新冠肺炎實驗室建立文件系列之2 新型冠狀病毒核酸檢測標準操作程序

新冠肺炎實驗室建立文件系列之2新型冠狀病毒核酸檢測標準操作程序新冠肺炎實驗室建立文件系列之2新型冠狀病毒核酸檢測標準操作程序110次修訂2020年**月**日實施02新型冠狀病毒核酸檢測標準操作程序目的規(guī)范PCR方法檢測新型冠狀病毒核酸的工作程序，保證實驗結(jié)果的正確可靠。范圍適合于檢驗科發(fā)熱門診。職責檢驗人員負責按照本檢測細則對被檢樣本進行檢測；復核人員負責對檢測操作是否規(guī)范以及檢測結(jié)果是否準確進行復核；專業(yè)組負責人負責對專業(yè)組綜合管理和檢測報告的審核。程序、內(nèi)容和要求任何新型冠狀病毒的檢測都必須在具備適當條件的實驗室由經(jīng)過相關技術安全培訓的人員進行操作。本程序中的核酸檢測方法主要針對新型冠狀病毒基因組中開放讀碼框openreadingframe1a）和核殼蛋白nucleocapsidprotei。在實驗室要確認一個病例為陽性，滿足以下條件：同一份標本中新型冠狀病毒2個靶標（ORF1ab、N）特異性PCR檢測結(jié)果均為陽性。PCR抑制等。樣本采集（/咽拭子）咽拭子（使用透景樣本保存液）用2根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子同時擦拭雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁，將拭子頭浸入樣本保存液（也可使用等滲鹽溶液、組織培養(yǎng)液或磷酸鹽緩沖液）的管中，尾部棄去，旋緊管蓋作為樣本使用。鼻拭子（使用透景樣本保存液）將1根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子輕輕插入鼻道內(nèi)鼻腭處取另一根聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子以同樣的方法采集另一側(cè)鼻孔鼻咽拭子樣本（未使用透景的保存液：在有鼻咽拭子的收集管中加入1ml生理鹽水，振蕩混勻后將全部液體倒入1.5ml滅菌離心管中作為樣本使用。標本保存用于病毒分離和核酸檢測的標本應盡快進行檢測24-70℃或以下保存（-70℃冰箱暫存。應設立專庫或?qū)９駟为毐４鏄吮?，標本運送期間應避免反復凍融。樣本滅活為了減少感染樣本對人和環(huán)境的潛在危害，推薦樣本檢測前進行滅活處理：先56℃干/水浴60，靜置10n至室溫（避免氣溶膠，然后進行處理。核酸提取Smart32核酸提取儀提取程序操作前準備96孔提取板內(nèi)。運行實驗程序前，檢查96孔提取板及磁棒套是否正確放置（磁棒套順著卡槽推入到盡頭。操作確保儀器的電源線與合規(guī)格的電源插座連接好后，打開儀器背面右下的主電源開關。儀器上電開機后，進行自檢。如下圖所示：待完成自檢后系統(tǒng)進入主菜單操作界面。如下圖所示：主界面主要包括儀器功能選項及快捷實驗運行方式的圖標及“程序列表e) 點擊和e) 點擊和按鍵查看完整程序運行步驟；f)點擊按鍵后，實驗程序?qū)㈤_始運行。注意：96注意：磁棒套是否推入到位；注意：儀器門是否關好。能打開。實驗結(jié)束后，儀器彈窗實驗結(jié)束。k) 點擊k) 點擊進行紫外燈照射消毒。Smart32核酸提取儀日常維護Smart32器不需要定期的維護，但是，應由經(jīng)過廠商指導的實驗室技術人員進行定期的清潔與自測診斷。Smart3210%的家用漂白劑及去離子洗或執(zhí)行任何本節(jié)所提到的維護前，務必關閉Smart32儀器及相關設備的電源；清潔儀器時請小心，確保無液體流入儀器中。核酸提取或純化試劑標準操作程序原理、磁珠洗滌液2用下，將蛋白質(zhì)，無機鹽離子和許多有機雜質(zhì)去除。然后洗脫液將純凈的核酸洗脫下來。標本要求標本類型：血清、血漿、宮頸脫落細胞、咽拭子、鼻咽分泌物等。標本采集：血清/血漿—用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2毫升，注入無菌的干燥玻璃管，室溫（22～25oC）放置30～60分鐘，血標本可自發(fā)完全凝集析出血清，1500rpm離心51.5ml血漿—用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2毫升，注入含乙二胺四乙酸二鈉）或枸櫞酸鈉抗凝劑的玻璃管，立即輕輕顛倒玻璃管混合5～10次，使抗凝劑與靜1.5ml滅菌離心管。方案。宮頸脫落細胞標本的采集需醫(yī)護人員先用窺陰器或陰道張開器暴露宮頸，用宮頸刷置于宮頸口，瞬時針旋轉(zhuǎn)4-6周以獲取足量的上皮細胞，然后取宮頸刷置于盛有2ML生理鹽水的無菌小試管中。2～8℃12-20150℃12小時送達。標本拒收狀態(tài)：細菌污染，嚴重溶血或脂血標本不能作測定。試劑及儀器設備試劑名稱：核酸提取或純化試劑。ft大學達安基因股份有限公司人份/盒962塊，蛋白酶K1瓶。貯存條件和有效期：室溫保存；有效期12個月。Smart32核酸提取儀。操作試劑準備（在試劑準備區(qū)操作，從試劑盒中取出預分裝96孔深孔板，顛倒混勻數(shù)次96500rpm1小心撕去封膜，防止液體濺出。標本制備及加樣（在標本制備區(qū)操作。HCVHCV臨界陽性質(zhì)控品進96、7列（A-H排）200ul20ul蛋白酶。使用smart32型核酸提取儀進行核酸提?。ú僮饕妔mart32核酸提取儀標準操作程序）程序設置（smart32型核酸提取儀程序編輯）步 孔 等待時混合時吸磁次 混合速容積名稱 溫度狀態(tài) 溫度℃驟 位 間min 間min 數(shù) 度 ul12磁珠013中400關021磁珠結(jié)合液0153快750第一孔7033磁珠洗滌液1022快600第6孔5044磁珠洗滌液2001中600第6孔7056洗脫液053中100第6孔7063丟棄磁珠010中600關0612-20℃。注意事項實驗前請仔細閱讀本試劑說明書。不同型號的核酸提取儀由于硬件的關系可能需設置不同的提取程序試劑廠家。標本制備區(qū)所用過的吸頭請打入盛有消毒劑的容器，并與廢棄物一起滅菌后方可丟棄。10%75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器。物生物醫(yī)學實驗室生物安全通用準則和醫(yī)療廢物管理條例樣本釋放劑標準操作程序預期用途樣本的采集保存、病毒滅活裂解、核酸的釋放。采集拭子樣本，放入含有樣本核酸釋放保DNA或RNAPCR原理的核酸保護劑成分，對DNA或RNA適用范圍：拭子類樣本（/鼻/眼結(jié)膜）使用方法4℃7-20℃或-80℃。56℃滅活30分鐘。15“/至少操作3PCR體系進行擴增。釋放出的核酸可在室溫放置48h，4℃存放1個月，-20℃或-80℃存放6個月。性能指標4℃7-80℃可長期保存。PCR檢測，對PCR反應無明顯抑制作用。注意事項本產(chǎn)品僅用于體外檢測，實驗前請仔細閱讀本說明書。的試管、吸頭需打入盛有消毒劑的容器，并與廢棄物一起滅菌后方可丟棄；樣本操作和實驗室管理應嚴格按照PCR實驗過程嚴格分區(qū)進行（試劑準備區(qū)、樣本制備區(qū)、擴增和產(chǎn)物分析區(qū)，所用消耗品應滅菌后一次性使用，實驗操作的每個階段使用專用的儀器和設備，各區(qū)各階段用品不能交叉使用；DNA/RNA酶的PCR反應管和吸頭。新型冠狀病毒（2019-nCoV）基因擴增檢測RT-PCR2019（2019-nCoV）ORF1ab和N（N基因探針采用FAM標記，ORF1ab探針采用Yellow標記）用于標本中2019新型冠狀病毒RNA的檢測。熒光定量擴增儀。操作新冠肺炎實驗室建立文件系列之2新型冠狀病毒核酸檢測標準操作程序新冠肺炎實驗室建立文件系列之2新型冠狀病毒核酸檢測標準操作程序110次修訂2020年**月**日實施試劑準備（在試劑準備區(qū)操作），從試劑盒中取出NC(ORF1ab/N)PCR反應液A、NC(ORF1ab/N)PCR反應液離心數(shù)秒后使用。取N（N＝+NC(ORF1ab/N)+NC(ORF1ab/N)陽性質(zhì)控品反應管，單人份擴增體系配制如下表：標本制備及加樣（在標本制備區(qū)操作標本處理：使用樣本釋放劑采樣管直接采樣送檢：將采樣后的拭子高出采樣管的部分折斷，拭子頭浸沒在含有400uL管中，擰緊管蓋送檢；將采樣管置于56℃303015分鐘使核酸釋放。使用核酸提取儀：取200ul液體樣本加入磁珠提取試劑樣本孔位，使用smart32型核酸提取儀進行核酸提?。╯mart32核酸提取儀及核酸或純化試劑標準操作程序）單管單人份PCR5ul，6000rpm1分鐘。記錄標本處理情況。擴增（在擴增區(qū)操作）PCR1515分鐘，1個循環(huán)；94℃15秒55℃45秒)，45個循環(huán)。結(jié)果判定（ABI7500全自動分析儀器）反應結(jié)束后自動保存結(jié)果，根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的Start值、End值以及Threshold（3～15End5～20，LogThresholdValue值，使閾值線位于擴增曲線指數(shù)期，陰性質(zhì)控品的擴增曲線平直或低于閾值線，點擊s窗口讀取檢測結(jié)果。記錄檢測結(jié)果，簽發(fā)檢測結(jié)果報告。結(jié)果判斷如果檢測樣品在FAM和VIC通道無擴增曲線或CtCy5通道有擴增曲2019(2019-nCoV)RNA；新冠肺炎實驗室建立文件系列之2新型冠狀病毒核酸檢測標準操作程序新冠肺炎實驗室建立文件系列之2新型冠狀病毒核酸檢測標準操作程序110次修訂2020年**月**日實施如果檢測樣品在FAM和VIC通道Ct值≤40，且有明顯的擴增曲線，可判樣品為2019新型冠狀病毒(2019-nCoV)陽性；如果檢測樣品僅在FAM或VIC單一通道Ct值2019新型冠狀病毒(2019-nCoV)2019(2019-nCoV)RNA。質(zhì)量控制NC(ORF1ab/N)VIC通道有明顯擴增曲線；M和Ct值，Cy5需重新進行。性能指標及線性范圍500copies/ml2019新型冠狀病毒種屬相近或引起癥狀相似的其（如季節(jié)性甲型H1N1H1N1(2009)流感病毒H3N2，，乙型流感，乙型流感，呼吸道合抱病毒A型，呼吸道合抱BIIIIII、、345、755型，腸道病毒ABCD型，人間質(zhì)肺病毒（人偏肺病毒B病毒，麻疹病毒，人巨細胞炎克雷伯桿菌，結(jié)核分枝桿菌，煙曲霉，白色念珠菌，光滑念珠菌，新生隱球菌，冠狀病229SS冠狀病毒以及人基因組無交叉反應。注意事項本產(chǎn)品僅用于體外檢測，實驗前請仔細閱讀說明書；處理均需符合相關法規(guī)要求和《醫(yī)療廢物管理條例產(chǎn)物處理：PCRRNA紫外光殺菌的化學通風櫥或生物安全柜完成操作，避免有害物質(zhì)進入呼吸道；5.使用經(jīng)高壓滅菌的一次性離心管和吸頭或購買無DNARNA酶的離心管和吸頭；PCR7如果在樣本處理中沒有控制好交叉污染，可能出現(xiàn)假陽性；實驗室管理應嚴格按照PCR基因擴增實驗室的管理規(guī)范（本制備區(qū)、擴增檢測區(qū)，所用消耗品應滅菌實驗完畢用10%次氯酸或75%20-30分鐘；-20℃待用(24h內(nèi))；11.須對每次實驗進行質(zhì)量控制。樣本處理及檢測過程操作不規(guī)范等，請嚴格按照說明書操作。因拭子等樣本采集過程應結(jié)合臨