組織工程支架制備有哪些方法

（一）纖維支架纖維支架是組織工程研究中最早采用的細胞外基質(zhì)替代物之一，主要由PGA或其共聚物等結(jié)晶性聚合物纖維構(gòu)成。利用紡織技術(shù)將直徑10－15μm的纖維制成織物或無紡物，其孔隙率高達97%，比表面積高達0.05μm-1，但存在力學強度較差、承壓時會坍塌的缺點。三、支架制備技術(shù)1a改進：（1）霧化或噴霧涂曾采用PLLA或PLGA溶液涂覆織物的方法，可使相鄰纖維間形成物理連結(jié)，從而使纖維支架穩(wěn)定、耐壓。（2）熱處理溶出PGA纖維浸在PLLA/CH2Cl2

溶液中溶劑揮發(fā)后PGA嵌入到PLLA中加熱到兩種聚合物熔點以上，PLLA熔點低，先熔化，充滿PGA纖維網(wǎng)絡所有空洞（PLLA防止纖維網(wǎng)塌陷作用）。交叉點的PGA纖維熔融后物理纏結(jié)在一起。用氯仿溶出PLLA通過織物提高機械性能；類似孔結(jié)構(gòu)2a纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)加工示意圖A:PGAB:PLLA3a(二)多孔支架松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)4a1.粒子致孔法最常用的是溶液澆注/粒子浸濾聚合物溶液與均一的鹽晶混合溶劑揮發(fā)后形成固體的聚合物/鹽復合物浸沒在水中去除鹽可控孔隙率達93%（厚度<2mm）當鹽晶含量為70－90％時，有均勻的聯(lián)孔結(jié)構(gòu)5a致孔劑粒子可采用氯化鈉、酒石酸鈉和檸檬酸鈉等水溶性無機鹽或糖粒子，也可用石蠟粒子或冰粒子。溶液澆鑄/粒子浸濾法制備多孔支架時易形成致密的皮層，若澆鑄后不斷地振動至大部分溶劑揮發(fā)，可防止粒子沉降，抑制表面皮層的形成。（非溶劑聚沉）

粒子致孔法簡單、適用性廣，孔隙率和孔尺寸易獨立調(diào)節(jié)，是一個通用的方法，得到了廣泛的應用，但致孔時往往需用到有機溶劑。6a形成氣體的鹽致孔水溶性致孔劑致孔冰晶致孔GuopingChen,etal.Developmentofbiodegradableporousscaffoldsfortissueengineering.MaterialsScienceandEngineering,2001;C17:63–9Morphologyofcross-sectionsofPLLAsponges7a2.熱致相分離（TIPS）

相分離法是指將聚合物溶液、乳液或水凝膠在低溫下冷凍，冷凍過程中發(fā)生相分離，形成富溶劑相和富聚合物相，然后經(jīng)冷凍干燥除去溶劑而形成多孔結(jié)構(gòu)的方法。因而，相分離法又往往稱為冷凍干燥法。按體系形態(tài)的不同可簡單地分為乳液冷凍干燥法、溶液冷凍干燥法和水凝膠冷凍干燥法。8a均向聚合物溶液：高溫低溫淬火熱力學狀態(tài)參數(shù)：溶液濃度、冷凍溫度、冷凍時間和冷凍速率等液－液相分離相圖9aPorousPDLLA/BioglassscompositescaffoldspreparedbyTIPS：bimodalandanisotropicporestructurescomposedoftubularmacroporesof100m,interconnectedwithmicroporesof10–50mindiameter(冷卻到L-S相平衡線以下干燥)溶液冷凍干燥10aWhangK,etal.Anovelmethodtofabricatebioabsorbablescaffolds.Polymer1995,36:837-42真空干燥液氮去離子水乳液聚合物去離子水冷凍干燥乳液冷凍干燥11aMing-HuaHo,etal.Preparationofporousscaffoldsbyusingfreeze-extractionandfreeze-gelationmethods.Biomaterials2004;25:129–38溶液冷凍凝膠溫度低于溶液凝結(jié)點Morphologyofthechitosanandalginatescaffolds水凝膠冷凍干燥（明膠、藻酸鹽和殼聚糖等水凝膠）12a不同溫度下，多步相分離粗化，提高孔尺寸、連通性相分離/冷凍干燥法孔尺寸往往偏小，但該法避免了高溫，因而得到了研究者的重視。改進：13a3.氣體發(fā)泡法（1）超臨界流體技術(shù)（物理發(fā)泡法）該法將聚合物壓成片,浸泡在高壓二氧化碳中直至飽和,甚至超臨界狀態(tài),然后降至常壓,氣體的熱力學不穩(wěn)定性導致氣泡成核和增長,形成多孔支架。超臨界二氧化碳（SCCO2）無殘留溶劑制備非晶相聚合物支架14a優(yōu)點：不使用有機溶劑，因為殘留在支架中的有機溶劑對細胞有害;反應體系可以在比較低的溫度下進行（30－40C）,便于藥物和生長因子的粘附。缺點：支架的孔隙率和孔徑不可控，由氣體在固體中溶解/釋放過程的形態(tài)決定；連通率低（10－30％）；閉孔結(jié)構(gòu)，可聯(lián)合粒子浸濾法改進。15a（2）化學發(fā)泡法化學發(fā)泡法來制備多孔支架,采用的化學發(fā)泡劑主要為碳酸鹽類化合物。將聚合物溶液/碳酸氫銨粒子混合物加入到模具中,待溶劑部分揮發(fā)后直接浸入熱水中發(fā)泡,最后經(jīng)冷凍干燥可得到多孔支架。該法得到的多孔支架孔隙率超過90%,孔相連性好,孔尺寸約100－500μm,并避免了表面皮層的形成。16a4.微球聚集法將可降解聚合物微球加入模具中,加熱至玻璃化溫度以上,保持一定時間后冷卻、脫模可制得燒結(jié)微球支架。熱處理時微球相互接觸處由于鏈運動而連結(jié)在一起,冷卻至室溫后該結(jié)構(gòu)被固定下來,因而得到多孔的燒結(jié)微球支架。17aFabricationprocessofacompositeofPLAGAandBG.Thecompositewaspreparedina3-D,porousscaffoldbymicrospheresintering.PVALUetal.JBiomedMaterRes64A:465–474,200318a

微球緊密堆積產(chǎn)生的孔隙成為支架的孔,孔尺寸范圍為37－150μm,與微球尺寸成正比,孔隙率則隨微球尺寸增大略有增加,為31－39%,孔相連性很好。該法優(yōu)點在于孔相連性好,孔尺寸易調(diào)控,力學強度大,微球可包裹藥物、生長因子，進行可控釋放。缺點則在于孔尺寸偏小,孔隙率亦低。19a5、靜電紡絲優(yōu)點：操作簡單，制品比表面積大缺點：耗時長、效率低、可控性差，纖維難以排布規(guī)則20a6.3D印刷澆鑄聚合物粉基礎(chǔ)（如：PLGA）按希望的分布點“印”微米體積的溶劑液滴（氯仿）當溶劑揮發(fā)時凝結(jié)的粉固化重復以上操作，建立3D結(jié)構(gòu)搖出未凝結(jié)的粉精確性結(jié)構(gòu)型微孔聚合物或陶瓷支架21a22aTypicalmorphologiesofporouspolymerfoamsproducedbysolidfreeformfabricationtechnique23a

快速成型法可一步形成支架的外形和相連的多孔結(jié)構(gòu),是一種一體化制備方法。優(yōu)點:成型時間短,利于自動化大規(guī)模生產(chǎn);可根據(jù)個體的不同,迅速制備出具有個體特征的三維多孔支架;可制備各個部位具有不同孔結(jié)構(gòu)的支架以適應復合組織的不同要求。缺點：支架孔隙率偏低,通常小于80%.改進？？24a7.相連管狀孔道支架將糖纖維等水溶性纖維材料預先構(gòu)建成具有特定結(jié)構(gòu)的三維“負”支架,“負”支架經(jīng)水蒸汽處理后形成連結(jié).將聚合物溶液滴在“負”支架上,冷凍使聚合物溶液凝膠化,用水浸出糖纖維冷凍干燥脫除溶劑,得到的多孔支架具有預先設計的相連管狀孔道結(jié)構(gòu),孔隙率高達90%以上,并具有納米纖維孔壁結(jié)構(gòu)。25a“負”支架的構(gòu)建既可手工完成,也可用快速成型技術(shù)來實現(xiàn)自動化。與通常的快速成型技術(shù)不同的是,首先形成的是最終的多孔支架的“負”復制品。該支架的相連管狀孔道結(jié)構(gòu)更有利于支架內(nèi)的傳質(zhì)過程,其納米纖維孔壁結(jié)構(gòu)則更有利于細胞粘附。26a支架設計及制備技術(shù)制備技術(shù)加工材料要求孔徑/m孔隙率/%結(jié)構(gòu)溶劑流涎鹽瀝濾流涎溶解30~300~90球狀孔徑、鹽粒會殘留擠出瀝濾模具熱塑性50~500<80球狀孔徑、鹽粒會殘留纖維粘合編織織物20~100<85孔隙結(jié)構(gòu)不規(guī)整乳液冷凍干燥流涎溶解20~200>90熱誘導相分離流涎溶解<100<97孔隙高度貫穿，微孔結(jié)構(gòu)超臨界流體技術(shù)流涎非晶相<5010~30非貫穿孔，微孔結(jié)構(gòu)三維打印固體自由成型溶解45~150<60100%貫穿孔（三角、五角、蜂窩狀）表：三維支架制備技術(shù)27a（三）注射型組織再生支架（軟支架）

可注射型支架是將一種具有流動性的生物相容性良好的材料與異體或自體細胞復合后注射到機體缺損部位,或直接注人體內(nèi),

材料到達缺損部位后能在原位形成具有一定機械強度、形狀并且可與體液進行交換的支架。支架通過注射完成植入,故可降低手術(shù)難度,減少手術(shù)創(chuàng)傷,特別適用于微創(chuàng)傷的修復。高長有,馬列.醫(yī)用高分子材料.P229-234.洪奕等.注射型組織再生支架的研究進展.生物醫(yī)學工程學雜志,2007;24(2):463-465.28a可注射型支架在組織工程中應用的示意圖水凝膠具有在一定條件下可保持流動狀態(tài)而在外部的物理或化學刺激下可形成一定形狀和強度的體型材料的特性,因此成為可注射型支架的首選材料。29a水凝膠作為可注射型支架優(yōu)點：具有良好生物相容性；水溶液環(huán)境有利于保護細胞以及營養(yǎng)物和分泌產(chǎn)物的運輸；易用細胞粘附配體進行改性。水凝膠作為可注射型支架缺點：水凝膠的操作不易控制,機械強度較低，消毒困難。30a1.溫敏型水凝膠類可注射支架:

溫敏型水凝膠是指當一定濃度的溶液在溫度升高或降低到一定值時可迅速形成凝膠,可分為升溫型水凝膠和降溫型水凝膠。由于溫敏型水凝膠只需通過改變溫度就可凝膠化,大大降低了外界物質(zhì)對細胞的影響,因此用于可注射型支架具有一定的優(yōu)越性。例如：降溫型：瓊脂；升溫型：PEO、膠原、PNIPAm接枝明膠31a2.交聯(lián)型水凝膠類可注射支架指在添加助劑或者引發(fā)劑后,分子鏈間發(fā)生交聯(lián)形成水凝膠。交聯(lián)方式有共價鍵交聯(lián),離子鍵交聯(lián)等。交聯(lián)也可通過光引發(fā)來進行。

如：聚反丁烯二酸丙二醇酯（PPF）通過主鏈上的雙鍵和含雙鍵的單體或低聚物進行交聯(lián)原位形成凝膠。為減小溫度、添加交聯(lián)劑及引發(fā)劑,對細胞的活性的影響,可采取微囊化復合改進。如，Payne等將骨髓間質(zhì)成骨干細胞微囊化后種植在水凝膠以保持細胞活性。32a3.復合水凝膠型可注射型支架以水凝膠為載體的可注射型支架主要用于骨修復,一般是采用微粒與水凝膠材料以適當比例共混,保持流動性,然后將混合物注射到缺損部位后凝膠化。目前報道最多的是以羥丙基甲基纖維素水凝膠與具生物活性的磷酸鈣(BCP)復合以制備可注射型骨替代物一。纖維素類水凝膠是一類升溫型水凝膠,可以通過纖維素濃度來控制凝膠化的溫度范圍。33a組織修復中的可注射型材料分類可注射型材料固化方式無機材料磷酸鈣陶瓷固化天然高分子材料殼聚糖海藻酸鈉膠原明膠瓊脂透明質(zhì)酸葡聚糖甲基纖維素類纖維蛋白溫敏型，引發(fā)劑引發(fā)離子交聯(lián)，光引發(fā)溫敏型溫敏型溫敏型光引發(fā)光引發(fā)溫敏型溫敏型，酶交聯(lián)合成高分子材料PEOPPFPNIPAM類PEG類PEO-PPO-PEOPLA-PEG-biotinPVA光引發(fā)光引發(fā)，引發(fā)劑引發(fā)溫敏型溫敏型，光引發(fā)，酶交聯(lián)，M加成溫敏型自組裝光引發(fā)PPF：聚反丁烯二酸丙二醇酯34a可注射型支架研究中存在的問題:如何提高水凝膠的強度凝膠化的可控性對于預制備降溫型、交聯(lián)型等水凝膠時與細胞的復合問題等。35aMicrospheresBiodegradablePLGAmicrosphereshavebeenstudiedfordeliveryofchondrocytesforcartilageengineering.Non-porousPLGAmicrospherescouldbeusedas(i)amicrocarrierforcellexpansioninvitro[130],priortouseasan(ii)injectablecarrierforcartilageregenerationinvivo[131–133].Werecentlyreportedthathighlyporousmicrospheres(～200μminoveralldiameterand～30μminporediameter)couldbepreparedbyagasfoamingmethod[29].Theseporousscaffoldmicrospherescouldbeusedformicrocarriersuspensioncultureofcells,aswellasinjectionofthecell/microsphereconstructsintoatissuedefectsite(Fig.5).Theseinjectableandporousmicrosphereswouldprovideagreatadvantageforcelltherapyinmanyaspects.Priortoinjection,theporousstructure(～30μm)wouldallowsufficientcellseedinginandoutofthematrix.Afterinjectioninvivo,theporousmatrixwouldpermitinfiltrationofcellsandin-growthoftissuefromthehost,facilitatingtheregenerationprocess.H.J.Chung,T.G.Park/AdvancedDrugDeliveryReviews59(2007)249–26236aFig.5.Useofinjectableporousscaffoldmicrospheresforcartilagetissueengineeringasanexample.Primarychondrocytesareseededwithinporousscaffoldmicrospheres,expandedinvitro,andtheninjectedoralternativelyimplantedasaculturedtissueintoacartilagedefectsite.軟骨細胞37a（四）天然組織工程支架天然支架是利用天然材料本身存在的疏松或多孔狀結(jié)構(gòu)，通過一定的制備方法得到的多孔支架材料。例如，利用直接或完全替代的原理，用其它個體的骨組織的無機部分作為支架材料。異種骨異體骨（脫鈣骨、凍干骨）海珊瑚38a五、組織工程支架的發(fā)展不同材料間的復合生長因子的引入物理結(jié)構(gòu)上的仿生化（多層次）39a理想組織工程支架模式圖納米纖維狀膠原基質(zhì)孔洞微球內(nèi)部開孔體系磷灰石40a生物材料表面改性方法等離子改性

接枝改性

生物活性分子的固定

聚合物表面基團的改變

自組裝單分子層層層自組裝

41a生物大分子的表面固定化

將具有生物活性的大分子通過物理吸附、包埋或化學鍵合的方法固定在材料的表面生物活性大分子：ECM黏附蛋白（纖連蛋白、層連蛋白）ECM多糖及其類似物（透明質(zhì)酸、殼聚糖）細胞黏附多肽（RGD）細胞活性因子42a注：RGD系含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸的促進細胞粘附的寡肽

43a8.4組織工程中的微膠囊技術(shù)一、微膠囊概論

微膠囊是指以高分子膜為外殼、其中包有被保護或被密封的物質(zhì)的微小包囊物。就像魚肝油丸那樣，外面是一個明膠膠囊,里面是液態(tài)的魚肝油。經(jīng)過這樣處理，魚肝油由液體變成了固體。微膠囊的顆粒直徑要比傳統(tǒng)的魚肝油丸小得多，尺寸范圍在零點幾微米至幾千微米之間，一般為5-200μm。44a單核多核多核，不規(guī)則外形雙璧微膠囊簇含微膠囊之微膠囊

微膠囊內(nèi)被包裹的物質(zhì)通常稱為芯（core）、核（nucleus）或填充物（fill）；外壁稱為皮（skin）、殼（shell）或保護膜（protectivefilm）。微膠囊中所包裹的物質(zhì)，可以是液體、固體粉末，也可是氣體。由于應用目的和制造工藝不同，微膠囊的大小、形狀可有很大變化，其包裹形式也有多種。常見的有:45a生物微膠囊的概念

將酶、蛋白質(zhì)和激素等生物活性物質(zhì)或微生物、動植物細胞包封在親水性的選擇性透過膜中,形成的球狀微膠囊,稱之為生物微膠囊。1957年，Chang首次報道生物活性物質(zhì)的微囊化(ChangTMS.Hemoglobincorpuscles.ResearchReportforHonoursPhysiology.MedicalLibrary,McGillUniversity,1957)60年代中期,Chang又指出了生物微膠囊在臨床及其他生物學應用上的可行性.(ChangTMS.Semipermeablemicrocapsules.Science,1964,146:524~525)46a

通過微膠囊膜的選擇透過作用,使囊外大于某一分子量的物質(zhì)不能擴散進入,而生物環(huán)境中的營養(yǎng)成分和囊內(nèi)生物活性物質(zhì)或細胞分泌的小分子產(chǎn)物可以自由出入微膠囊,從而達到免疫隔離目的生物微膠囊示意圖方法：1．把需要的細胞密封在半透膜中2．植入密封裝置或與體內(nèi)連接3．細胞分泌物?治療4．當治療完成時裝置取出或斷開連接47a80年代初,人工胰腺：將微囊化技術(shù)與組織細胞移植相結(jié)合,制備了具有良好生物相容性的海藻酸鈉/聚賴氨酸微膠囊作為免疫隔離工具,包埋豬胰島細胞形成人工細胞,并移植入糖尿病大鼠體內(nèi),結(jié)果表明該人工細胞成功地調(diào)節(jié)了血糖水平,代行了大鼠胰腺功能.LimF,SunAM.Science,1980,210:908~90948a90年代以來,醫(yī)學界開始嘗試以微膠囊作為基因重組細胞的免疫隔離和運載工具，利用重組細胞的代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)機體生理功能,治療相關(guān)疾病.

目前,微膠囊的應用研究還涉及藥物控制釋放、動植物細胞培養(yǎng)、細胞和酶的固定化、以及生化物質(zhì)分離等領(lǐng)域。49a二、生物微膠囊的種類及其制備生物微膠囊在應用上必須滿足如下條件：對生物物質(zhì)沒有毒害作用，生物相容性好（但不支持細胞粘附，也不刺激細胞過渡生長）；良好的傳質(zhì)性質(zhì)（生物活性物質(zhì)、信息物質(zhì)、細胞產(chǎn)物）和截留隔離性質(zhì)（抗體或免疫細胞）；理化性質(zhì)穩(wěn)定，并具有一定的機械強度。50a兩個重要的物理量：微膠囊膜強度膜強度大小決定了微膠囊在生物環(huán)境停留期間能否保持基本完整,從而保證囊內(nèi)細胞或物