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文檔簡介
基因診斷與基因治療
GeneDiagnosisandGeneTherapy第二十八章第一節(jié)基因診斷學(xué)基礎(chǔ)第二節(jié)遺傳病的基因診斷第三節(jié)傳染病的基因診斷第四節(jié)腫瘤的基因診斷第五節(jié)基因診斷在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用第六節(jié)基因治療的概念及策略
本章內(nèi)容提要第一節(jié)
基因診斷學(xué)基礎(chǔ)
BasisofGeneDiagnostics基因診斷之父—簡悅威1976年加州大學(xué)華裔科學(xué)家KanYW用核酸分子雜交技術(shù)首次對一例α地中海貧血進行診斷。一、基因診斷的概念、特點及臨床意義
定義:利用分子生物學(xué)技術(shù),通過檢測基因及基因表達產(chǎn)物的存在狀態(tài),對人體疾病作出診斷的方法?;蛟\斷檢測的目標分子是DNA、RNA,也可以是蛋白質(zhì)或者多肽。
診斷依據(jù)(遺傳物質(zhì)改變)DNA、RNA或蛋白質(zhì)水平變化,如病毒基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在體內(nèi)從無到有、癌基因表達水平從低到高;基因結(jié)構(gòu)變化,如點突變引起基因失活、染色體轉(zhuǎn)位引起基因異常激活或滅活?;蛟\斷的特點高特異性高靈敏性早期診斷性應(yīng)用廣泛性二、基因診斷中常用的分子生物學(xué)技術(shù)核酸分子雜交(Nucleicacidhybridization)聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)DNA序列測定(DNAsequencing)生物芯片(biochips)Western免疫印跡(Westernblotting)免疫組織化學(xué)診斷(一)核酸分子雜交
Nucleicacidhybridization指兩條單鏈核酸在一定條件(溫度、鹽離子和有機溶劑濃度)下,按堿基互補的原則重新配對形成雙鏈的過程。核酸分子雜交流程
待測核酸制備濾膜上核酸固化雜交去除未雜交的探針檢測雜交信號核酸探針制備探針標記加入標記探針提取DNA→限制性內(nèi)切切酶消化DNA以產(chǎn)生特定定長度的片片段→凝膠膠電泳分離離→變性性處理→DNA轉(zhuǎn)印到膜上上并使其牢牢固結(jié)合→→將標記的探探針與膜上上DNA片段雜交,,分析雜交交信號。1.Southern印跡雜交(Southernblotting)RNA經(jīng)變性瓊瓊脂糖凝凝膠電泳泳后,轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移到固固相支持持物上,,通過分分子雜交交檢測特特定的mRNA分子的含含量與大大小。2.Northern印跡雜交交(Northernblotting)3.斑點雜交交(dotblotting)將RNA或DNA變性后直直接點樣樣于硝酸酸纖維素素膜或尼尼龍膜上上,用于于基因組組中特定定基因及及其表達達產(chǎn)物的的定性及及定量的的研究。。4.反向斑點點雜交((reversedotblotting)先將探針針固定于于硝酸纖纖維素膜膜或尼龍龍膜上,,將樣品品RNA或DNA標記變性性后進行行雜交。。改變了了傳統(tǒng)雜雜交方法法中一次次雜交只只能檢測測一種樣樣品的局局限,大大大提高高了基因因診斷的的效率。寡核苷酸酸中的堿堿基錯配配會大大大影響雜雜交分子子的穩(wěn)定定性,可可用人工工合成的的針對正正常和突突變ASO探針進行行反向斑斑點雜交交,檢測測點突變變,大大提高高檢測結(jié)結(jié)果的可可靠性。。等位基因因特異性性寡核苷苷酸(allelespecificoligonucleotide,ASO)5.原位分子子雜交熒光原位位雜交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)掛鎖FISH(FISHwithpadlock)熒光原位位雜交((FISH)6.固相夾心心雜交法法(sandwichhybridization)待測靶基基因序列列上兩個個相鄰但但不重疊疊的DNA片段(A、B片段),,分別作作為捕捉捉探針((不標記記的A片段)和和檢測探探針(標標記的B片段),,同時與與靶基因因雜交。。先將捕捕捉探針針吸附于于固相支支持物上上,與靶靶基因序序列A部分雜交交,再加加入標記記的檢測測探針,,檢測探探針與靶靶基因序序列B部分雜交交,檢測測雜交信信號。固相夾心心雜交法法示意圖圖(二)聚合酶鏈鏈式反應(yīng)應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)模板引物dNTPMg2+TaqDNA聚合酶變性延伸退火PCR在基因診診斷中的的應(yīng)用RT-PCR熒光定量量PCR多重-PCRPCR-ASOAS-PCRPCR-SSCPPCR-RFLP1.RT-PCR2.熒光定量量PCR熒光標記記引物3.多重PCR多重PCR示意圖A:普通PCR;B:多重PCR4.PCR-ASON:正常基基因;H:雜合子子基因;;M:突變基基因ASO1ASO2NHM(三)單鏈構(gòu)象象多態(tài)性性分析(single-strandconformationpolymorphism,SSCP)DNA的突變造成成DNA片段中堿基基序列不同同,變性為為單鏈后在在中性聚丙丙烯酰胺凝凝膠中的構(gòu)構(gòu)象不同((單鏈構(gòu)象象多態(tài)性)),利用遷遷移率的差差別可使各各種序列不不同的單鏈鏈分離開來來。PCR-SSCP分析原理示示意正常人純合突變雜合突變+PCR-SSCP分析-(四)限制制性片段長長度多態(tài)性性分析(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)由于DNA變異產(chǎn)生新新的酶切位位點或原有有的酶切位位點消失,,在用限制制性核酸內(nèi)內(nèi)切酶消化化時產(chǎn)生不不同長度或或不同數(shù)量量的片段。??山柚怂崴岱肿与s交交或PCR進行檢測。。設(shè)計適當?shù)牡臄U增引物物,使擴增增片段包括括某一個或或數(shù)個限制制性內(nèi)切酶酶識別序列列,在PCR擴增后用該該限制酶切切割PCR產(chǎn)物,根據(jù)據(jù)電泳后酶酶切片段長長度變化,,即可作出出診斷。PCR-RFLPABCDEFG-+DEFBGCAGAATTCCTTAAGEFBG-+C+DAEcoRⅠ限制性內(nèi)切切酶位點的的變化(五)DNA序列測定((DNAsequencing)DNA序列測定原原理(雙脫氧末端端終止法)左側(cè):正常常;右側(cè)突突變序列分析用用于基因診診斷研究(六)生物物芯片(biochips)基因芯片((genechips)蛋白質(zhì)芯片片(proteinchip)基因芯片雜雜交流程示示意圖基因診斷中中常用的分分子生物學(xué)學(xué)方法比較較方法優(yōu)點與問題解決方案核酸分子雜交結(jié)果可靠但操作繁瑣選擇合適的探針PCR靈敏度、特異性高設(shè)計合適的引物SSCP操作簡便、檢出率不高選擇合適的片段RFLP結(jié)果可靠但限制較多選擇合適的限制酶DNA測序可自動化,但不適宜廣泛使用與PCR配合使用生物芯片效率高,成本高,不適宜廣泛使用選擇合適的芯片三、基因因診斷技術(shù)術(shù)路線與方方法直接診斷::直接分析析致病基因因分子結(jié)構(gòu)構(gòu)及表達是是否異常間接診斷::利用多態(tài)態(tài)性遺傳標標志與致病病基因進行行連鎖分析析根據(jù)對致病病基因或相相關(guān)基因的的了解程度度決定基因因診斷的技技術(shù)途徑選選擇。(一)直接接診斷途徑徑必要條件::◆被檢測基因因變化與疾疾病發(fā)生有有直接因果果關(guān)系◆被檢基因正正常分子結(jié)結(jié)構(gòu)已被確確定◆被檢基因致致病的分子子機制(突突變位點或或表達變化化)已知5/——5/—3/3/—RFLP1.點突變的檢檢測(1)有限制性性內(nèi)切酶位位點改變斑點雜交、、反向斑點點雜交AS-PCR、PCR-SSCP、PCR-ASO、PCR產(chǎn)物直接測測序5/——5/—3/3/—(2)無限制性性酶切位點點改變在DNA序列上有一一段較長序序列的重新新排布。包包括數(shù)十個個堿基到數(shù)數(shù)千個堿基基的丟失、、插入、替替換、重復(fù)復(fù)和倒位等等,以及染染色體突變變或畸變,,包括染色色體的易位位、缺失或或染色三體體(如唐氏氏綜合征))等。2.基因重排的的檢測核酸分子探探針雜交與與PCRBamHIBamHIα2α1α210kb14kbprobe-珠蛋白生成成障礙性貧貧血的直接基因因診斷-珠蛋白基因不同程程度的缺失失可引起不同類型的的-珠蛋白生成成障礙性貧貧血根據(jù)引物3′端的互補與與否,設(shè)計計一對與正正?;蛲蛔冏兡0迮鋵Φ奶禺愐锏任换蛱靥禺怭CRAS-PCR(allelespecificPCR)3.基因表達異異常的檢測測mRNA的相對定量量分析mRNA的絕對定量量分析mRNA長度分析(二)間接接診斷途徑徑1.采用原因致病基因未未知或基因因結(jié)構(gòu)不確確定致病突變機機制不清致病位點不不便檢測DNA多態(tài)性:指群體中的的DNA分子存在至至少兩種不不同的類型型,即個體體間同一染染色體的相相同位置上上核苷酸序序列存在一一定的差異異或變異。。多在進化中中形成,本本身并不致致病,只是是與某些遺遺傳性致病病基因有一一定連鎖關(guān)關(guān)系。2.遺傳標記間接診斷::檢測與致致病基因連連鎖的遺傳傳標記三代遺傳標標記:RFLP(基于核酸酸分子雜交交技術(shù))VNTR(variablenumberoftandemrepeats);STR(shorttandemrepeats)SNP(singlenucleotidepolymorphism)7.6kb13kb患者正常HBS的間接基因因診斷——RFLP標記的連鎖鎖分析HapⅠ7.6kb13kbSouthern印跡雜交NHPN:正常;H:雜合子;;P:患者(純純合子);;黃色區(qū)域域為探針第二節(jié)遺遺傳傳病的基因因診斷GeneDiagnosisofHereditaryDiseases一、血紅蛋蛋白?。╤emoglobinopathy)(一)鐮狀狀細胞貧血血病(二)β-珠蛋白生成成障礙性貧貧血癥二、血友病病(Hemophilia)甲型血友病病基因診斷斷三、脆性X綜合征(一)鐮狀狀細胞貧血血病一、血紅蛋蛋白病1.鐮狀紅細胞胞貧血患者者基因診斷斷——ASO雜交法2.HBS的限制性內(nèi)內(nèi)切酶譜分分析3.HBS的PCR-RFLP分析正常的(N)的ASO探針:5′-ACTCCTGAGGAGAAGTCTGC-3′突變的(M)的ASO探針:5′-ACTCCTGTGGAGGAAGTCTGC-3′1.鐮狀紅細胞胞貧血患者者基因診斷斷ASO雜交法斑點雜交結(jié)結(jié)果N:正常;M突變鐮狀紅細胞胞貧血患者者ASO雜交法檢測測N-ASOM-ASO正常突突變突突變純純合子雜雜合子子純純合子5′3′正?;?.15kb(CCTGAGG)×5′3′突變基因1.35kb(CCTGTGG)鐮狀紅細胞貧貧病的限制性性內(nèi)切酶譜分分析MstⅡ酶切位點(CCTNAGG)2.HBS的限制性內(nèi)切切酶譜分析目錄0.2kb1.15kb1.35kb正常人突變攜帶者患者鐮狀紅細胞貧貧血病的限制制性內(nèi)切酶譜譜分析目錄3.HBS的PCR-RFLP分析正常人的擴增增產(chǎn)物經(jīng)MstⅡ消化可生成54bp和56bp兩個片段,而而鐮狀細胞貧貧血癥患者的的DNA片段不被酶切切,仍為110bp,雜合子可見見三條帶正常人雜合體患者Marker1.PCR-RFLP分析-珠蛋白生成障障礙性貧血癥癥基因密碼子子17突變的檢測M:pBR322DNA/MspI;1:未酶解片段;;2:bA/bA;3:bA/bT;4:bT/bT注:由于54bp、114bp、72bp片段及分子量量標準中低于于200bp的片段太小,,在0.8%的瓊脂糖凝凝膠中不易被被觀察到(二)-珠蛋白生成障障礙性貧血癥癥-珠蛋白生成障障礙性貧血癥癥的反向斑點點雜交分析2.反向斑點雜交交二、血友?。ǎ℉emophilia)甲型血友病是是由于血漿凝凝血因子VIII(FVIII)缺陷造成。。甲型血友病的的基因突變類類型已有300余種,其中點點突變占174種;另有部分分患者是由于于缺失或插入入突變或內(nèi)含含子22的基因倒位所所致。1.FVIII基因倒位的DNA印跡分析將基因組DNA用NcoI,DraI或BclI等內(nèi)切酶(酶酶切位點位于于交換點兩側(cè)側(cè))消化,用用特異探針進進行雜交分析析,正常人表表現(xiàn)為21.5kb、14kb和16kb三種類型。I型倒位患者表表現(xiàn)為20、17.5和14kb三種類型;Ⅱ型倒位患者表表現(xiàn)為20、16和15.5kb三種帶型。在在一些重型甲甲型血友病家家系中還有其其他異常帶型型出現(xiàn)。2.FVIII基因突變變的檢測測(1)依賴于于FVIII基因內(nèi)或或旁側(cè)的的多態(tài)性性標記的的連鎖分分析(2)RFLP連鎖分析析(3)VNTR分析(4)短串聯(lián)聯(lián)重復(fù)序序列(STR)的連鎖鎖分析三、脆性性X綜合征脆性X智力低下下基因1(FMR1)5ˊ非翻譯區(qū)區(qū)遺傳不不穩(wěn)定的的(CGG)n三核苷酸酸重復(fù)序序列的異異常擴增增以及相相鄰CpG島的異常常甲基化化。正常人中中約為8~50拷貝。男性和女女性攜帶帶者增多多到52~200拷貝,相相鄰的CpG島未被甲甲基化,,稱為前前突變((premutation)。男性患者者和脆性性部位高高表達的的女性中中,達到到200~1000拷貝,相相鄰的CpG島也被甲甲基化,,稱為全全突變((fullmutation)。全突變可可關(guān)閉相相鄰FMR1基因的表表達,F(xiàn)MR1mRNA在幾乎所所有患者者不表達達或只有有低表達達,從而而出現(xiàn)臨臨床癥狀狀。脆性X綜合征常常用基因因診斷方方法1.PCR-ASO2.DNA連鎖分析析3.Souhern印跡雜交交法4.PCR擴增第三節(jié)傳傳染病病的基因因診斷GeneDiagnosisofInfectiousDiseases目錄一、病毒毒性疾病病甲型肝炎炎病毒((HAV)HAV系RNA病毒,利利用RT-PCR技術(shù)可從從糞便中中檢測出出甲型肝肝炎病毒毒的基因因組RNA。乙型型肝肝炎炎病病毒毒((HBV)設(shè)計計保保守守區(qū)區(qū)序序列列引引物物,,擴擴增增各各型型HBVDNA片段段;;設(shè)設(shè)計計位位于于可可變變區(qū)區(qū)的的引引物物擴擴增增某某一一亞亞型型HBVDNA,以以便便分分型型。。丙型型肝肝炎炎病病毒毒((HCV)HCV為正正鏈鏈RNA病毒毒,,先先反反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄錄成成cDNA,再再進進行行巢巢式式PCR檢測HCV。目錄二、細菌引起起的疾病結(jié)核分枝桿菌菌先設(shè)計一對特特異性引物,,用PCR技術(shù)擴增出一一383bp序列,再用探探針雜交,靈靈敏度可達到到100個細菌水平。。幽門螺桿菌((HP)主要采用PCR技術(shù):①檢測測HP染色體DNA特異片段;②②檢測HP尿素酶A基因;③用PCR-RFLP鑒別HP菌株。三、寄生蟲及及衣原體感染染瘧原蟲卡氏肺孢子蟲蟲衣原體感染診斷方法:核核酸雜交和PCR技術(shù)第四節(jié)腫腫瘤的基基因診斷GeneDiagnosisofMalignantTumors一、原癌基因因與抑癌基因因的檢測二、常見腫瘤瘤的基因診斷斷乳腺癌結(jié)腸癌一、原癌基因因與抑癌基因因的檢測1.原癌基因的的檢測ras基因家族由H-ras、K-ras和N-ras組成。最常見見的突變是第第12、13、59或第61位密碼子的點點突變。胰腺癌、結(jié)腸腸癌、肺癌以以K-ras突變?yōu)橹鳎缛绲?2位密碼子突變變,由編碼甘甘氨酸的GGT突變?yōu)門GT、GTT或GAT,少數(shù)突變?yōu)闉镚CT。急性淋巴細胞胞白血病,慢慢性淋巴細胞胞白血病等以以N-ras突變?yōu)橹?;泌泌尿系統(tǒng)腫瘤瘤則以H-ras突變?yōu)橹?。PCR及PCR-SSCP分析:擴增ras基因第12位密碼子點突突變部位,再再用SSCP技術(shù)進行分析析,或者直接接測序確定患患者ras原癌基因的點點突變。核苷酸雜交技技術(shù)(如ASO):檢測ras基因第12位密碼子點突突變。2.ras原癌基因突變變常用的檢測測方法3.抑癌基因p53的檢測p53基因以密碼子子第175位、第248位、第249位、第273位及第282位點突變率最最高。在結(jié)直直腸癌、乳腺腺癌、小細胞胞肺癌,都可可見異常的p53基因蛋白。p53的基因診斷方方法有(1)PCR-SSCP分析技術(shù)(2)DNA序列分析(3)PCR-RFLP分析(一)乳腺癌癌1.乳腺癌常見見基因變異5%~10%乳腺癌患者有有家族遺傳性性。乳腺癌高高危家族中常常有抑癌基因因的BRCA基因(breastcancergene)的突變。BRAC1突變易致乳乳腺癌。突突變分布于于整個編碼碼序列,沒沒有明顯的的突變簇或或突變熱點點。70%的缺失或插插入導(dǎo)致編編碼序列的的框移和翻翻譯提前終終止。BRCA1在N端的一半部部位截短,,與乳腺癌癌和卵巢癌癌的高風(fēng)險險相關(guān);而而在C端截短則主主要與乳腺腺癌高危有有關(guān)。BRCA2基因在30%~40%的散發(fā)性乳乳腺癌有雜雜合性缺失失(LOH)。突變提提高乳腺癌癌易感性。。二、常見腫腫瘤的基因因診斷(1)PCR法檢測BRCA1基因突變(2)熒光原位位雜交(FISH)檢測BRCA2基因擴增2.乳腺癌基基因診斷方方法(二)結(jié)腸腸癌1.結(jié)腸癌常見見基因變異異在癌發(fā)展過過程的不同同階段發(fā)生生不同的基基因突變。。APC(adenomatouspolyposiscoli)是結(jié)腸癌癌發(fā)生過程程中第一個個突變基因因。K-ras原癌基因突突變也是結(jié)結(jié)腸癌形成成的早期事事件。DCC(deletionofcolorectalcancer)基因失活活是結(jié)腸癌癌發(fā)展的晚晚期事件。。抑癌基因因DPC4和MADR2也可能會因因18q等位基因丟丟失而失活活。p53基因的突變變是結(jié)腸癌癌發(fā)展過程程的晚期現(xiàn)現(xiàn)象。DNA修復(fù)基因也也與結(jié)腸癌癌有關(guān)。如如hMSH2、hMLH1、hPMS1或hPMS2基因的突變變所致的DNA錯配修復(fù)缺缺陷與遺傳傳性非息肉肉性結(jié)腸癌癌的發(fā)生有有關(guān)。二、常見腫腫瘤的基因因診斷(1)PCR-SSCP法:對腺瘤樣息息肉病人APC基因PCR-SSCP技術(shù)進行分分析。(2)異源雙鏈鏈PCR法:檢測APC基因變異。。(3)蛋白質(zhì)免免疫印跡法法:檢測因基因因突變而縮縮短了的APC蛋白。2.結(jié)腸癌基基因診斷方方法第五節(jié)基基因因診斷在法法醫(yī)學(xué)上的的應(yīng)用ApplicationofGeneDiagnosis
inForensicMedicine目錄錄重復(fù)復(fù)序序列列以以各各自自核核心心序序列列((重重復(fù)復(fù)單單元元))首首尾尾相相連連多多次次重重復(fù)復(fù),,稱稱為為串串聯(lián)聯(lián)重重復(fù)復(fù)序序列列,,其其重重復(fù)復(fù)次次數(shù)數(shù)在在人人群群中中存存在在變變異異,,形形成成多多態(tài)態(tài)性性。。串聯(lián)聯(lián)重重復(fù)復(fù)序序列列散散在在分分布布于于染染色色體體上上。。重復(fù)復(fù)單單位位6~25bp長,,稱稱為為小小衛(wèi)衛(wèi)星星DNA。重重復(fù)復(fù)單單位位2~6bp長,,如如((TA)n,(CGG)n等,,稱稱為為微微衛(wèi)衛(wèi)星星DNA。一、、DNA指紋紋與與多多態(tài)態(tài)性性遺遺傳傳標標記記可變變數(shù)數(shù)目目串串聯(lián)聯(lián)重重復(fù)復(fù)序序列列(VNTR)人類類染染色色體體上上小小衛(wèi)衛(wèi)星星DNA的高高度度可可變變區(qū)區(qū)((HVR)是是由由頭頭尾尾相相連連的的串串聯(lián)聯(lián)重重復(fù)復(fù)序序列列((tandemrepeat,TR)組組成成,,TR的核核心心序序列列同同源源性性很很高高,,等等位位HVR的長長度度由由于于TR的重重復(fù)復(fù)次次數(shù)數(shù)不不同同而而有有很很大大的的差差別別,,具具高高度度多多態(tài)態(tài)性性。。DNA長度度多多態(tài)態(tài)除除可可用用Southern印跡跡雜雜交交法法檢檢測測外外,,還還可可以以通通過過PCR擴增增后后電電泳泳來來檢檢出出。。擴增增片片段段長長度度多多態(tài)態(tài)(amplifiedfragmentlengthpolymorphism,Amp-FLP)1985年,,英英國國遺遺傳傳學(xué)學(xué)家家Jeffeys等人人用用TR的核核心心序序列列為為探探針針進進行行RFLP分析析時時,,檢檢測測到到許許多多HVR,并產(chǎn)生生相應(yīng)的的圖譜,,所得圖圖譜具有有高度的的個體特特異性,,達到了了如同人人類指紋紋那樣的的高度專專一性,,所以稱稱其為DNA指紋圖譜譜(DNAfingerprinting)。AlecJohnJeffreysOxford,UnitedKingdom目錄人類DNA指紋圖二、DNA指紋與法法醫(yī)學(xué)診診斷個體識別別和親子子鑒定::DNA指紋技術(shù)術(shù)是從基基因水平平檢測DNA的高度多多態(tài)性,,個體識識別率高高。以往在刑刑事案件件的法醫(yī)醫(yī)學(xué)鑒定定中應(yīng)用用的是血血型、血血清蛋白白型、紅紅細胞酶酶型和HLA分型,個個體分辨辨能力不不夠,只只能排除除,不能能做到統(tǒng)統(tǒng)一認證證。法醫(yī)案檢檢中的基基因診斷斷技術(shù)VNTR(可變數(shù)數(shù)目串聯(lián)聯(lián)重復(fù)序序列/小衛(wèi)星))的核酸酸分子雜雜交分析析STR(短串聯(lián)聯(lián)重復(fù)序序列/微衛(wèi)星))的PCR分析SNP的基因芯芯片檢測測1.單位點點探針檢檢測及PI值的計算算父權(quán)指數(shù)數(shù)(PaternityIndex,PI)值、父父權(quán)相對對指數(shù)或或親子關(guān)關(guān)系概率率值計算算方法基基本一致致。PI值表表示示爭爭議議父父作作為為親親父父比比隨隨機機男男人人作作為為親親父父的的可可能能性性大大多多少少倍倍,,PI值大大于于1表示示傾傾向向肯肯定定父父子子關(guān)關(guān)系系,,數(shù)數(shù)值值越越大大,,可可能能性性越越大大;;等等于于0時表表示示排排除除父父子子關(guān)關(guān)系系。2.DNA指紋紋圖圖與與親親權(quán)權(quán)鑒鑒定定多位位點點VNTR系統(tǒng)統(tǒng)和和DNA指紋紋圖圖的的電電泳泳分分離離后后片片段段數(shù)數(shù)目目較較多多,,各各等等位位基基因因頻頻率率分分布布的的計計算算復(fù)復(fù)雜雜,,進進行行親親權(quán)權(quán)鑒鑒定定和和個個體體識識別別時時匹匹配配概概率率的的計計算算影影響響因因素素較較多多,,目目前前尚尚無無一一個個公公認認的的最最合合理理的的計計算算方方法法。。目前解決親權(quán)權(quán)糾紛最簡單單的辦法是先先在孩子DNA指紋圖中找出出非母片段并并計數(shù)為P,然后分析爭爭議父DNA指紋圖,看P條非母帶在爭爭議父中出現(xiàn)現(xiàn)多少條。親權(quán)鑒定與DNA指紋圖由此圖可推斷斷出:A和C是親生女兒;;B為妻子和其前前夫所生;D為養(yǎng)女。第六節(jié)基基因治治療的概念及及策略ConceptandStrategyofGeneTherapy目錄基因治療:指將目的基因因通過基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移技術(shù)(病病毒載體介導(dǎo)導(dǎo)或者非病毒毒載體介導(dǎo)的的基因轉(zhuǎn)移技技術(shù))導(dǎo)入靶靶細胞內(nèi),目目的基因表達達產(chǎn)物對疾病病起治療作用用。目錄狹義基因治療療:指目的基因?qū)?dǎo)入靶細胞后后與宿主細胞胞內(nèi)的基因發(fā)發(fā)生整合、成成為宿主基因因組的一部分分,目的基因因表達產(chǎn)物起起治療疾病的的作用。廣義基因治療療:①外源正常基基因?qū)氩∽冏兗毎?,產(chǎn)生生正?;虻牡谋磉_產(chǎn)物以以補充缺失的的或失去正常常功能的蛋白白質(zhì);②采用適當?shù)牡募夹g(shù)抑制細細胞內(nèi)過度表表達的基因;;③將特定的基基因?qū)敕遣〔∽兗毎?,在在體內(nèi)表達特特定產(chǎn)物;④向功能異常常的細胞(腫腫瘤細胞)中中導(dǎo)入該細胞胞中本來不存存在的基因((如自殺基因因),利用這這些基因的表表達產(chǎn)物達到到治療疾病的的目的。目錄本節(jié)內(nèi)容提要要一、基因治療療的策略二二、基因轉(zhuǎn)移移技術(shù)
三、、基因干預(yù)四四、基因治治療的應(yīng)用研研究
五、基基因治療的前前景與問題目錄基因治療分類類體細胞(somaticcell)基因治療生殖細胞(germline)基因治療只限于某一體體細胞的基因因的改變只限于某個體體的當代對缺陷的生殖殖細胞進行矯矯正當代及子代一、基因治療療的策略(一)基因置置換(genereplacement)定義:指將特定的目目的基因?qū)肴胩囟毎?,,通過定位重重組,導(dǎo)入的的正常基因,,以置換基因因組內(nèi)原有的的缺陷基因。。目的:將缺陷基因的的異常序列進進行橋正。對缺陷基因的的缺陷部位進進行精確的原原位修復(fù),不不涉及基因組組的任何改變變。定向整合的條條件:轉(zhuǎn)導(dǎo)基基因的載體與與基因組DNA具有相同的序序列。帶有目目的基因的載載體就能找到到同源重組的的位點,進行行部分基因序序列的交換。?;蛲粗亟M組技術(shù)又稱為為基因打靶(genetargeting)細胞內(nèi)基因同同源重組的發(fā)發(fā)生率很低。?;蛲粗亟M組技術(shù)(二)基因因添加(geneaugmentation)定義:通過導(dǎo)入外源源基因使靶細細胞表達其本本身不表表達的基因。。類型:在有缺陷基因因的細胞中導(dǎo)導(dǎo)入相應(yīng)的正正?;?,而而細胞內(nèi)的缺缺陷基因并未未除去,通過過導(dǎo)入正常基基因的表達產(chǎn)產(chǎn)物,補償缺缺陷基因的功功能;向靶細胞中中導(dǎo)入靶細細胞本來不不表達的基基因,利用用其表達產(chǎn)產(chǎn)物達到治治療疾病的的目的。(三)基因因干預(yù)(geneinterference)定義:采用特定的的方式抑制制某個基因因的表達,,或者通過過破壞某個個基因的結(jié)結(jié)構(gòu)而使之之不能表達達,以達到到治療疾病病的目的。。定義:將“自殺”基因?qū)胨匏拗骷毎兄?,這種基基因編碼的的酶能使無無毒性的藥藥物前體轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化為細胞胞毒性代謝謝物,誘導(dǎo)導(dǎo)靶細胞產(chǎn)產(chǎn)生“自殺”效應(yīng),從而而達到清除除腫瘤細胞胞的目的。。應(yīng)用:是惡性腫瘤瘤基因治療療的主要方方法之一。。(四)自殺殺基因治療療(SuicideGeneTherapy)自殺基因的的作用機制制?TK/GCV單純皰疹病病毒(herpssimplexvirus,HSV)Ⅰ型胸苷激酶酶(thymidinekinase,tk)基因編碼胸胸苷激酶,,特異性地地將無毒的的核苷類似似物丙氧鳥鳥苷(ganciclovir,GCV)轉(zhuǎn)變成成毒性性GCV三磷酸酸核苷苷,后后者能能抑制制DNA聚合合酶酶活活性性,,導(dǎo)導(dǎo)致致細細胞胞死死亡亡。。1.自殺殺基基因因系系統(tǒng)統(tǒng)定義義:“自殺殺基基因因””導(dǎo)導(dǎo)入入后后,,不不僅僅使使轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)了了““自自殺殺基基因因””的的腫腫瘤瘤細細胞胞在在用用藥藥后后被被殺殺死死,,而而且且與與其其相相鄰鄰的的未未轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)““自自殺殺基基因因””的的腫腫瘤瘤細細胞胞也也被被殺殺死死。。2.旁觀觀者者效效應(yīng)應(yīng)((bystandereffect)(五五))基基因因免免疫疫治治療療通過過將將抗抗癌癌免免疫疫增增強強的的細細胞胞因因子子或或MHC基因?qū)肴肽[瘤組組織,以以增強腫腫瘤微環(huán)環(huán)境中的的抗癌免免疫反應(yīng)應(yīng)。二、基因因轉(zhuǎn)移技技術(shù)基因治療療的兩種種途徑載體目的基因因invivoexvivo靶細胞目錄基因轉(zhuǎn)移移(genetransfer)技術(shù)1.病毒毒介導(dǎo)的的基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移2.非病病毒介導(dǎo)導(dǎo)的基因因轉(zhuǎn)移1.病毒介導(dǎo)導(dǎo)的基因因轉(zhuǎn)移系系統(tǒng)病毒載體體介導(dǎo)的基基因轉(zhuǎn)移移效率較較高,因因此它也也是使用用最多的的基因治治療載體體。據(jù)統(tǒng)統(tǒng)計,有有72%的臨床床實驗計計劃和71%的的病例使使用了病病毒載體體,其中中用得最最多的是是反轉(zhuǎn)錄錄病毒載載體。反轉(zhuǎn)錄病病毒的結(jié)結(jié)構(gòu)及生生活周期期(1)反轉(zhuǎn)錄錄病毒兩端各有有一長末末端重復(fù)復(fù)序列LTR。。反轉(zhuǎn)錄病病毒前病病毒的結(jié)結(jié)構(gòu)特點點LTR由U3、R和U5三部分組組成。病毒有三三個結(jié)構(gòu)構(gòu)基因5ˊ端LTR下游有一一段病毒毒包裝所所必需的的序列((ψ)及剪接接供體位位點(SD)和剪接受受體位點點(SA)。。含有負鏈鏈DNA轉(zhuǎn)錄的引引物結(jié)合合位點(PBS)和正鏈DNA轉(zhuǎn)錄的引引物結(jié)合合位點。在U3內(nèi)有增強強子和啟啟動子;;U3和U5兩端分別別有病毒毒整合序序列(IS);在R內(nèi)還有poly(A)加尾信號。gag基因,編碼核核心蛋白和屬屬特異性抗原原;pol基因,編碼反反轉(zhuǎn)錄酶;env基因,編碼病病毒外殼或包包膜糖蛋白(包括外膜糖糖蛋白和穿膜膜蛋白)。反轉(zhuǎn)錄病毒介介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移系統(tǒng)——由兩部分組成成反轉(zhuǎn)錄病毒載載體:其基因組為缺缺陷型,保留留了病毒的包包裝信號ψ,而缺失病毒毒的包裝蛋白白基因;它可可以克隆并表表達外源治療療基因,但不不能自我包裝裝成有增殖能能力的病毒顆顆粒。輔助細胞株(如PA317):由另一種缺陷陷型反轉(zhuǎn)錄病病毒(即帶有有全套病毒包包裝蛋白基因因,但缺失包包裝信號ψ的反轉(zhuǎn)錄病毒毒)感染構(gòu)建建而成。能合合成包裝蛋白白,用于反轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄病毒載體體包裝,但本本身卻不能包包裝成輔助病病毒顆粒。Retroviralpackagingsystem反轉(zhuǎn)錄病毒載載體的特點①反轉(zhuǎn)錄病毒毒包膜上env編碼的糖蛋白白,能夠被許許多哺乳動物物細胞膜上的的特異性受體體識別,從而而使反轉(zhuǎn)錄病病毒攜帶的遺遺傳物質(zhì)高效效地進入靶細細胞。②反轉(zhuǎn)錄病毒毒結(jié)構(gòu)基因gag、env和pol的缺失不影響響其他部分的的活性。③前病毒通過過LTR高效整合至靶靶細胞基因組組中,有利于于外源基因在在靶細胞中的的永久表達。。④包裝好的假假病毒顆粒((攜帶目的基基因的重組反反轉(zhuǎn)錄病毒載載體)以出芽芽的方式分泌泌至輔助細胞胞培養(yǎng)的上清清液中,易于于分離制備。。反轉(zhuǎn)錄病毒載載體的主要缺缺點隨機整合,,有插入突突變、激活活癌基因的的潛在危險險;反轉(zhuǎn)錄病毒毒載體的容容量較小,,只能容納納7kb以下的外源源基因。(2)腺病毒(adenovirus)載體腺病毒是一一種大分子子(36kb)雙鏈無包膜膜DNA病毒。它通通過受體介介導(dǎo)的內(nèi)吞吞作用進入入細胞內(nèi),,然后腺病病毒基因組組轉(zhuǎn)移至細細胞核內(nèi),,保持在染染色體外,,不整合進進入宿主細細胞基因組組中。腺病毒是人人類呼吸道道感染的病病原體,但但目前尚未未發(fā)現(xiàn)與腫腫瘤發(fā)生有有關(guān)聯(lián)。宿宿主細胞范范圍廣,可可感染分裂裂和非分裂裂終末分化化細胞,如如神經(jīng)元等等。目錄腺病毒的優(yōu)優(yōu)點基因?qū)胄矢?,對對人類安全全;宿主范圍廣廣;基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與與細胞分裂裂無關(guān);重組腺病毒毒可通過口口服經(jīng)腸道道吸收、或或噴霧吸入入或氣管內(nèi)內(nèi)滴注;腺病毒載體體容量較大大,可插入入7.5kb外源基因。。目錄腺病毒載體體缺點宿主的免疫疫反應(yīng)導(dǎo)致致腺病毒載載體表達短短暫。有兩個環(huán)節(jié)節(jié)可能產(chǎn)生生復(fù)制型腺腺病毒。靶向性差。。不能整合到到靶細胞的的基因組DNA中。分裂增增殖快的的細胞,導(dǎo)導(dǎo)入的重組組病毒載體體,隨分裂裂而丟失的的機會增多多,表達時時間相對較較短。(3)腺病毒相相關(guān)病毒載載體一類單鏈線線狀DNA缺陷型病毒毒。其基因因組DNA小于5kb,無包膜,外外形為裸露露的20面面體顆粒。。AAV不能獨立復(fù)復(fù)制,只有有在輔助病病毒(如腺腺病毒、單單純皰疹病病毒等)存存在時,才才能進行復(fù)復(fù)制和溶細細胞性感染染,否則只只能建立溶溶源性潛伏伏感染。AAVVirusParticlesStructureofAAVVirusGenomicDNAREP:病毒復(fù)制制基因,CAP:編碼衣殼殼蛋白的基基因ITR:反向末端端重復(fù)序列列AAV的特點以潛伏感染染為主;病毒基因組組與細胞共共存;只要宿主細細胞正常,,AAV基因表達被被抑制而維維持潛伏狀狀態(tài);若細胞受刺刺激,表達達應(yīng)激基因因,AAV基因表達從從而使AAV病毒復(fù)制;;產(chǎn)生子代病病毒并釋放放,又感染染新的細胞胞,建立新新的潛伏狀狀態(tài)。AAV載體是目前前正在研究究的一類新新型安全載載體,它對對人類無致致病性。AAV可以高效定定點整合至至人19號號染色體的的特定區(qū)域域19q13.4中,并能較較穩(wěn)定地存存在。這種種靶向定點點整合可以以避免隨機機整合可能能帶來的抑抑癌基因失失活和原癌癌基因激活活的潛在危危險性,而而且外源基基因可以持持續(xù)穩(wěn)定表表達,并可可受到周圍圍基因的調(diào)調(diào)控,兼具具反轉(zhuǎn)錄病病毒載體和和腺病毒載載體兩者的的優(yōu)點。目錄AAV載體體的的缺缺陷陷AAV載體容量小,目前最多只能容納5kb外源DNA片段;感染效率比反轉(zhuǎn)錄病毒載體低,在40%~80%的成人中存在過感染;可能會引起免疫排斥。常用用基基因因治治療療載載體體
整合致病性感染細胞克隆容量反轉(zhuǎn)錄病毒載體隨機整合,效率高可能致病分裂細胞<7kb腺病毒載體不整合,可能丟失不致病分裂細胞、非分裂細胞
腺相關(guān)病毒載體定點整合(19號染色體特定區(qū)域)不致病分裂細胞、非分裂細胞<5kb<7.5kb2.非病病毒毒載載體體介介導(dǎo)導(dǎo)的的基基因因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移系系統(tǒng)統(tǒng)(1)脂脂質(zhì)質(zhì)體體介介導(dǎo)導(dǎo)的的基基因因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移技技術(shù)術(shù)脂質(zhì)質(zhì)體體介介導(dǎo)導(dǎo)的的基基因因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移技技術(shù)術(shù)使使用用方方便便、、成成本本低低廉廉。?;颈驹砝?利用用陽陽離離子子脂脂質(zhì)質(zhì)體體單單體體與與DNA混合合后后,,可可以以自自動動形形成成包包埋埋外外源源DNA的脂脂質(zhì)質(zhì)體體,,然然后后與與細細胞胞一一起起孵孵育育,,即即可可通通過過細細胞胞內(nèi)內(nèi)吞吞作作用用將將外外源源DNA(即目的基因))轉(zhuǎn)移至細胞胞內(nèi),并進行行表達。脂質(zhì)體介導(dǎo)的的基因轉(zhuǎn)移示示意圖目錄(2)受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移技術(shù)將DNA與細胞或組織織親和性的配配體偶聯(lián),可可使DNA具有靶向性。。這種偶聯(lián)通通常通過多聚聚陽離子(如如多聚賴氨酸酸)來實現(xiàn)。。多聚陽離子子與配體共價價連接后,又又通過電荷相相互作用與帶帶負電荷的DNA結(jié)合,將DNA包圍,只留下下配體暴露于于表面。這樣樣形成的復(fù)合合物可被帶有有特異性受體體的靶細胞吞吞飲,從而將將外源DNA導(dǎo)入靶細胞。。受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移移技術(shù)示意圖圖目錄(3)基因直接注注射技術(shù)不需要進行基基因工程的繁繁瑣操作,直直接將裸露DNA注入動物肌肉肉或某些器官官組織內(nèi)。動物實驗表明明:接受注射射外源DNA的小鼠能夠按按其基因編碼碼合成相應(yīng)的的蛋白質(zhì),并并能維持數(shù)月月之久。將促進心臟血血管生長的基基因直接注入入實驗鼠的心心臟,可使其其心臟壁內(nèi)毛毛細血管增加加30%~40%;將胰島素基因因直接注入鼠鼠骨骼肌細胞胞,能分泌糖糖尿病所缺少少的胰島素;;肌內(nèi)注射凝血血因子Ⅸ基因因,可產(chǎn)生血血友病所需的的凝血因子ⅨⅨ?;蛑苯幼⑸渖浞ǖ膬?yōu)點制備具有調(diào)控控部件的質(zhì)粒粒DNA重組體的技術(shù)術(shù)較容易;排除病毒載體體可能潛在的的致癌性或其其他副作用;;導(dǎo)入的基因不不需整合即可可表達,避免免了反轉(zhuǎn)錄病病毒載體導(dǎo)入入整合后,一一旦發(fā)生副作作用不易中止止或逆轉(zhuǎn)的缺缺點;基因直接注射射法可反復(fù)使使用,而病毒毒載體則可能能誘導(dǎo)體內(nèi)免免疫應(yīng)答,致致使反復(fù)治療療效果下降。。三、基因干預(yù)預(yù)(geneinterference)(一)反義RNA(antisenseRNA)1.反義RNA與基因表達調(diào)調(diào)控利用反義RNA對體外培養(yǎng)的的細胞進行基基因表達調(diào)控控,通常采用用的方法有兩兩種:(1)體外合合成反義RNA,直接作用于培培養(yǎng)細胞,細細胞吸收RNA后,發(fā)揮作用用。(2)構(gòu)建一一些能轉(zhuǎn)錄反反義RNA的重組質(zhì)粒,,將這些質(zhì)粒粒轉(zhuǎn)入細胞中中,轉(zhuǎn)錄出反反義RNA而發(fā)揮作用。。反義RNA的關(guān)鍵鍵技術(shù)術(shù)問題題?反義RNA進入靶靶細胞胞前的的降解解問題題?專一性性轉(zhuǎn)移移問題題2.受體介介導(dǎo)反反義RNA技轉(zhuǎn)移移術(shù)①受體體介導(dǎo)導(dǎo)的RNA轉(zhuǎn)移十十分專專一,,而且且效率率高;;②被轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移的的RNA是被保保護的的,與與周圍圍環(huán)境境之間間存在在多聚聚賴氨氨酸的的保護護層,可可以抵抵抗環(huán)環(huán)境中中的核核酸酶酶的降降解作作用。。借助前前述的的受體體介導(dǎo)導(dǎo)基因因轉(zhuǎn)移移方法法,可以實實現(xiàn)受受體介介導(dǎo)的的反義義RNA轉(zhuǎn)移。。3.反義RNA的優(yōu)點點受體介介導(dǎo)的的反義義RNA基因治治療有有其自自身的的優(yōu)點點,而而在一一定程程度上上補充充了轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因因治療療的不不足。。(l)安全全性高高(2))反義義RNA設(shè)計和和制備備方便便(3))具有有劑量量調(diào)節(jié)節(jié)效應(yīng)應(yīng)(4))能直直接作作用于于一些些RNA病毒(二))核酶酶(ribozyme)天然核核酶多多為單單一的的RNA分子,,具有有自我我剪切切作用用。但但核酶酶也可可以由由兩個個RNA分子組組成。。在基因因治療療時,,利用用核酶酶分子子結(jié)合合到靶靶RNA分子中中適當當?shù)牟坎课?,,形成成錘頭頭狀核核酶結(jié)結(jié)構(gòu),,將靶靶RNA分子切切斷,,通過過破壞壞靶RNA分子而而達到到治療療疾病病的目目的。。核酶錘錘頭狀狀的二二級、、三級級結(jié)構(gòu)構(gòu)只要兩兩個RNA分子通通過互互補序序列相相結(jié)合合,形形成錘錘頭狀狀的二二級結(jié)結(jié)構(gòu)((3個個螺旋旋區(qū))),并并能組組成核核酶的的核心心序列列(13個個或11個個保守守核苷苷酸序序列)),就就可在在錘頭頭右上上方產(chǎn)產(chǎn)生剪剪切反反應(yīng)。。目錄錄1.核酶的的設(shè)計計核酶是是通過過靶RNA分子與與核酶酶分子子共同同組成成酶活活性結(jié)結(jié)構(gòu)域域,要要從靶靶分子子和核核酶分分子兩兩個方方面來來設(shè)計計核酶酶。(1)選選擇合合適的的靶部部位,,該部部位具具有核核酶切切割位位點,,能與與核酶酶分子子結(jié)合合并組組成酶酶活性性結(jié)構(gòu)構(gòu)域。。(2)核核酶的的基本本組成成:用用于基基因治治療的的核酶酶分子子由三三個部部分組組成,,中間間是保保守序序列((能夠夠組成成酶活活性結(jié)結(jié)構(gòu)域域),,兩端端是引引導(dǎo)序序列。核酶的的作用用機制制2.核酶的的應(yīng)用用與一般般的反反義RNA相比,,核酶酶具有有較穩(wěn)穩(wěn)定的的空間間結(jié)構(gòu)構(gòu),不不易受受到RNA酶的攻攻擊。。更重重要的的是,,核酶酶在切切斷mRNA后,又又可從從雜交交鏈上上解脫脫下來來,重重新結(jié)結(jié)合和和切割割其它它的mRNA分子子。。(三三))干干擾擾RNA1.RNA干擾擾現(xiàn)現(xiàn)象象RNA干擾擾(RNAinterference,,RNAi))是一一種種由由雙雙鏈鏈RNA誘發(fā)發(fā)的的基基因因沉沉默默現(xiàn)現(xiàn)象象。。在在此此過過程程中中,,與與雙雙鏈鏈RNA有同同源源序序列列的的信信使使RNA((mRNA))被降降解解,,從從而而抑抑制制該該基基因因的的表表達達。。有有義義RNA((senseRNA))或反反義義RNA((antisenseRNA))均能抑抑制線線蟲基基因的的表達達,雙雙鏈RNA比單鏈鏈RNA更為有有效。。這與與傳統(tǒng)統(tǒng)上對對反義義RNA技術(shù)的的解釋釋正好好相反反。而而且其其抑制制基因因表達達的效效率比比反義義RNA至少高高2個個數(shù)量量級。。2.RNA干擾的的機制制RNA干擾過過程主主要有有2個個步驟驟:(1))小干干擾性性RNA(siRNA)(2))siRNA與細胞胞內(nèi)的的某些些酶和和蛋白白質(zhì)形形成復(fù)復(fù)合體體,稱稱為RNA誘導(dǎo)導(dǎo)的的沉沉默默復(fù)復(fù)合合體體((RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)。該復(fù)復(fù)合合體體可可識識別別與與siRNA有同同源源序序列列的的mRNA,,并在在特特異異的的位位點點將將該該mRNA切斷斷長雙雙鏈鏈RNA被細細胞胞內(nèi)內(nèi)的的雙雙鏈鏈RNA特異異性性核核酸酸酶酶Dicer切成成21~23個個堿堿基基對對的的短短雙雙鏈鏈RNA,,稱為為小小干干擾擾性性RNA((smallinterferingRNA,,siRNA))RNA干擾擾機機制制示示意意圖圖研究究基基因因功功能能的的新新工工具具由于于RNA干擾擾技技術(shù)術(shù)具具有有高高度度的的序序列列專專一一性性和和有有效效的的干干擾擾能能力力,,可可以以使使特特定定基基因因沉沉默默或或功功能能喪喪失失,,因因此此可可以以作作為為功功能能基基因因組組學(xué)學(xué)的的一一種種強強有有力力的的研研究究工工具具。。RNA干擾擾技技術(shù)術(shù)能能夠夠在在哺哺乳乳動動物物中中抑抑制制特特定定基基因因的的表表達達,,建建立立多多種種表表型型;;抑抑制制基基因因表表達達的的時時間間可可以以控控制制在在發(fā)發(fā)育育的的任任何何階階段段。。1.體外外化化學(xué)學(xué)合合成成;2.用質(zhì)質(zhì)粒粒載載體體或或病病毒毒載載體體可可在在細細胞胞內(nèi)內(nèi)穩(wěn)穩(wěn)定定地地生生成成。。siRNA的產(chǎn)產(chǎn)生生四、、基基因因治治療療的的應(yīng)應(yīng)用用研研究究(一一))遺遺傳傳病病的的基基因因治治療療研研究究(一)遺傳病病基因因治療療必須須符合合以下下要求求1.在DNA水平明明確其其發(fā)病病原因因及機機制;;2.必必須是是單基基因遺遺傳病病,而而且屬屬隱性性遺傳傳;3.該該基因因的表表達不不需要要精確確調(diào)控控;4.該該基因因能在在一種種便于于臨床床操作作的組組織細細胞中中表達達并發(fā)發(fā)揮其其生理理作用用;5.該該遺傳傳病不不經(jīng)治治療將將有嚴嚴重后后果(如不不治療療難以以存活活等)??煽晒┻x選擇并并符合合上述述4條以以上上要要求求的的不不過過只只有有30余余種種遺遺傳傳病病。。腺苷苷脫脫氨氨酶酶(ADA)和嘌嘌呤呤核核苷苷磷磷酸酸化化酶酶(PNP)缺乏乏癥癥珠蛋蛋白白生生成成障障礙礙性性貧貧血血和和血血紅紅蛋蛋白白病病血友友病病和和其其他他血血漿漿蛋蛋白白缺缺乏乏癥癥苯丙丙酮酮酸酸尿尿癥癥和和其其他他先先天天性性代代謝謝缺缺陷陷病病萊-納納(Lesch-Nyhan)綜合合征征家族族性性高高膽膽固固醇醇血血癥癥囊性性纖纖維維化化病病目錄錄(二二))惡惡性性腫腫瘤瘤基基因因治治療療研研究究(1)通通過過基基因因置置換換和和基基因因補補充充,,導(dǎo)導(dǎo)入入多多種種抑抑癌癌基基因因以以抑抑制制癌癌癥癥的的發(fā)發(fā)生生、、發(fā)發(fā)展展和和轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移移;;腫瘤發(fā)生是是一個極為為復(fù)雜的過過程,許多多基因的突突變會導(dǎo)致致腫瘤的發(fā)發(fā)生。(2)抑制癌基因因的活性,通通過干擾癌基基因的轉(zhuǎn)錄和和翻譯,發(fā)揮揮抑癌作用;;(3)增強腫瘤細細胞的免疫原原性,通過對對腫瘤組織進進行細胞因子子修飾,刺激激機體免疫系系統(tǒng)產(chǎn)生對腫腫瘤細胞的溶溶解和排斥反反應(yīng);(4)通過導(dǎo)入“自殺基因”殺傷癌細胞。。腫瘤基因治療療的常用方法法?基因干預(yù)技術(shù)術(shù):通過基因因干預(yù),抑制制腫瘤細胞中中過度表達的的癌基因,從從而降低其惡惡性表型。?自殺基因治療療:直接殺死死腫瘤細胞。。?腫瘤的免疫基基因治療:激激發(fā)機體腫瘤瘤免疫效應(yīng)或或提高免疫效效應(yīng)細胞功能能。?提高化療效果果的輔助基因因治療:藥物增敏基因因治療;耐耐藥基因治療療。自殺基因治療療基本原理:向腫瘤細胞內(nèi)內(nèi)導(dǎo)入某些真真核細胞中不不存在的酶基基因(自殺基基因),這些些基因表達的的特異性酶可可以催化對真真核細胞無毒毒或低毒的藥藥物前體,轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂幸忠种坪怂岷铣沙尚?yīng)的抗代代謝藥物,進進而選擇性地地使轉(zhuǎn)染了““自殺基因””的腫瘤細胞胞“自殺”。。自殺基因治療療是目前腫瘤瘤基因治療領(lǐng)領(lǐng)域中的研究究熱點之一。。腫瘤的免疫基基因治療激發(fā)機體腫瘤瘤免疫效應(yīng)或或提高免疫效效應(yīng)細胞功能能為目的的一一種腫瘤基因因治療方法。。主要包括:細胞因子(或或受體)基因因治療;抗原原抗抗體體基基因因治治療療。。臨床床上上對對腫腫瘤瘤患患者者進進行行化化療療時時,,通通常常面面臨臨兩兩大大難難題題::(1)患者機機體內(nèi)的的腫瘤細細胞對化化療藥物物的敏感感程度存存在差異異,特別別是某些些經(jīng)過多多次化療療的患者者,其體體內(nèi)的腫腫瘤細胞胞已經(jīng)產(chǎn)產(chǎn)生了多多藥耐藥藥性,對對多種化化療藥物物產(chǎn)生交交叉耐受受,最終終導(dǎo)致化化療失敗敗。(2)大劑量量的化療療可能導(dǎo)導(dǎo)致患者者的正常常細胞,,特別是是骨髓造造血細胞胞的功能能受到抑抑制。藥物增敏敏基因治治療:為了使化化療藥物物能夠最最大程度度地殺死死腫瘤細細胞,可可以將某某些藥物物增敏基基因?qū)肴肽[瘤細細胞,特特別是對對化療藥藥物原本本不敏感感的腫瘤瘤細胞,,使其對對抗腫瘤瘤藥物的的敏感性性大大增增加,從從而達到到增強化化療效果果的目的的。提高化療療效果的的輔助基基因治療療耐藥基因因治療::腫瘤細胞胞耐藥性性與多種種糖蛋白白或酶::多藥耐藥藥(mdr-1)基因編碼碼的P-糖蛋白、、多藥耐耐藥相關(guān)關(guān)蛋白((MRP))以及肺耐耐藥相關(guān)關(guān)蛋白等等;細胞內(nèi)氧氧化和解解毒作用用的酶系系統(tǒng):細胞色素素P-450(cytochromeP-450)、谷胱甘肽肽S-轉(zhuǎn)移酶((GST))以及谷胱胱甘肽過過氧化物物酶(GSH-PX))等。向腫瘤患患者的骨骨髓細胞胞導(dǎo)入某某種耐藥藥基因,,增強骨骨髓細胞胞的抗藥藥性,以以便耐受受大劑量量的化療療藥物,,達到徹徹底殺滅滅腫瘤細細胞的目目的。(三)病病毒性疾疾病的基基因治療療研究據(jù)統(tǒng)計,,75%的人類類傳染病病是由病病毒引起起的。病病毒感染染人體后后不僅可可能急性性發(fā)病,,還可以以在人體體內(nèi)長期期潛伏,,造成終終身傷害害。病毒毒還是造造成先天天畸形的的重要因因素之一一。它與與某些癌癌癥、自自身免疫疫性疾病病和內(nèi)分分泌疾病病也存在在一定的的關(guān)聯(lián)。。臨床上對對絕大多多數(shù)病毒毒感染性性疾病仍仍然缺乏乏有效的的治療手手段,在在眾多開開展的抗抗病毒治治療方案案中,抗抗病毒基基因治療療十分引引人注目目。1.調(diào)節(jié)節(jié)機體免免疫應(yīng)答答(1)將將細胞因因子(如如干擾素素、白細細胞介素素等)的的基因,,導(dǎo)入機機體免疫疫細胞,,激活免免疫細胞胞并促進進其增殖殖分化,,增強機機體的細細胞和體體液免疫疫應(yīng)答,,促進機機體清除除病毒感感染的細細胞和游游離病毒毒。(2)將將能夠誘誘導(dǎo)機體體產(chǎn)生保保護性免免疫應(yīng)答答的病毒毒抗原基基因,如如乙型肝肝炎病毒毒表面抗抗原基因因等,導(dǎo)導(dǎo)入機體體,表達達的抗原原不僅可可以誘導(dǎo)導(dǎo)機體產(chǎn)產(chǎn)生保護護性抗體體,還可可以引發(fā)發(fā)特異性性的細胞胞免疫應(yīng)應(yīng)答,產(chǎn)產(chǎn)生對野野生型致致病病毒毒攻擊的的防御作作用。2.抗病毒復(fù)復(fù)
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