植物組織培養(yǎng)步驟

12-植物組織培養(yǎng)概念（廣義）又叫離體培養(yǎng)，指從植物體分離出符合需要的組織.器官或細胞，原生質(zhì)體等，通過無菌操作，在人工控制條件下進行培養(yǎng)以獲得再生的完整植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟價值的其他產(chǎn)品的技術(shù)。植物組織培養(yǎng)概念（狹義）指用植物各部分組織，如形成層.薄壁組織.葉肉組織.胚乳等進行培養(yǎng)獲得再生植株，也指在培養(yǎng)過程中從各器官上產(chǎn)生愈傷組織的培養(yǎng)，愈傷組織再經(jīng)過再分化形成再生植物。組織培養(yǎng)的步驟一、培養(yǎng)基配制配制培養(yǎng)基有兩種方法可以選擇，一是購買培養(yǎng)基中所有化學藥品，按照需要自己配制；二是購買商品的混合好的培養(yǎng)基基本成分粉劑，如MS、B5等。自己配制可以節(jié)約費用，但浪費時間、人力、且有時由于藥品的質(zhì)量問題，給實驗帶來麻煩。就目前國內(nèi)的情況看，大部分還是自己配制。為了方便起見，現(xiàn)以MS培養(yǎng)基為例介紹配置培養(yǎng)基的主要過程。1、配制幾種母液（1）配制MS大量元素母液一般將大量元素分別配制成100倍的母液，使用時再分別稀釋100倍。分別稱取NH4NO3165gKH2PO417gKNO3190gCaCl2·2H2O44gMgSO4·7H2O37g各自配成1L的母液。倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。（2）配制MS微量元素母液一般將微量元素配制成100倍母液。依次稱取KI0.083gNa2MoO4·2H2O0.025gH3BO30.62gCuSO4·5H2O0.0025gMnSO4·H2O1.69gCoCl2·6H2O0.0025gZnSO4·7H2O0.86g配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。CuSO4·5H2O和CoCl2·6H2O由于稱取量很小，如果天平精確度沒有達到萬分之一，可先配成調(diào)整液。分別稱取CuSO4·5H2O0.05gCoCl2·6H2O0.05g各自配成100ml的調(diào)整液，然后取5ml就還有0.0025g的量。（3）配制MS有機母液一般配制成100倍MS有機母液。依次稱取肌醇10g鹽酸硫胺素（VB1）0.01g煙酸0.05g甘氨酸0.2g鹽酸吡哆醇（VB6）0.05g配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。（4）配制MS鐵鹽母液一般配制成100倍MS鐵鹽母液。依次稱取EDTA二鈉3.73gFeSO4·7H2O2.78g配成1L母液，倒入1L試劑瓶中，存放于冰箱中。所以MS母液有5種大量元素母液，加上MS微量元素母液、MS有機母液和MS鐵鹽母液，共8種母液。激素母液的配制各種生長素和細胞分裂素要單獨配制，不能混合在一起，生長素類一般要先用少量95%的酒精或1當量的NaOH溶解，細胞分裂素一般要先用1當量的鹽酸溶解，然后再加蒸餾水定容。一般取100mg配成100ml母液。2、配制培養(yǎng)基以配置1LMS培養(yǎng)基為例，按順序進行如下操作：（1）先在燒杯中放入一些蒸餾水。（2）分別取上面八種母液10ml倒入。（3）一般稱取30g蔗糖倒入，攪拌溶解。（4）加蒸餾水用量筒定溶至1L。（5）按設(shè)計好的方案添加各種激素，由于激素的用量很小，而且激素對組培植物的生長至關(guān)重要。所以有條件的話最好用微量可調(diào)移液器吸取，減少誤差。（6）用精密試紙或酸度計調(diào)整PH至5.7-5.8。（有條件的話使用酸度計，比較精確）可配1當量的HCL和1當量的NaOH用來調(diào)溶液PH值。1當量HCL配制：用量筒量取8.3ml配成100ml溶液。1當量NaOH配制：稱取NaOH4g配成100ml溶液。（7）稱取5g左右瓊脂粉（質(zhì)量好的瓊脂粉),倒入上面配好的溶液中，放在電爐上加熱至沸騰，直到瓊脂粉熔化。（8）稍微冷卻后，分裝入培養(yǎng)容器中。無蓋的培養(yǎng)容器要用封口膜或牛皮紙封口，用橡皮筋或繩子扎緊。（9）放入消毒滅菌鍋滅菌，滅菌20分鐘左右。（10）滅菌后從滅菌鍋中取出培養(yǎng)基，平放在實驗臺上令其冷卻凝固。二、滅菌滅菌是組織培養(yǎng)重要的工作之一。初學者要清楚有菌和無菌的范疇。有菌的范疇是：凡是暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物體，至少它的表面都是有菌的。依此觀點，無菌室等未處理的地方、超凈臺的表面、簡單煮沸的培養(yǎng)基、我們使用的刀、剪在未處理之前、我們身體的整個外表及與外界相連的內(nèi)表，如整個消化道、呼吸道，即我們呼出的氣體、培養(yǎng)容器無論洗得多干凈等等都是有菌的。這里所指的菌，包括細菌、真菌、放線菌、藻類及其他微生物。菌的特點是：極小，肉眼看不見。無處不在，無時不有，無孔不入。在自然條件下忍耐力強，生活條件要求簡單，繁殖力極強，條件適宜時便可大量滋生。無菌的范疇是：經(jīng)高溫灼燒或一定時間蒸煮過后的物體，經(jīng)其他物理或化學的滅菌方法處理后的物體（當然這些方法必須已經(jīng)證明是有效的），高層大氣、巖石內(nèi)部、健康的動、植物的不與外部接觸的組織內(nèi)部，強酸強堿，化學元素滅菌劑等表面和內(nèi)部都是無菌的。從以上可以看出：在地球表面無菌世界要比有菌世界小的多。滅菌是指用物理或化學的方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即把所有生命的物質(zhì)全部殺死。與此相關(guān)的一個概念是消毒，它指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用，顯然經(jīng)過消毒，許多細菌芽孢、霉菌厚垣孢子等不會完全殺死，即由于在消毒后的環(huán)境里和物品上還有活著的微生物，所以通過嚴格滅菌的操作空間（接種、超凈臺等）和使用的器皿，以及操作者的衣著和手都不帶任何活著的微生物。在這樣的條件下進行的操作，就叫做無菌操作。植物組織培養(yǎng)對無菌條件的要求是非常嚴格的，甚至超過微生物的培養(yǎng)要求，這是因為培養(yǎng)基含有豐富的營養(yǎng)，稍不小心就引起雜菌污染。要達到徹底滅菌的目的，必須根據(jù)不同的對象采取不同的切實有效的方法滅菌，才能保證培養(yǎng)時不受雜菌的影響，使試管苗能正常生長。常用的滅菌方法可分為物理的和化學的兩類，即：物理方法如干熱（烘燒和灼燒）、濕熱（常壓或高壓蒸煮）、射線處理（紫外線、超聲波、微波）、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施；化學方法是使用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇水、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學藥品處理。這些方法和藥劑要根據(jù)工作中的不同材料不同目的適當選用。1、培養(yǎng)基用濕熱滅菌培養(yǎng)基在制備后的24小時內(nèi)完成滅菌工序。高壓滅菌的原理是：在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸汽不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在0.1MPa的壓力下，鍋內(nèi)溫度達121℃。在此蒸汽溫度下，可以很快殺死各種細菌及其高度耐熱的芽孢。注意完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內(nèi)均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關(guān)閉放氣閥，通電后，待壓力上升到0.05MPa時，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。關(guān)閥再通電后，壓力表上升達到0.1MPa時，開始計時，維持壓力0.1-0.15MPa，20分鐘。按容器大小不同，保壓時間有所不同，見表。該表所列數(shù)字是徹底滅菌很保險的數(shù)字，如果容器體積較大，但是放置的數(shù)量很少，也可以減少時間。三、接種接種時由于有一個敞口的過程，所以是極易引起污染的時期，這一時期主要由空氣中的細菌和工作人員本身引起，接種室要嚴格進行空間消毒。接種室內(nèi)保持定期用1%-3%的高錳酸鉀溶液對設(shè)備、墻壁、地板等進行搽洗。除了使用前用紫外線和甲醛滅菌外，還可在使用期間用70%的酒精或3%的來蘇兒噴霧，使空氣中灰塵顆粒沉降下來。無菌操作可按以下步驟進行：（1）在接種4小時前用甲醛熏蒸接種室，并打開其內(nèi)紫外線燈進行殺菌；（2）在接種前20分鐘，打開超凈工作臺的風機以及臺上的紫外線燈；（3）接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實驗服，并換穿拖鞋等；（4）上工作臺后，用酒精棉球搽拭雙手，特別是指甲處。然后搽拭工作臺面；（5）先用酒精棉球搽拭接種工具，再將鑷子和剪刀從頭至尾過火一遍，然后反復過火尖端處，對培養(yǎng)皿要過火烤干；（6）接種時，接種員雙手不能離開工作臺，不能說話、走動和咳嗽等；（7）接種完畢后要清理干凈工作臺，可用紫外線燈滅菌30分鐘，若連續(xù)接種，每5天要大強度滅菌一次。接種是將已消毒好的根、莖、葉等離體器官，經(jīng)切割或剪裁成小段或小塊，放入培養(yǎng)基的過程?，F(xiàn)將接種前后的程序連貫地介紹。無菌接種步驟：（1）將初步洗滌及切割的材料放入燒杯，帶入超凈臺上，用消毒劑滅菌，再用無菌水沖洗，最后瀝去水分，取出放置在滅過菌的紗布上或濾紙上。（2）材料吸干后，一手拿鑷子、一手拿剪刀或解剖刀，對材料進行適當?shù)那懈?。如葉片切成0.5cm平方的小塊；莖切成含有一個節(jié)的小段。微莖尖要剝成只含1-2片幼葉的莖尖大小等。在接種過程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。（3）用灼燒消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培養(yǎng)基上。具體操作過程（以試管為例）是：先解開包口紙，將試管幾乎水平拿著，使試管口靠近酒精燈火焰，并將管口在火焰上方轉(zhuǎn)動，使管口里外灼燒數(shù)秒鐘。若用棉塞蓋口，可先在管口外面灼燒，去掉棉塞，再燒管口里面。然后用鑷子夾取一塊切好的外植體送入試管內(nèi)，輕輕插入培養(yǎng)基上。若是葉片直接附在培養(yǎng)基上，以放1-3塊為宜。至于材料放置方法除莖尖、莖段要正放（尖端向上）外，其他尚無統(tǒng)一要求。接種完后，將管口在火焰上再灼燒數(shù)秒種。并用棉塞，塞好后，包上包口紙，包口紙里面也要過火。四、培養(yǎng)培養(yǎng)指把培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)室（有光照、溫度條件、無菌）里，使之生長，分裂和分化形成愈傷組織或進一步分化成再生植株的過程。1、培養(yǎng)方法（1）固體培養(yǎng)法即用瓊脂固化培養(yǎng)基來培養(yǎng)植物材料的方法。是現(xiàn)在最常用的方法。雖然該方法設(shè)備簡單，易行，但養(yǎng)分分布不均，生長速度不均衡，并常有褐化中毒現(xiàn)象發(fā)生。（2）液體培養(yǎng)法即用不加固化劑的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)植物材料的方法。由于液體中氧氣含量較少，所以通常需要通過攪動或振動培養(yǎng)液的方法以確保氧氣的供給，采用往復式搖床或旋轉(zhuǎn)式搖床進行培養(yǎng)，其速度一般為50-100r/min，這種定期浸沒的方法，既能使培養(yǎng)基均一，又能保證氧氣的供給。2、培養(yǎng)步驟（1）初代培養(yǎng)初代培養(yǎng)旨在獲得無菌材料和無性繁殖系。即接種某些外植體后，最初的幾代培養(yǎng)。初代培養(yǎng)時，常用誘導或分化培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基中含有較多的細胞分裂素和少量的生長素。初代培養(yǎng)建立的無性繁殖系包括：莖梢、芽叢、胚狀體和原球莖等。根據(jù)初代培養(yǎng)時發(fā)育的方向可分為：1）頂芽和腋芽的發(fā)育采用外源的細胞分裂素，可促進使具有頂芽或沒有腋芽的休眠側(cè)芽啟動生長，從而形成一個微型的多枝多芽的小灌木叢狀的結(jié)構(gòu)。在幾個月內(nèi)可以將這種叢生苗的一個枝條轉(zhuǎn)接繼代，重復芽苗增殖的培養(yǎng)，并且迅速獲得多數(shù)的嫩莖。然后將一部分嫩莖轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上，就能得到可種植到土壤中去的完整小植株。一些木本植物和少數(shù)草本植物也可以通過這種方式來進行再生繁殖，如月季、茶花、菊花、香石竹等等。這種繁殖方式也稱作微型繁殖，它不經(jīng)過發(fā)生愈傷組織而再生，所以是最能使無性系后代保持原品種的一種繁殖方式。適宜這種再生繁殖的植物，在采樣時，只能采用頂芽、側(cè)芽或帶有芽的莖切段，其他如種子萌發(fā)后取枝條也可以。莖尖培養(yǎng)可看作是這方面較為特殊的一種方式。它采用極其幼嫩的頂芽的莖尖分生組織作為外植體進行接種。在實際操作中，采用包括莖尖分生組織在內(nèi)的一些組織來培養(yǎng)，這樣便保證了操作方便以及容易成活。用靠培養(yǎng)定芽得到的培養(yǎng)物一般是莖節(jié)較長，有直立向上的莖梢，擴繁時主要用切割莖段法，如香石竹、矮牽牛、菊花等。但特殊情況下也會生出不定芽，形成芽叢。2）不定芽的發(fā)育在培養(yǎng)中由外植體產(chǎn)生不定芽，通常首先要經(jīng)脫分化過程，形成愈傷組織的細胞。然后，經(jīng)再分化，即由這些分生組織形成器官原基，它在構(gòu)成器官的縱軸上表現(xiàn)出單向的極性（這與胚狀體不同）。多數(shù)情況下它形成芽，后形成根。另一種方式是從器官中直接產(chǎn)生不定芽，有些植物具有從各個器官上長出不定芽的能力如矮牽牛、福祿考、懸鉤子等。當在試管培養(yǎng)的條件下，培養(yǎng)基中提供了營養(yǎng)，特別是提供了連續(xù)不斷植物激素的供應(yīng)，使植物形成不定芽的能力被大大地激發(fā)起來。許多種類的外植體表面幾乎全部為不定芽所覆蓋。在許多常規(guī)方法中不能無性繁殖的種類，在試管條件下卻能較容易地產(chǎn)生不定芽而再生，如柏科，松科，銀杏等一些植物。許多單子葉植物儲藏器官能強烈地發(fā)生不定芽，用百合鱗片的切塊就可大量形成不定鱗莖。在不定芽培養(yǎng)時，也常用誘導或分化培養(yǎng)基。用靠培養(yǎng)不定芽得到的培養(yǎng)物，一般采用芽叢進行繁殖，如非洲菊、草莓等。3）體細胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育體細胞胚狀體類似于合子胚但又有所不同，它也通過球形，心形，魚雷形和子葉形的胚胎發(fā)育時期，最終發(fā)育成小苗。但它是由體細胞發(fā)生的。胚狀體可以從愈傷組織表面產(chǎn)生，也可從外植體表面已分化的細胞中產(chǎn)生，或從懸浮培養(yǎng)的細胞中產(chǎn)生。4）初代培養(yǎng)外植體的褐變外植體褐變是指在接種后，其表面開始褐變，有時甚至會使整個培養(yǎng)基褐變的現(xiàn)象。它的出現(xiàn)是由于植物組織中的多酚氧化酶被激活，而使細胞的代謝發(fā)生變化所致。在褐變過程中，會產(chǎn)生醌類物質(zhì)，它們多呈棕褐色，當擴散到培養(yǎng)基后，就會抑制其他酶的活性，從而影響所接觸外植體的培養(yǎng)。褐變的主要原因如下：a、植物品種研究表明，在不同品種間的褐變現(xiàn)象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差異，因此，有些花卉品種的外植體在接種后較容易褐變，而有些花卉品種的外植體在接種后不容易褐變。因此，在培養(yǎng)過程中應(yīng)該有所選擇，對不同的品種分別進行處理。b、生理狀態(tài)由于外植體的生理狀態(tài)不同，所以在接種后褐變程度也有所不同。一般說來，處于幼齡期的植物材料褐變程度較淺，而從已經(jīng)成年的植株采收的外植體，由于含醌類物質(zhì)較多，因此褐變較為嚴重。一般來說，幼嫩的組織在接種后褐變程度并不明顯，而老熟的組織在接種后褐變程度較為嚴重。c、培養(yǎng)基成分濃度過高的無機鹽會使某些觀賞植物的褐變程度增加，此外，細胞分裂素的水平過高也會刺激某些外植體的多酚氧化酶的活性，從而使褐變現(xiàn)象加深。d、培養(yǎng)條件不當如果光照過強、溫度過高、培養(yǎng)時間過長等，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速被培養(yǎng)的外植體的褐變程度。為了提高組織培養(yǎng)的成苗率，必須對外植體的褐變現(xiàn)象加以控制?？梢圆捎靡韵麓胧┓乐?、減輕褐變現(xiàn)象的發(fā)生。1、選擇合適的外植體一般來說，最好選擇生長處于旺盛的外植體，這樣可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。2、合適的培養(yǎng)條件無機鹽成分、植物生長物質(zhì)水平、適宜溫度、及時繼代培養(yǎng)均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。3、使用抗氧化劑在培養(yǎng)基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕很多外植體的褐變現(xiàn)象。另外，使用0.1%-0.5%的活性炭對防止褐變也有較為明顯的效果。4、連續(xù)轉(zhuǎn)移對容易褐變的材料可間隔2-24小時的培養(yǎng)后，再轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上，這樣經(jīng)過連續(xù)處理7-10天后，褐變現(xiàn)象便會得到控制或大為減輕。(2)繼代培養(yǎng)在初代培養(yǎng)的基礎(chǔ)上所獲得的芽、苗、胚狀體和原球莖等，數(shù)量都還不夠，它們需要進一步增殖，使之越來越多，從而發(fā)揮快速繁殖的優(yōu)勢。繼代培養(yǎng)是繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴繁殖培養(yǎng)過程。旨在繁殖出相當數(shù)量的無根苗，最后能達到邊繁殖邊生根的目的。繼代培養(yǎng)的后代是按幾何級數(shù)增加的過程。如果以2株苗為基礎(chǔ)，那么經(jīng)10代將生成210株苗。繼代培養(yǎng)中擴繁的方法包括：切割莖段、分離芽叢、分離胚狀體、分離原球莖等。切割莖段常用于有伸長的莖梢、莖節(jié)較明顯的培養(yǎng)物。這種方法簡便易行，能保持母種特性。培養(yǎng)基常是MS基本培養(yǎng)基；分離芽叢適于由愈傷組織生出的芽叢。培養(yǎng)基常是分化培養(yǎng)基。若芽叢的芽較小?？上惹谐裳繀残K，放入MS培養(yǎng)基中，待到稍大時，再分離開來繼續(xù)培養(yǎng)。增殖使用的培養(yǎng)基對于一種植物來說每次幾乎完全相同，由于培養(yǎng)物在接近最良好的環(huán)境條件，營養(yǎng)供應(yīng)和激素調(diào)控下，排除了其他生物的競爭，所以能夠按幾何級數(shù)增殖。在快速繁殖中初代培養(yǎng)只是一個必經(jīng)的過程，而繼代培養(yǎng)則是經(jīng)常性不停的進行過程。但在達到相當數(shù)量之后，則應(yīng)考慮使其中一部分轉(zhuǎn)入生根階段。從某種意義上講，增殖只是儲備母株，而生根才是增殖材料的分流，生產(chǎn)出成品。（3）繼代培養(yǎng)時材料的玻璃化實踐表明，當植物材料不斷地進行離體繁殖時，有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會呈半透明水跡狀，這種想象通常稱為玻璃化。它的出現(xiàn)會使試管苗生長緩慢、繁殖系數(shù)有所下降。玻璃化為試管苗的生理失調(diào)癥。因為出現(xiàn)玻璃化的嫩莖不宜誘導生根，因此，使繁殖系數(shù)大為降低。在不同的種類、品種間，試管苗的玻璃化程度也有所差異。當培養(yǎng)基上細胞分裂素水平較高時，也容易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象。在培養(yǎng)基中添加少量聚乙烯醇、脫落酸等物質(zhì)，能夠在一定程度上減輕玻璃化的現(xiàn)象發(fā)生。呈現(xiàn)玻璃化的試管苗，其莖、葉表面無蠟質(zhì)，體內(nèi)的極性化合物水平較高，細胞持水力差，植株蒸騰作用強，無法進行正常移栽。這種情況主要是由于培養(yǎng)容器中空氣濕度過高，透氣性較差造成的，其具體解決的方法為：a、增加培養(yǎng)基中的溶質(zhì)水平，以降低培養(yǎng)基的水勢；b、減少培養(yǎng)基中含氮化合物的用量；c、增加光照d、增加容器通風，最好進行CO2施肥，這對減輕試管苗玻璃化的現(xiàn)象有明顯的作用；e、降低培養(yǎng)溫度，進行變溫培養(yǎng)，有助于減輕試管苗玻璃化現(xiàn)象發(fā)生；f、降低培養(yǎng)基中細胞分裂素含量，可以考慮加入適量脫落酸。3、生根培養(yǎng)當材料增殖到一定數(shù)量后，就要使部分培養(yǎng)物分流到生根培養(yǎng)階段。若不能及時將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上去，就會使久不轉(zhuǎn)移的苗子發(fā)黃老化，或因過分擁擠而使無效苗增多造成拋棄浪費。根培養(yǎng)是使無根苗生根的過程，這個過程目的是使生出的不定根濃密而粗壯。生根培養(yǎng)可采用1/2或者1/4MS培養(yǎng)基，全部去掉細胞分裂素，并加入食糧非的生長素（NAA、IBA等）。誘導生根可以采用下列方法a、將新梢基部浸入50或100*10-6IBA溶液中處理4-8小時；b、在含有生長素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4-6天c、直接移入含有生長素的生根培養(yǎng)基中。上述三種方法均能誘導新梢生根，但前兩種方法對新生根的生長發(fā)育則更為有利。而第三種對幼根的生長有抑制作用。其原因是當根原始體形成后較高濃度生長素的繼續(xù)存在，則不利于幼根的生長發(fā)育。不過這種方法比較可行。另外也可采用下列方法就可生根。1、延長在增殖培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時間；2、有意降低一些增殖倍率，減少細胞分裂素的用量（即將增殖與生根合并為一步）；3、切割粗壯的嫩枝在營養(yǎng)缽中直接生根，此方法則沒有生根階段。可以省去一次培養(yǎng)基制作，切割下的插穗可用生長素溶液浸蘸處理，但這種方法只適于一些容易生根的作物。另外少數(shù)植物生根比較困難時，則需要在培養(yǎng)基中放置濾紙橋，使其略高于液面，靠濾紙的吸水性供應(yīng)水和營養(yǎng)，從而誘發(fā)生根。從胚狀體發(fā)育成的小苗，常常有原先已分化的根，這種根可以不經(jīng)誘導生根階段而生長。但因經(jīng)胚狀體發(fā)育的苗數(shù)特別多，并且個體較小，所以也常需要一個低濃度或沒有植物激素的培養(yǎng)基培養(yǎng)的階段，以便壯苗生根。試管內(nèi)生根壯苗的階段，為了成功地將移植到試管外的環(huán)境中，以使試管苗適應(yīng)外界的環(huán)境條件。通常不同植物的適宜馴化溫度不同。如菊花，以18-20℃為宜。實踐證明植物生長的溫度過高不但會牽涉到蒸騰加強。而且還牽涉到菌類易滋生的問題。溫度過低使幼苗生長遲緩，或不易成活。春季低溫時苗床可加設(shè)電熱線，使基質(zhì)溫度略高于氣溫2-3℃，這不但有利于生根和促進根系發(fā)達，而且有利于提前成活。移植到試管外的植物苗光強度應(yīng)比移植前培養(yǎng)有所提高，并可適應(yīng)強度較高的漫射光，（約4000lx左右），以維持光合作用所需光照強度。但光線過強刺激蒸騰加強，會使水分平衡的矛盾更尖銳。五、馴化移栽試管苗移栽是組織培養(yǎng)過程的重要環(huán)節(jié)，這個工作環(huán)節(jié)做不好，就會造成前功盡棄。為了做好試管苗的移栽，應(yīng)該選擇合適的基質(zhì)，并配合以相應(yīng)的管理措施，才能確保整個組織培養(yǎng)工作的順利完成。試管苗由于是在無菌、有營養(yǎng)供給、適宜光照和溫度近100%的相對濕度環(huán)境條件下生長的，因此，在生理、形態(tài)等方面都與自然條件生長的小苗有著很大的差異。所以必須通過煉苗，例如通過控水、減肥、增光、降溫等措施，使她們逐漸地適應(yīng)外界環(huán)境，從而使生理、形態(tài)、組織上發(fā)生相應(yīng)的變化，使之更適合于自然環(huán)境，只有這樣才能保證試管苗順利移栽成功。從葉片上看，試管苗的角質(zhì)層不發(fā)達，葉片通常沒有表皮毛，或僅有較少表皮毛，甚至葉片上出現(xiàn)了大量的水孔，而且，氣孔的數(shù)量、大小也往往超過普通苗。由此可知，試管苗更適合于高濕的環(huán)境生長，當將它們移栽到試管外環(huán)境時，試管苗失水率會很高，非常容易死亡。因此，為了改善試管苗的上述不良生理、形態(tài)特點，則必須經(jīng)過與外界相適應(yīng)的馴化處理，通常采取的措施有：對外界要增加濕度、減弱光照；對試管內(nèi)要通透氣體、增施二氧化碳肥料、逐步降低空氣濕度等。另外，對栽培馴化基質(zhì)要進行滅菌是因為試管苗在無菌的環(huán)境中生長，對外界細菌、真菌的抵御能力極差。為了提高其成活率，在培養(yǎng)基質(zhì)中可摻入75%的百菌清可濕性粉劑200-500倍液，以進行滅菌處理。1、移栽用基質(zhì)和容器適合于栽種試管苗的基質(zhì)要具備透氣性、保濕性和一定的肥力，容易滅菌處理，并不利于雜菌滋生的特點，一般可選用珍珠巖、蛭石、砂子等。為了增加粘著力和一定的肥力可配合草炭土或腐殖土。配時需按比例搭配，一般用珍珠巖、蛭石、草炭土或腐殖土比例為1：1：0.5。也可用砂子：草炭土或腐殖土為1：1。這些介質(zhì)在使用前應(yīng)高壓滅菌?；蛴弥辽傩r烘烤來消滅其中的微生物。要根據(jù)不同植物的栽培習性來進行配制，這樣才能獲得滿意的栽培效果。以下介紹幾種常見的試管苗栽培基質(zhì)。（1）河砂河砂分為粗砂、細砂兩種類型。粗砂即平常所說的河砂，其顆粒直徑為1-2mm。細砂即通常所說的面砂，其顆粒直徑為0.1-0.2nm。河砂的特點是排水性強，但保水蓄肥能力較差，一般不單獨用來直接栽種試管苗。（2）草炭土草炭土是由沉積在沼澤中的植物殘骸經(jīng)過長時間的腐爛所形成，其保水性好，蓄肥能力強，呈中性或微酸性反應(yīng)，但通常不能單獨用來栽種試管苗，宜與河砂等種類相互混合配成盆土而加以使用。（3）腐殖土腐殖土是由植物落葉經(jīng)腐爛所形成。一種是自然形成，一種是人為造成，人工制造時可將秋季的落葉收集起來，然后埋入坑中，灌水保濕的條件下使其風化，然后過篩即可獲得。腐葉上含有大量的\t"_b