脂肪干細胞和生物支架應用于修復骨缺損的文獻綜述,口腔科學論文

脂肪干細胞和生物支架應用于修復骨缺損的文獻綜述,口腔科學論文因外傷、感染、腫瘤、年齡和激素水平等病理或生理性原因造成的牙槽骨吸收、缺損在臨床中很常見，怎樣重建缺損牙槽骨以便于后續(xù)口腔治療的順利進行成為臨床醫(yī)生熱切關注的問題。當前臨床常用的修復方式方法包括：骨移植、上頜竇提升術、引導組織再生術、牽張成骨術等，但效果都不甚理想。近年來，骨組織工程的興起為修復缺損牙槽骨帶來了新的生機。1995年Crane等系統(tǒng)的提出了骨組織工程的概念、研究方式方法、研究現(xiàn)在狀況及發(fā)展前景，引起了廣大學者的關注。骨組織工程是利用組織工程學的原理和方式方法研究細胞復合三維生物支架修復骨缺損的一門學科。當前尋找具有良好臨床應用前景能用骨組織工程或細胞治療的新的干細胞來源和合適于細胞的新型生物支架已成為大多學者的研究目的。近年來脂肪源性干細胞以其來源充足，取材容易，獲取率高，患者痛苦小以及強大的擴增和分化潛能等獨特的優(yōu)勢得到了廣泛的關注。本文就骨組織工程的兩大關鍵因素種子細胞和生物支架以及體內實驗作一綜述。1、資料和方式方法Dataandmethods1.1資料來源檢索人相關內容：。1.2檢索方式方法納入標準：關于脂肪干細胞、生物支架及動物實驗的實驗性研究成果報道。具有原創(chuàng)性，論點論據(jù)可靠，與本文題相關度高的文章。對同一領域的文獻選擇最近發(fā)表或權威雜志的文獻。排除標準：文獻陳舊以及一些重復性研究。1.3質量評估。初檢得到163篇相關文獻，閱讀標題和內容摘要進行初篩，排除因研究目的與此文無關7篇，排除較陳舊的文獻46篇，內容重復的文獻39篇；其余做進一步分析閱讀，查閱全文，判定與納入標準一致的文章，最后選擇40篇符合標準的文獻。2、結果Results2.1納入文獻基本情況。納入的40篇文獻中，中文文獻5篇，英文文獻35篇。文獻1是骨組織工程的提出，文獻[2-7]主要牽涉脂肪干細胞的來源、重要性及介入的血管工程骨實驗，文獻[8-20]討論生物支架的種類及特性，文獻[21-31]討論生物支架對種子細胞的影響，文獻[32-40]是論證骨髓基質干細胞復合生物支架用于動物實驗的成果。2.2檢索結果描繪敘述2.2.1脂肪干細胞的來源和應用價值脂肪干細胞的骨組織工程的種子細胞研究較早較多的是骨髓基質干細胞，但骨髓采集有潛在的局限性，骨髓中干細胞含量很少，不易獲取，擴增能力有限，有創(chuàng)操作，對患者傷害大等。因而，很多學者致力于尋找一種新的種子細胞。在整形外科抽脂術普及的同時，有學者發(fā)如今脂肪組織中能以最小的傷害度獲得大量干細胞，其能夠成為一個干細胞源的替代。2001年，Zuk等從抽脂術獲取的脂肪組織中分離出具有多向分化潛能的細胞，該細胞可向脂肪細胞、軟骨細胞、肌源性細胞、骨源性細胞及血管內皮細胞等多種細胞分化，具有干細胞所特有的多向分化潛能及自我復制能力，因而，將其命名為脂肪源性干細胞，簡稱脂肪干細胞。這些細胞在活性誘導成骨因子的作用下，能夠表示出骨細胞的表型，并分泌胞外基質，提示了這些細胞可能具有骨髓基質干細胞類似的特征。脂肪干細胞的應用價值：脂肪干細胞是一種很有應用前景的種子細胞，其優(yōu)點有：來源廣泛，脂肪組織在體內分布廣泛，儲量豐富，可根據(jù)細胞需要量通過常規(guī)抽脂術獲得，不需體外長期培養(yǎng)擴增，避免了傳代引起細胞生物學特性改變的風險。具有一定的免疫調節(jié)能力。有研究表示清楚，脂肪干細胞與骨髓基質干細胞具有類似的免疫原性，在體外可抑制淋巴細胞增殖，調節(jié)淋巴細胞的反響能力。易采集，經(jīng)濟便捷，對患者心理影響小，患者易接受。移植方式自體、異體均可，且結果安全有效。易于臨床推廣，且在體內無活性誘導因子刺激可以以成骨，這使它在將來骨組織工程修復骨缺損的應用中備受關注。Zuk等在抽脂術獲得的脂肪組織中提取脂肪干細胞，平均每300mL脂肪組織可獲得2108-6108個細胞，它是一群混合細胞，除大量的脂肪干細胞外，還有少量的非間充質干細胞，如前脂肪細胞、內皮細胞和平滑肌細胞等。但經(jīng)過傳代非間充質干細胞逐步消失，可得到純化的脂肪干細胞。在細胞培養(yǎng)方面，其與研究較成熟的其他成體干細胞相比有特有的優(yōu)勢：脂肪干細胞易體外培養(yǎng)，置于37℃、體積分數(shù)5%CO2的孵箱中即可；營養(yǎng)需求低，在含體積分數(shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)；體外擴增迅速、持久，體外倍增時間16-48h即可傳代，即便傳代屢次(第10代出現(xiàn)衰老細胞少于5%，第15代時低于15%)仍能表示出干細胞表型，維持多向分化的潛能，由此可看出脂肪干細胞易獲得，在體外較長時期內具有穩(wěn)定的增殖能力和低衰老率；貼壁能力強，原代2h即可貼壁，24h幾乎全部貼壁，傳代后6h幾乎全部貼壁等。這充分表示清楚脂肪干細胞具有強大的擴增能力，可通過傳代培養(yǎng)純化獲得大量易定向分化的干細胞來知足實驗和臨床需要。另外，利用脂肪干細胞的多向分化功能可構成血管化工程骨，Sahar等用血管內皮生長因子和骨形態(tài)發(fā)生蛋白分別誘導的脂肪干細胞復合聚乳酸支架植入Lewis鼠顱骨缺陷模型，8周后檢測，研究證實血管內皮生長因子誘導的脂肪干細胞雖不會增加骨構成，但可作為細胞源用于改善血管，潛在的提高成骨分化功能。血管內皮細胞可分泌骨形態(tài)發(fā)生蛋白，脂肪干細胞可分泌血管內皮生長因子，二者共培養(yǎng)可互相作用促進成骨，Zhao等將血管內皮細胞和脂肪干細胞共培養(yǎng)誘導6周，免疫熒光分析，堿性磷酸酶活性，骨鈣素表示出顯著增高，暗示血管內皮細胞和脂肪干細胞的共培養(yǎng)系統(tǒng)可作為骨工程的細胞新來源。因而，脂肪干細胞是一個很有發(fā)展?jié)撃艿母杉毎麃碓?，具有非常重要的研究和應用價值。2.2.2生物支架的種類及特性。不同的生物材料對細胞有不同的影響，選擇適宜的支架是骨組織工程的又一關鍵因素。理想的支架材料應具備下面性能：良好的生物相容性，盡量不引起免疫排異反響，不致畸?？山到?，最終被自體再生組織替代，降解產(chǎn)物對細胞無毒害作用，降解速率應與組織再生速率相協(xié)調。良好的材料-細胞界面，利于細胞的黏附、增殖和生長。一定的可塑性，可根據(jù)缺損情況設計外形。三維構造，多孔性和高孔隙率，孔隙率最好達90%以上，既利于細胞的黏附和長入，又利于營養(yǎng)物質與代謝物的交換。知足生理需要的力學特性。具有良好的骨傳導性和誘導性。較易制備，成本低，易消毒等。常用的骨組織工程的支架材料分為天然的和人工合成的，后者又可分為有機和無機的。天然高分子材料：天然高分子材料包括：膠原、殼聚糖(chitosan，CS)、脫鈣骨基質等。這類材料本身就具有一樣或類似于細胞外基質的構造，具有良好的生物相容性和降解性，能促進細胞的黏附、增殖和分化。例如膠原是一種天然蛋白質，在體內為鈣化組織提供必不可少的三維構造基礎，誘導礦物質沉積。牛剛等利用山羊雙側下頜骨牽張成骨動物模型研究膠原海綿在下頜骨牽張成骨早期成骨中的作用，結果證明參加膠原海綿的實驗側牽張區(qū)新骨早期成骨效果明顯好于同期的對照側，講明膠原海綿具有良好地促進牽張區(qū)新骨早期構成和礦化的作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，骨髓基質干細胞復合膠原海綿共培養(yǎng)，成骨誘導14d檢測，堿性磷酸酶染色強陽性,茜蘇紅染色細胞外鈣鹽沉積及鈣結節(jié),表示清楚細胞向成骨細胞分化?？谇活M面部顳下頜關節(jié)盤基質中主要是Ⅰ型膠原，用Ⅰ型膠原做支架材料修復其損傷，可為關節(jié)盤生長和分化創(chuàng)造出愈加接近天然生長的微環(huán)境，更利于組織修復。但其來源稀少，大量制備困難，機械性能差，加工性、重現(xiàn)性、降解速度可調性不理想，而且存在轉染動物基因和產(chǎn)生免疫反響的風險。因而，難以單獨作為骨組織工程的支架材料。人工合成無機材料：人工合成無機材料包括羥基磷灰石和磷酸三鈣、生物活性玻璃等。這類材料具有良好的骨誘導性和傳導性，人類骨組織中含有一些與其組成元素一樣的成分如鈣磷等，可促進骨組織新生。如磷酸三鈣不僅有可降解性，并且能通過釋放鈣磷離子促進組織的礦化。所以在口腔頜面骨，尤其是修復缺損牙槽骨人工合成無機材料的應用是一大熱門。Wang等研究利用磷酸三鈣結合自體成骨細胞構建工程骨修復犬牙槽嵴模型，結果成骨細胞/磷酸三鈣組顯著加強了新骨的構成與礦化，并保持了牙槽嵴的高度與厚度，效果可與自體髂骨移植組相媲美，講明磷酸三鈣作為骨組織工程支架材料的潛力。Kim等研究證實多孔TCP涂層Al2O3支架植入兔缺損模型比未涂層支架組在24周時顯示出3倍的骨組織長入。鈣基材料可刺激成骨細胞在體內外增殖或成骨，這類材料的使用成為一種有效的方式方法來提高工程化骨。但這類材料的缺點是脆性大、易折、易疲憊，降解速度可調性差，材料降解與骨新生速度不協(xié)調等。人工合成高分子有機材料：人工合成高分子有機材料包括：聚乳酸(polylactic；acid，PLA)、聚羥基乙酸(polylglycolic；acid，PGA)及其共聚物聚乳酸-聚羥基乙酸(polylactic-co-glycolic，PLGA)等。這類材料易制作，構造多變，可塑性強可根據(jù)缺損設計外形，生物相容性良好等。Park等將脂肪干細胞復合可吸收的聚乳酸-聚羥基乙酸支架成骨誘導共培養(yǎng)4周，修補大鼠脛骨臨界尺寸缺損模型，CT顯示近完全愈合，RT-PCR分析成骨基因表示出顯著。Mahmoudifar等將脂肪干細胞接種于聚羥基乙酸網(wǎng)狀支架共培養(yǎng)，2周后檢測骨橋蛋白和骨鈣素高表示出。但這類材料的缺點有親水性差，細胞吸附能力弱；降解產(chǎn)物會使pH值下降，引起無菌性炎癥；機械強度差，對于承重部位缺損單獨使用效果差，所以單獨應用這類材料也不理想。綜上所述，單一類型的材料單獨應用其成骨作用有限，不能到達很好的臨床效果。為了加強其成骨作用，很多學者綜合了各類材料的優(yōu)缺點，將單一材料合成復合支架材料應用于骨組織工程領域。Kim等在殼聚糖和殼聚糖/羥基磷灰石支架上接種人間充質干細胞，結果復合材料組可加強細胞的黏附與增殖，堿性磷酸酶活性更高層次，骨鈣素顯著增高。趙健等研究Bio-oss膠原支架復合細胞修復種植體周圍骨缺損，效果良好。這都講明復合材料相對于單一材料具有優(yōu)越性?；钚砸蜃佑姓T導成骨的作用，Deconde等將骨形態(tài)發(fā)生蛋白2浸染的仿生支架植入大鼠下頜骨缺損模型，治療后2個月，CT分析成功誘導下頜骨缺損愈合。劉冰等在牙槽骨缺損處植入重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2修飾的復合支架，誘導新骨構成以填充缺損，與對照組(未用人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2修飾組)相比成骨效果顯著。復合材料集合各類材料優(yōu)點，在實驗中獲得了良好的效果，是一類很有發(fā)展前景的生物支架材料。當前對復合材料的研究正逐步引入納米技術和基因轉染技術等。2.2.3生物支架對種子細胞的影響。引導細胞向三維方向生長有利于組織修復，然而細胞自由的生長遷移會構成一個二維細胞層，這不能知足組織工程的需要。生物支架具有三維構造，是細胞外基質的替代物，不僅起支撐作用，保持原組織形狀，而且為細胞在缺損區(qū)的黏附、生長和分化提供了穩(wěn)固的框架，為組織的修復活動提供適宜的微環(huán)境，有利于組織修復的進行。因而，生物支架對細胞生物學行為有很重要的影響。黏附作用：生物支架對種子細胞的有利作用是組織工程發(fā)展的重要要求之一?？焖?、高效和空間上均勻的細胞黏附能夠提高組織工程的臨床潛力。支架對細胞黏附作用的影響是多方面的，主要是材料的外表性質，材料的親水性、外表荷電性、外表修飾物、外表自由能等都將不同程度的影響細胞與材料的黏附。有研究發(fā)現(xiàn)用含帶正電基團的氨基酸修飾材料外表，可提高材料外表的荷電濃度，增加黏附細胞數(shù)量和加強細胞黏附力。材料粗糙程度也影響細胞的黏附。Strauss等研究證實鎳鈦納米外表涂層增加外表粗糙度，更有利于細胞的黏附。另外，支架的多孔構造及孔徑大小對細胞的黏附也有一定的影響。Marino等將人脂肪干細胞與多孔三維支架磷酸三鈣復合后共培養(yǎng)，結果證實細胞黏附性明顯加強。增殖作用：組織修復需在細胞增殖、生長的前提下才能完成。修復經(jīng)過中，支架材料的降解成分溶于培養(yǎng)液中可帶給細胞不同的生長微環(huán)境，引起細胞信號傳導的變化而影響細胞的增殖。如鈣磷生物陶瓷類材料溶解產(chǎn)生的鈣磷離子對成骨細胞的增殖起著重要的作用。羥基磷灰石成分類似骨和牙齒，有良好的生物相容性，在細胞培養(yǎng)中，羥基磷灰石/殼聚糖膜比單純殼聚糖膜可吸收更多的Ca2+，細胞更好的黏附、增殖和成骨分化，骨鈣素、骨橋蛋白、Ⅰ型膠原蛋白高表示出。Verma等將成骨細胞與殼聚糖/果膠酸/羥基磷灰石復合支架材料共培養(yǎng)，結果有效促進了成骨細胞的黏附和生長，增殖作用更明顯。增加生物支架的孔徑大小和孔隙率也有利于細胞的增殖和加強組織再生。Kim等用TCP涂層氧化鋁后燒結生成外表多孔支架，空隙介于100-600?m(理想細胞增殖支架)，細胞增殖分化能力明顯高于非涂層支架。另外，如血小板衍生生長因子、轉化生長因子1、堿性成纖維細胞因子等一些生長因子對細胞的增殖也有一定的影響。Xu等將不同濃度血小板衍生生長因子BB結合骨髓基質干細胞/磷酸三鈣修復鼠顱骨標準尺寸缺損，結果實驗組比對照組(不含血小板衍生生長因子BB)細胞增殖能力明顯加強，8周后計算機斷層掃描和組織學分析新骨構成，且濃度高者更佳，講明血小板衍生生長因子可促進細胞增殖與成骨分化。分化作用：一些生物支架材料具有與天然骨類似的化學成分，如羥基磷灰石、TCP等生物陶瓷類材料在培養(yǎng)經(jīng)過中能釋放鈣磷等離子，可促進細胞的成骨分化。Eyckmans等證明鈣磷可激活相關分子信號通路，加強體內鈣磷驅動、異位成骨的內在機制，將人骨膜衍生細胞接種于羥基磷灰石/膠原支架和脫鈣支架植入裸鼠皮下異位成骨，細胞成骨分化發(fā)生在羥基磷灰石/膠原支架，基因動態(tài)表示出也快于脫鈣支架。Charles等將成骨細胞復合聚乳酸/CaP支架體外培養(yǎng)，觀察細胞的成骨能力，結果證實支架對細胞的成骨分化能力影響顯著。支架的外表活性基團，幾何拓撲構造，基底模量等都是影響細胞分化的因素。Chen等以透明質酸、甲基膠原修飾聚已內酯(Polycaprolactone，PCL)三維支架外表，干細胞在支架上的成骨分化能力明顯改善。細胞成骨分化也受很多激素、細胞因子及一些小分子的調控，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白2、Wnts等對促進成骨分化有重要的作用。Zhang等將人牙周膜細胞接種于殼聚糖/膠原支架，復合編碼人骨形態(tài)發(fā)生蛋白7的腺病毒載體后，植入下頜骨模型處，4周和8周檢測，結果顯示比對照組，未復合編碼人骨形態(tài)發(fā)生蛋白7的腺病毒載體的支架〕堿性磷酸酶活性、骨鈣素、骨涎蛋白表示出更高層次。因而，將一些成骨誘導因子整合到生物支架上對骨組織工程研究有很大的意義。2.2.4脂肪干細胞復合生物支架用于動物實驗的研究骨組織工程中，脂肪干細胞的體內成骨能力已被證實，而且脂肪干細胞復合生物支架構建工程骨的動物體內實驗也一直被研究。Dragoo等將大鼠脂肪干細胞接種于聚乳酸-聚羥基乙酸支架上，植入裸鼠背部皮下共培養(yǎng)，成功生成組織工程骨，這是初次利用脂肪干細胞體內培養(yǎng)成骨的實驗報道。Haslauer等研究證實人脂肪干細胞在雙組份納米纖維支架(膠原蛋白-聚已內酯鞘涂層)比單組分支架(聚已內酯鞘涂層)上有更大的擴散、增殖，鈣堆積量高于5倍，更有利于成骨，這是初次研究雙組份納米纖維支架對人脂肪干細胞的活力、增殖及成骨的影響。Tobita等在大鼠牙周組織缺損模型中參加脂肪干細胞和富血小板血漿的混合物，實驗發(fā)現(xiàn)有牙槽骨和牙周膜韌帶樣構造的再生，將來可用于臨床牙周疾病的治療。LeviB等將新鮮未進行成骨誘導的脂肪干細胞的接種至聚乳酸-聚羥基乙酸支架植入鼠顱骨缺損處，結果有新骨構成，進一步肯定了脂肪干細胞在骨缺損修復中的應用潛能，實驗提示不經(jīng)體外成骨誘導的脂肪干細胞復合支架可以在體內成骨，原因可能是支架本身的骨誘導性或刺激體內產(chǎn)生誘導因子。當前對于較長期的動物實驗也有研究，Cui等將脂肪干細胞接種于珊瑚網(wǎng)狀支架植入缺損區(qū),進行了長達6個月的跟進觀察，成功的修復了狗顱骨缺損模型，動物實驗不再僅局限于小動物和短期試驗。有學者將脂肪干細胞/磷酸三鈣植入有免疫缺陷的小鼠背部，電子掃描電鏡檢測，相對于對照組(單純脂肪干細胞)細胞增殖能力加強，堿性磷酸酶活性更高層次，骨鈣素表示出更高層次，脂肪干細胞/磷酸三鈣參加重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2效果更顯著，這充分講明種子細胞、生物支架和細胞因子3個因素交互作用可為臨床修復骨缺損提供一個更優(yōu)化的微環(huán)境。Qing等將轉染骨形態(tài)發(fā)生蛋白2和骨形態(tài)發(fā)生蛋白7基因的脂肪干細胞接種在磷酸三鈣支架后，植入SD大鼠缺損處，實驗證實轉染雙基因組新骨構成更快，這為治療骨缺損提供了一種新方式方法。Hao等利用腺病毒轉染人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2的脂肪干細胞復合納米羥基磷灰石/重組人類膠原蛋白/聚乳酸支架體外培養(yǎng)7d，植入兔橈骨缺損處，12周影像學和組織學分析，實驗組骨重建，支架完全降解，提供一種新方式方法、新型復合材料在體內誘導可在相對較短的時間修復嚴重骨缺損。Fang等將脂肪干細胞接種于載杜仲醇提取物支架材料和羥基磷灰石材料，植入兔下頜骨缺損處，經(jīng)培養(yǎng)、檢測，均有成骨且載杜仲醇提取物的支架明顯優(yōu)于羥基磷灰石，證實杜仲醇提取物有成骨誘導作用及其復合材料應用于修頜骨缺損可行性。因而，脂肪干細胞復合生物支架修復骨缺損可做為骨組織工程重要基礎工具，具有良好的發(fā)展空間。3、問題和瞻望Problemsandprospects骨組織工程具有良好的發(fā)展前景，但利用脂肪干細胞與生物支架構建工程骨修復缺損牙槽骨還存在一定的問題，牙槽骨在口內承受復雜、較大的應力，生物力值不明確，人和動物體內微環(huán)境能否一致等。當前的研究大多數(shù)是體外實驗及小動物實驗，要將骨組織工程應用于臨床牙槽骨再生，仍需大量的實驗和臨床前研究。牙槽骨具有高度可塑性、吸收和新生的動態(tài)平衡動態(tài)等特性，這也是修復牙槽骨需要進一步研究的方向。另外，脂肪干細胞的管理、質量控制、污染，最合適脂肪干細胞支架材料的選擇等問題也有待于解決。隨著骨組織工程的發(fā)展，會聚細胞生物學、醫(yī)學、材料學、工程學等多學科的最新研究成果，綜合運用于牙槽骨缺損的修復，相信在不遠的將來這些問題都能夠解決，由基礎實驗向臨床應用轉變，最終實現(xiàn)真正意義上的牙槽骨再生，為口腔疾病的后續(xù)治療提供最有利的條件，口腔醫(yī)學的發(fā)展必定會發(fā)生宏大的變化。4以下為參考文獻：[1]CraneGM,IshaugSL,MikosAG.Bonetissueengineering.NatureMedicine.1995;1:1322-1334.[2]ZukPA,ZhuM,MizunoH,etal.Multilineagecellsfromhumanadiposetissue:implicationsforcell-basedtherapies.TissueEng.2001;7(2):211-228.[3]Chen