RNA分子才被取代喬伊斯，ScrippsResearchInstitute所長

發(fā)現(xiàn)了一對短小但功能強(qiáng)大的RNA序列，把它們和一堆結(jié)構(gòu)更簡單的RNA“原料”混在一起.結(jié)果：數(shù)量會不斷倍增，幾小時內(nèi)就能擴(kuò)增至原來的10倍，而且只要有充足的原料和空間，這種擴(kuò)增過程就不會停止。

問題RNA又是怎么產(chǎn)生的？9.2化學(xué)生物學(xué)中的生物大分子進(jìn)化方法自然界進(jìn)化的優(yōu)點(diǎn)：生物多樣性豐富，種群巨大；生物本身調(diào)控系統(tǒng)精密；缺點(diǎn)：不能定向突變；突變概率低；周期長。分子庫擴(kuò)增9.3生物大分子進(jìn)化的基本概念和思路多樣化分子進(jìn)化目標(biāo)分子競爭篩選自然界生物大分子放大文庫分子篩選目標(biāo)分子9.4分子多樣性的建立分子多樣性的建立是生物大分子進(jìn)化的基礎(chǔ)。DNA穩(wěn)定性好；易操作；通過改變條件和模板就能得到不同序列和結(jié)構(gòu)的DNA；可以轉(zhuǎn)錄和翻譯變成RNA和蛋白質(zhì)。DNA文庫的突變方法基因組隨機(jī)突變易錯PCR定點(diǎn)突變DNA改組法9.4.1基因組的隨機(jī)突變法方法：天然隨機(jī)突變物理化學(xué)誘變化學(xué)：羥胺、溴乙錠、烷基化試劑、強(qiáng)氧化劑等。物理：放射性誘變（紫外線）。紫外線突變頻率10～10天然突變頻率10～10-4-9-9-10基因組的隨機(jī)突變法缺點(diǎn)不能實(shí)現(xiàn)對特定基因的突變關(guān)鍵突變頻率的選擇突變頻率太高會導(dǎo)致絕大多數(shù)突變?yōu)橛泻ν蛔儯瑹o法篩選到有益突變;突變頻率太低則會導(dǎo)致文庫中全是野生型群體。9.4.2易錯PCR

采用DNA聚合酶進(jìn)行目的基因擴(kuò)增時，通過調(diào)整反應(yīng)條件，來改變擴(kuò)增過程中的突變頻率，從而以一定的頻率向目的基因中隨機(jī)引入突變，獲得蛋白質(zhì)分子的隨機(jī)突變體。條件

高鹽和添加劑存在的條件下，聚合酶的PCR的反應(yīng)錯誤率可達(dá)0.7%。具體方法如提高鎂離子濃度、加入錳離子；改變體系中四種的dNTPs濃度；運(yùn)用低保真度DNA聚合酶等。9.4.3定點(diǎn)誘變

在體外特異性地取代、插入或缺失DNA序列中任何一個特定堿基的技術(shù)。分類：定點(diǎn)突變、盒式定點(diǎn)突變、PCR突變。定點(diǎn)突變ＡＡＧＣＧ盒式定點(diǎn)誘變文庫分子

定點(diǎn)突變文庫篩選9.4.4DNA改組DNAShuffling是運(yùn)用隨機(jī)突變技術(shù)，對某種感興趣的蛋門質(zhì)或核酸進(jìn)行快速的改造，并定向選擇所需性質(zhì)的生物分子。

原理單個基因或一組相關(guān)基因經(jīng)酶切產(chǎn)生一系列隨機(jī)大小的DNA片段。無引物PCR，具有互補(bǔ)3’末端的片段互為引物，各為模板，通過不斷的PCR循環(huán)在不同模板上隨機(jī)互補(bǔ)結(jié)合并進(jìn)一步延伸。最后利用基因兩端序列為引物合成全長的重排產(chǎn)物，這些重排產(chǎn)物的集合被稱為突變文庫。對突變文庫進(jìn)行篩選，選擇改良的突變體進(jìn)行下一輪shuffling循環(huán)，重復(fù)多次重排和篩選，直到最終獲得性狀比較理想的突變體。進(jìn)行定向進(jìn)化的生物活性分子可以是那些由于毒性太大而無法大劑量使用的蛋白質(zhì)藥物;可以是基因治療載體和基因藥物等核酸分子。示意圖FamilyshufflingDNA改組成功與否取決于三個因素：相關(guān)基因組中基因的相似程度;酶切產(chǎn)生的DNA片段小大;退火溫度。

優(yōu)點(diǎn)人工理性設(shè)計DNAShuffling隨機(jī)性同序比對9.5分子庫的放大構(gòu)建出的文庫分子的拷貝數(shù)不高需要放大一鍋法

DNA：PCRRNA：RT-PCRPCRRT-PCRRNAcDNADNA9.6標(biāo)記和區(qū)分蛋白質(zhì)分子

蛋白質(zhì)是生物體功能實(shí)現(xiàn)的載體，蛋白質(zhì)分子不能直接放大。

需要對其標(biāo)記和區(qū)分放大方法

目標(biāo)蛋白質(zhì)的基因與特殊的表達(dá)生物體結(jié)合，通過表達(dá)將蛋白質(zhì)展示出來。

細(xì)胞展示噬菌體展示

具體方法核糖體展示

mRNA展示

9.6.1細(xì)胞展示將含有標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白的DNA導(dǎo)入到細(xì)胞中；挑選單克隆；誘導(dǎo)表達(dá)蛋白；通過特定的選擇系統(tǒng)對蛋白質(zhì)進(jìn)行選擇。缺點(diǎn)：文庫的量很??；不能精確控制；9.6.2噬菌體展示

將目標(biāo)蛋白的基因與噬菌體外殼蛋白基因相連接，使外源DNA所編碼的蛋白質(zhì)以融合蛋白形式表達(dá)在噬菌體表面的方法。噬菌體感染細(xì)菌的病毒。噬菌體顆粒感染一個細(xì)菌細(xì)胞后可迅速生成幾百個子代噬菌體顆粒，每個子代顆粒又可感染細(xì)菌細(xì)胞，再生成幾百個子代噬菌體顆粒。如此重復(fù)只需4次，一個噬菌體顆粒便可使幾十億個細(xì)菌感染而死亡。

9.6.3核糖體展示

蛋白及其mRNA同時結(jié)合在核糖體上，形成mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)三聚體，使目的蛋白展示在核糖體表面，將基因型和表型聯(lián)系起來，同時含有mRNA的標(biāo)簽可以通過逆轉(zhuǎn)錄進(jìn)行放大。

mRNA-核糖體-蛋白質(zhì)三元復(fù)合物文庫方便的對目標(biāo)蛋白進(jìn)行選擇處理，通過親和篩選的方法富集含有目標(biāo)蛋白質(zhì)的復(fù)合物，后對其進(jìn)行放大操作。缺點(diǎn)：不是很穩(wěn)定ribosomedisplay9.6.4mRNA展示

mRNA展示技術(shù)一種新興的體外多肽篩選技術(shù)?？梢赃\(yùn)用于生物分子配體的發(fā)現(xiàn)和相互作用的分析。

原理

嘌呤霉素是一種分子質(zhì)量小、化學(xué)性質(zhì)為穩(wěn)定的氨酰tRNA類似物。當(dāng)3‘端帶有嘌呤霉素連接子的mRNA在體外翻譯系統(tǒng)中完成翻譯時，嘌呤霉素模擬tRNA末端的氨?；Y(jié)構(gòu)，進(jìn)入核糖體的A位點(diǎn)，抑制了蛋白質(zhì)的翻譯，在新生肽鏈和嘌呤霉素的O-甲基酪氨酸之間形成穩(wěn)定的酰胺鍵，使mRNA的3’端與多肽的羧基端共價結(jié)合起來。

9.7挑選和篩選分類：體內(nèi)Invivo、體外Invitro篩選：對文庫的每一個分子都進(jìn)行嘗試，找出目標(biāo)。挑選：不需對文庫的每一個分子都進(jìn)行嘗試，只需要設(shè)定一個條件，符合條件的分子將被挑選出。挑選和篩選的比較體內(nèi)體外篩選比較樣品的顏色、熒光等物理化學(xué)性質(zhì)讓細(xì)胞產(chǎn)生各種顏色、熒光或具有放射性等挑選如共價或非共價結(jié)合在某固定相表面只表達(dá)了特異蛋白的細(xì)胞才能存活10文庫大小篩選：10挑選：10～10515挑選流程篩選挑選優(yōu)點(diǎn)簡單快速缺點(diǎn)耗時需建立體系Conclusion定向進(jìn)化=突變

+

篩選

Gene/genescodingforenzymesofinteresting突變Poolofmutantgenes轉(zhuǎn)化宿主菌篩選單一突變基因的克隆好的突變進(jìn)行下一輪突變突變的優(yōu)良基因酶的生產(chǎn)和性質(zhì)改進(jìn)重復(fù)定向進(jìn)化9.8生物大分子進(jìn)化應(yīng)用實(shí)例9.8.1自然改進(jìn)型分子進(jìn)化

（1）綠色熒光蛋白2008年諾貝爾獎錢永健下村修錢永健

1994年，開始改造GFP，有多項(xiàng)發(fā)現(xiàn)。世界上用的大多數(shù)是錢永健實(shí)驗(yàn)室改造后的變種，有的熒光更強(qiáng)，有的黃色、藍(lán)色，有的可激活、可變色。綠色熒光蛋白分子進(jìn)化DNA改組DNA文庫轉(zhuǎn)化細(xì)胞細(xì)胞展示體外篩選改進(jìn)后效果發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)45倍；激發(fā)光和發(fā)射光單色性有改善；進(jìn)化出了黃色、紅色等蛋白。雙內(nèi)含肽系統(tǒng)純化蛋白質(zhì)原理內(nèi)含肽1:SynechocystisspDnaBintein內(nèi)含肽2:MycobacteriumxenopiGyrAintein

23℃pH7.0GFPmut3*雙內(nèi)含肽蛋白純化過程

DTT上柱剪切洗脫15℃+IPTG

4℃幾丁質(zhì)柱剪切含cGFPmut3*表達(dá)的E.coli

激光共聚焦照片明場熒光疊加

優(yōu)化的誘導(dǎo)表達(dá)溫度：15℃含GFPmut3*內(nèi)含肽融合前體表達(dá)的E.coli

激光共聚焦照片明場熒光疊加親和純化得到的GFPmut3*SDS電泳圖Lane1:蛋白MarkerLane4:Lane3上清液通過幾丁質(zhì)柱液后的溶液Lane2:誘導(dǎo)前的細(xì)胞粗提液Lane5:柱上洗脫的目的蛋白Lane3:IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)胞破碎

Yield：2.41mg\LPurity：>95%

純化的GFPmut3*的光譜學(xué)特性

GFPmut3*的熒光光譜Ex=502nmEm=511nmGFPmut3*的紫外吸收光譜

GFP的結(jié)構(gòu)示意圖

GFPmut3*的圓二色性光譜用途生物分子示蹤金屬離子、小分子的傳感器研究分子成像

（2）非天然氨基酸的定點(diǎn)插入定向進(jìn)化tRNA和氨酰tRNA合成酶只能識別20種氨基酸識別非天然氨基酸進(jìn)化非天然氨基酸定點(diǎn)插入具體步驟確定目標(biāo)tRNA建立氨酰tRNA合成酶文庫轉(zhuǎn)入細(xì)胞利用TAG作為非天然氨基酸的插入位點(diǎn)挑選非天然氨基酸優(yōu)點(diǎn)小巧，不會干擾蛋白質(zhì)的正常功能；不需報告基因是蛋白質(zhì)自身具有熒光功能；可識別金屬離子；對pH值環(huán)境有特別響應(yīng)。9.8.2新功能分子進(jìn)化生長激素的重塑腺垂體細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞生長和分化的重要因子。

受體與激素結(jié)合，傳遞信號激素生物大分子進(jìn)化重塑生長激素和受體的相互作用

受體的SerAla進(jìn)化具體方法突變方法構(gòu)建分子庫導(dǎo)入噬菌體噬菌體展示放大體外挑選富集含目標(biāo)的噬菌體結(jié)果得到5個氨基酸突變的生長激素，受體和激素之間的相互作用提高了1000倍。改變蛋白質(zhì)之間的相互作用促紅細(xì)胞生成素

一種糖蛋白細(xì)胞因子，可以增加人體血液中紅細(xì)胞數(shù)量、提高血液含氧量的激素。適應(yīng)癥為腎功能衰竭導(dǎo)致的貧血、惡性腫瘤或化療導(dǎo)致的貧血、失血后貧血