T-SDAA 0050-2021 豬丹毒絲菌的檢測 PCR法

ICS65.020.30B43團體標準T/SDAA0050－2021豬毒絲的檢測 PCR法DetectionofErysipelothrixrhusiopathiaebyPCR2021－11－30發(fā)布 2021－12－31實施山東省畜牧協(xié)會 發(fā)布T/SDAA0050－2021T/SDAA0050－2021前??言本文件按照GB/T1.1—2020的規(guī)定起草。本文件由山東省畜牧協(xié)會提出并歸口。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別專利的責任。本規(guī)范起草單位：青島農(nóng)業(yè)大學、青島農(nóng)業(yè)大學海都學院。本規(guī)范主要起草人：韓先杰、高善頌、陳甫、邱慧玲。本文件為首次發(fā)布。T/SDAA0050－2021T/SDAA0050－2021豬丹毒絲菌的檢測 PCR法范圍本文件規(guī)定了豬丹毒絲菌的PCR檢測方法。本方法適用于豬丹毒絲菌的檢測。規(guī)范性引用文件（包括所有的修改單）適用于本文件。NY/T541獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運輸技術規(guī)范NY/T566-2019豬丹毒診斷技術原理DNA核酸為DNADNADNA條帶的大小來判斷結果。試劑或材料除非另有規(guī)定，所用試劑均為分析純。水：GB/T6682，一級。5%綿羊鮮血平板革蘭氏染液2×TaqMasterMixDNAMarkerDL2000瓊脂糖TAE緩沖液4SGreenPlus無毒核酸染料T/SDAA0050-2021儀器設備生物安全柜：配ULPA超高效空氣過濾器。高速冷凍離心機：轉(zhuǎn)速不低于12000rpm/min。PCR儀：最大升降溫速率為4℃/秒，溫度范圍4℃~99℃。凝膠成像儀：圖像分辨率不低于500萬像素，靈敏性可檢測出低于20pgEB染色的雙鏈DNA。紫外透射儀：透射紫外光源波長為302nm。3～300V1～400mA1～120W。樣品按照NY/T541的規(guī)定采集、貯存樣品。試驗步驟細菌的分離及純培養(yǎng)24h~48h，觀察菌落大小、形態(tài)、溶血狀況等。豬丹毒絲菌形成圓形、灰白色、針頭大小的菌落，且邊緣有狹窄的α溶血環(huán)，菌落形A.1。革蘭氏染色與鏡檢1cm大小的水膜。挑取單個菌落均勻涂抹在水膜內(nèi)，室溫干燥、火焰固定。隨后進行革蘭氏染色。1min~2min，流水緩慢沖洗，干燥；1min~2min，流水緩慢沖洗，干燥；95%10s-30s，流水緩慢沖洗，干燥；1min，流水緩慢沖洗，自然干燥。T/SDAA0050-2021顯微鏡觀察細菌形態(tài)。V字形、堆狀或短鏈排列附錄A.2。PCRDNA模板的制備參照NY/T566中4.2.4.4規(guī)定制備。PCR擴增引物根據(jù)豬丹毒絲菌的特異基因序列（附錄A.3，設計一對引物，商業(yè)合成，引物序列見B.1。PCR反應體系PCR反應體系為25μL體系，見附錄B.2。PCR反應條件2000rpmn離心1inRCR5min，9430s，52.530s，7230s32個循環(huán)，72℃終10min（標準株（無菌水PCR1.0%DNA條帶的大小。瓊脂糖凝膠電泳按NY/T566-2019 4.2.4.6規(guī)定執(zhí)行。結果判定成立條件DL2000DNAMarkerDNA377bp（.3。陽性判定符合7.5.1的條件下，被檢樣品擴增出約377bp的片段，則判定被檢細菌為豬丹毒絲菌附錄.3。T/SDAA0050-2021陰性判定7.5.1377bp的片段，則判定被檢細菌不是豬丹毒絲菌。T/SDAA0050－2021附錄A（資料性）豬丹毒絲菌的菌落形態(tài)（A.1）圖A.1 豬丹毒絲菌的菌落形態(tài)（綿羊鮮血平板

T/SDAA0050-2021豬丹毒絲菌的形態(tài)（A.2）圖A.2 豬丹毒絲菌的形態(tài)（革蘭氏染色）T/SDAA0050－2021L基因序列（圖A.3）AAAGAACTTGGAATGAACATCAAAGAAACTGAAATCGATCAACTTGGAACGGCTTCAAAAGTAGTCATCCGCAAGGACGAAACAACCTTAATTGGTGGAGCTGGAACCAAAGAGGCCATTGAAGAACGTGCAAGTGAAATTCGTTCTCAAATAAACAATGTAAGCAGCGACTTTGATAAGAAAAAACTTGAAGAACGTCTTGCGAAACTTACAAATGGTGTTGCTGTCATTAAAGTTGGAGCAGCAACTGAATCCGAAATGAAAGAGAAAAAACTACGCATTGAAGATGCACTCAACGCAACCAAAGCTGCGGTTGCAGAAGGTGTCGTGCTTGGTGGTGGATATGCCCTTGCTCGTGCCTACATGGATCTAAAAGATAACCTAAGTTCAGAAAATCAAGACGAAAATAGAGGTATTAAAACCGTCTTTGAATCAATCCTAAAACCACTCTGGCAAATAGCTGAAAATGCCGGATTTGATGGAGACGAAATCGTTACAAA圖A.3 設計引物的參考序列

上游引物下游引物T/SDAA0050－2021附錄B（規(guī)范性）PCR（表B.1）表B.1PCR擴增的引物序列引物名稱引物序列（5＇-3＇方向）擴增片段大小上游引物（F）5′-GACAACCTTAATTGGTGGAG-3′377bp下游引物（R）5′-TTTGCCAGAGTGGTTTTAGG-3PCR（表B.2）表B.2 PCR擴增體系（25μL）組分體積（μL）2×TaqMasterMix上游引物12.51.0下游引物1.0DNA模板1.0無菌H2O9.5PCR（B.3）