益生菌基因工程改造和粘膜作為粘膜免疫的遞送系統(tǒng)

益生菌的工程化改造和作為粘膜免疫的抗原遞送系統(tǒng)簡介人獸共患寄生蟲病的防治技術研究華支睪吸蟲、包蟲、血吸蟲、囊蟲疫苗動物宿主在寄生蟲病的傳播中起了非常重要的作用，以期通過對動物宿主的免疫阻斷疾病傳播目前，成功的寄生蟲疫苗極少，希望另辟蹊徑主要內容益生菌的功能益生菌在疫苗研究中的應用枯草芽孢作為消化道粘膜疫苗遞送系統(tǒng)及其工程化改造應用前景存在的問題益生菌功能腸道微生態(tài)調節(jié)功能（通過消耗氧、產生乳酸等有機酸、種群密度感應、細菌素等調節(jié)腸道正常菌群和致病菌群的生理平衡）消化道營養(yǎng)功能（包括合成人體必需的氨基酸、維生素、促進食物消化和吸收的各種酶類)免疫調節(jié)功能(通過益生菌的組分促進宿主免疫的形成和調節(jié)機體免疫應答，增強宿主的免疫抵抗力）益生菌在疫苗研究中的應用益生菌應用于疫苗研究，是基于其獨特的生理特性和免疫調節(jié)功能乳酸菌能通過胃酸環(huán)境并在腸道厭氧環(huán)境下定植在腸粘膜表面芽孢桿菌的芽孢能能夠抵抗胃酸和小腸消化酶的作用，能促進腸粘膜吞噬細胞的功能和宿主的免疫應答皮膚、消化道、呼吸道、泌尿生殖道是病原體入侵的主要門戶，粘膜免疫對抵抗各種病原的入侵發(fā)揮了極為重要的作用目前的疫苗（減毒活疫苗、滅活疫苗、重組蛋白疫苗、DNA疫苗、重組病毒疫苗等）主要采用注射免疫方式，不能有效刺激粘膜免疫。極少有口服疫苗，主要是疫苗在經過消化道時易被酸性環(huán)境和各種酶破壞，不能產生有效的保護性免疫新型口服疫苗以乳酸桿菌作為表達系統(tǒng)，將外源抗原進行分泌表達，刺激腸道粘膜免疫以枯草芽孢桿菌作為表達系統(tǒng)，將外源抗原進行分泌型表達或表達在芽孢表面，以分泌的可溶性抗原或重組芽孢顆粒抗原形式刺激粘膜免疫將疫苗的特異性保護與益生菌功能融為一體枯草桿菌作為口服疫苗載體的優(yōu)勢生物安全性高枯草桿菌在營養(yǎng)缺乏的情況下，能產生內生芽孢-抗性好枯草芽孢有獨特的免疫學特性：口服枯草芽孢腸道相關淋巴組織（GALT）識別活化GALT分泌型（SIgA）誘導T、B淋巴細胞和巨噬細胞產生細胞因子通過淋巴細胞再循環(huán)而活化全身免疫系統(tǒng)枯草桿菌作為口服疫苗載體的優(yōu)勢枯草桿菌易于進行遺傳工程操作枯草桿菌芽孢生產成本低：枯草桿菌生長快速，對營養(yǎng)要求低，適于現(xiàn)代工業(yè)發(fā)酵生產重組芽孢疫苗，穩(wěn)定性高，方便儲存、運輸，并可以作為食品添加劑使用。通過胃腸道后，大部分枯草桿菌芽孢仍能存活。正進行的下一步工作cercariaemetacercariaemeracidia克隆策策略pUS186質?？莶輻U桿菌基基因組組提取取PCR擴增枯枯草芽芽孢外外殼蛋蛋白CotC啟動子子及結結構基基因pGEX-Ag質粒pUS186-CotC質粒pUS186-CotC-Ag質粒轉化枯枯草桿桿菌WB600誘導芽芽孢形形成重組芽芽孢CotC-TP重組芽芽孢的的超微微結構構示意意圖芽孢耐耐性評評估細菌：：B.subtilisWB600繁殖體體,E.coliJM109，B.subtilisWB600芽孢主要試試劑模擬胃胃液：：取10mlLB,用鹽酸酸調PH值至2.0,加加入胃胃蛋白白酶10mg。。模擬腸腸液：：取10mlLB，，加膽酸酸鈉（（sodiumcholate））20mg，胰液素素（pancreatin））10mg,調PH值至7.4。1枯草草桿菌菌芽孢孢抗性性評估估0min15min30min1h0min15min30min1h0min15min30min1h0.000﹪0.0024﹪﹪93.3﹪﹪圖3-1在模擬擬胃環(huán)環(huán)境中中枯草草桿菌菌芽孢孢的存存活率率圖3-2在模擬擬胃環(huán)環(huán)境中中枯草草桿菌菌繁殖殖體的的存活活率圖3-3在模擬擬胃環(huán)環(huán)境中中大腸腸桿菌菌的存存活率率1枯草草桿菌菌芽孢孢抗性性評估估0h1h2h3h0h1h2h3h0h1h2h3h258.0﹪圖3-6在模擬擬腸環(huán)環(huán)境中中大腸腸桿菌菌的存存活率率圖3-5在模擬擬腸環(huán)環(huán)境中中枯草草桿菌菌繁殖殖體的的存活活率0.0013﹪﹪圖3-4在模擬腸環(huán)環(huán)境中枯草草桿菌芽孢孢的存活率率92.0﹪﹪ABCD圖免免疫熒光光檢測華支支睪吸蟲表表膜蛋白在在芽孢表面面的表達A:TP31.8；B:TP20.8；C:TP22.3；D:pUS186-Cotc.舉例華支支睪吸蟲表表膜蛋白重重組芽孢芽孢疫苗免免疫大鼠腹腔注射免免疫SD大白鼠分5組：na?ve、pUS186-Cotc芽孢，及pUS186-Cotc-TP31.8、pUS186-Cotc-TP20.8、pUS186-Cotc-TP22.3表膜蛋白表表達株芽孢孢組用量：腹腔注射1×1010口服免疫6組：其中中5組與腹腹腔注射分分組相同，，第六組為為三表膜蛋蛋白表達株株混合芽孢孢組（cocktail組）。乙醚輕度麻麻醉大鼠后后，分別用用1×1010芽孢在第0、1、2、16、17、18、、33、34、35天用灌胃針經口免疫疫各組大鼠鼠，cocktail組為同時給給予三表膜膜蛋白表達達芽孢各1×1010。2.1腹腹腔注射免免疫TP31.8表達株芽孢孢腹腔注射射血清TP31.8特異性IgG水平(OD450)TP31.8表達株芽孢孢腹腔注射射血清TP31.8特異性IgG1、IgG2a水平TP20.8表達株芽孢孢腹腔注射射血清TP20.8特異性IgG水平(OD450)TP20.8表達株芽孢孢腹腔注射射血清TP20.8特異性IgG1、IgG2a水平TP22.3表達株芽孢孢腹腔注射射血清TP22.3特異性IgG水平(OD450)TP22.3表達株芽孢孢腹腔注射射血清TP22.3特異性IgG1、IgG2a水平口服TP31.8表達芽孢大大鼠血清特特異性IgG及糞便IgA水平(OD450)naiveCotCCotC-TP31.8Day15day32day50Day15day32day50AB2.2口口服免疫口服TP20.8表達芽孢大大鼠血清特特異性IgG及糞便IgA水平(OD450)Day15day32day50Day15day32day50CotC-TP20.8CotCnaiveAB口服TP22.3表達芽孢大大鼠血清特特異性IgG及糞便IgA水平(OD450)ABDay15day32day50Day15day32day50CotC-TP22.3CotCnaive口服免疫第第50天糞糞便中表膜膜蛋白特異異性IgA水平腸道黏膜免免疫為腸道道寄生蟲排排蟲主要機機制。腸道道免疫同時時也能引起起膽道黏膜膜免疫系統(tǒng)統(tǒng)功能增強強，使膽道道特異性分分泌型IgA升高。膽道分泌型IgA能阻礙病原原生物對膽膽管及腸道道黏膜的吸吸附及其所所分泌的毒毒性物質對對黏膜的損損害，從而而增強對膽膽道及腸道道的保護作作用。3芽孢疫疫苗口服免免疫后的保保護性表達的穩(wěn)定定性質粒不能連連續(xù)擴增和和維持，涂涂板連續(xù)培培養(yǎng)10天后，只有有5%的菌株含有有重組質粒粒。草魚和麥穗穗魚口服芽芽孢疫苗及及其免疫效效果將3種TP重組芽孢桿桿菌的4L培養(yǎng)基離心心獲得的芽芽孢沉淀與與0.5kg玉米粉和100g雞蛋清混勻勻初步制備備魚用口服服飼料選擇20尾麥穗魚分分為實驗組組和對照組組，每組各各10尾。同時選選擇20尾草魚魚苗苗，分為實實驗組和對對照組，每每組各10尾。將各組魚苗苗在實驗室室生態(tài)池內內常規(guī)飼養(yǎng)養(yǎng)，每天作作換水及消消毒處理。。每天早晚晚投喂研究究制備的魚魚用口服飼飼料，每次次投喂1g/10尾連續(xù)投喂4周后，將篩篩選陽性的的紋沼螺放放入小方皿皿中釋放尾尾蚴，收集集200條尾蚴放入入小碗中，，放入魚進進行攻擊感感染。每組感染攻攻擊感染后后4周后分組檢檢測比較魚魚用口服飼飼料預防麥麥穗魚和草草魚感染華華支睪吸蟲蟲尾蚴的效效果單純芽孢喂喂食組囊蚴蚴的回收率率，囊蚴回回收率草魚魚為80%，麥穗魚為為145%。3種重組芽孢孢混合喂食食組，均未未發(fā)現(xiàn)囊蚴蚴?重組枯草芽芽孢疫苗的的應用前景景適合做禽畜畜、水產的的益生菌微微生態(tài)制劑劑適合各種病病原（尤其其是經消化化道和呼吸吸道感染））的感染性性疾病的疫疫苗載體實現(xiàn)益生菌菌和疫苗功功能的復合合型動物飼飼料添加劑劑和食品添添加劑。風險評價在連續(xù)喂食食重組B.substilis芽孢菌30天的大鼠腸腸腔分離的的其他菌株株中未發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有重組質質粒的水平平轉移質粒攜帶的的卡那抗性性基因水平平轉移的可可能性很小小重組質粒在在活菌內難難以持續(xù)擴擴增和傳代代，會逐步步消失，對對環(huán)境影響響小。存在的問題題和解決策策略重組枯草芽芽孢不能在在腸道定植植，芽孢一一次性排出出率在99.5%以上，要實實現(xiàn)足夠的的免疫，服服用劑量要要大，次數(shù)數(shù)多要解決枯草草芽孢桿菌菌繁殖體在在腸粘膜的的定植能力力