5種植物精油抑菌活性及其化學成分研究

5種植物精油抑菌活性及其化學成分研究

馬秋章勇王照國段煉宋俊蓉劉務玲王春林楊華李??Summary從植物精油中尋找新型抑菌劑是植物化學研究的一個方向。本試驗提取了丁香、八角、孜然、薄荷和生姜5種藥食兼用植物的精油，采用抑制菌絲生長法和96孔板法測試了5種精油對8種植物病原真菌和5種細菌的抑菌活性。結果表明5種植物精油對測試真菌有不同程度的抑制作用，丁香的抑制作用最強，對梨黑星病菌的抑制作用最強，其IC50為93.44mg/L;5種植物精油對測試細菌的抑菌作用較弱，孜然和生姜精油對青枯菌的抑制最強，最小抑菌濃度（MIC）也僅為125mg/L。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）分析了各精油的主要化學成分，八角主要成分為茴香腦（53.16%），薄荷主要成分為長葉薄荷酮（15.85%），丁香主要成分為丁子香酚（82.68%），生姜主要成分為香葉醛（16.80%），孜然主要成分為茴香甲醛（46.06%）。本研究結果表明丁香具有開發(fā)為新型植物源抑菌劑的潛力。Key植物精油;抑菌活性;化學成分：S482.292：ADOI：10.16688/j.zwbh.2019215AntimicrobialactivityoftheessentialoilsfromfiveplantsMAQiu1，2，ZHANGYong3，WANGZhaoguo1，2，DUANLian1，2，SONGJunrong1，2，LIUWuling1，2，WANGChunlin1，2，YANGHua4，LIYan1，2*（1.StateKeyLaboratoryofFunctionsandApplicationsofMedicinalPlants，GuizhouMedicalUniversityGuiyang550014，China;2.TheKeyLaboratoryofChemistryforNaturalProductsofGuizhouProvinceandChineseAcademyofSciences，GuizhouProvincialEngineeringResearchCenterforNaturalDrugs，Guiyang550014，China;3.GuangdongEngineeringResearchCenterforInsectBehaviorRegulation，CollegeofAgronomy，SouthChinaAgriculturalUniversity，Guangzhou510642，China;4.SchoolofChemistryandChemicalEngineering，YananUniversity，Yanan716000，China）AbstractFindingnewbacteriostaticagentsfromplantessentialoilsisatrendinphytochemicalresearch.Inthisstudy，theessentialoilswereextractedfromfivekindsofplants，Syzygiumaromaticum，IlliciumverumHook.f.，CuminumcyminumL.，MenthahaplocalyxBriq.andZingiberofficinaleRoscoebysteamdistillation.Antifungalandantibacterialactivitiesoftheessentialoilsfromthefiveplantsweretestedbyinhibitingmycelialgrowthandusing96-wellmethod.Theresultsofantifungalactivityshowedthattheessentialoilsfromthefiveplantshadvaryingdegreesinhibitoryeffectsonthegrowthofeightplantpathogenicfungalhyphae.TheantifungalactivityofS.aromaticumoilwasthestrongest，witha50%inhibitionconcentration（IC50）of93.44mg/LagainstV.piritna.Theresultsofantibacterialactivityshowedthattheessentialoilshadweakactivitiesagainstallfivetestedbacteria.TheoilsofZ.officinaleandC.cyminumshowedstrongactivitiesagainstR.solanacearumandtheminimuminhibitoryconcentration（MIC）was125mg/L.Thechemicalconstituentsoftheessentialoilswereanalyzedbygaschromatography-massspectrometry（GC-MS）.TheresultsshowedthatthemaincomponentofessentialoilsofI.verumwasanethole（53.16%）.ThemaincontentofM.haplocalyxwaspulegone（15.85%），andthemaincontentsofS.aromaticum，Z.officinaleandC.cyminumwereeugenol（82.68%），geranylaldehyde（16.80%）andfennelformaldehyde（46.06%），respectively.TheseresultsindicatedthatS.aromaticumhasthepotentialfordevelopmentofnovelplant-derivedbacteriostats.Keywordsessentialoil;antibacterialactivity;chemicalconstituent目前通常使用化學農(nóng)藥來防控植物病害，然而，隨著化學農(nóng)藥的使用，其負面效應也逐漸顯露出來，如病原微生物產(chǎn)生抗藥性，對環(huán)境及其人體健康產(chǎn)生不利影響等，這些因素嚴重制約著化學農(nóng)藥的使用。隨著人們生活水平的提高，越來越注重健康和食品安全，對食品的需求也越來越向“綠色”和“天然”轉(zhuǎn)變，因此，開發(fā)天然、高效、低毒的抑菌產(chǎn)品已經(jīng)成為研究的熱點之一[1]。找尋“新型綠色抑菌劑”的需求顯得尤為突出，從植物精油中尋找具有應用價值的抑菌劑是植物化學研究的一個方向。植物精油（essentialoil）是一類存在于植物體內(nèi)、分子量較小的次生代謝產(chǎn)物，在常溫下易揮發(fā)，具有一定氣味的油狀液體的總稱[2]。因其來源于植物，并具有多種生物活性，正日益受到科研工作者的關注[3]。近年來，研究報道了多種植物精油具有廣譜的抗菌活性，對細菌、真菌均有顯著的抑制作用[4-6]。八角IlliciumverumHook.f.、丁香Syzygiumaromaticum（L.）Merr.&L.M.Perry、孜然CuminumcyminumL.、生姜ZingiberofficinaleRoscoe和薄荷MenthahaplocalyxBriq.均為藥食兼用的植物，資源豐富，廣泛應用于醫(yī)療保健和日常飲食中[7]。據(jù)報道，孜然精油的主要化學成分為2-蒈烯-10-醛[8-9]，抑菌活性測試表明其對晚疫病菌Phytophthorainfestans、擴展青霉Penicilliumexpansum、匍枝根霉Rhizopusstolonifer、茄腐鐮刀菌Fusariumsolani均具有明顯的抑制作用，最小抑菌濃度（MIC）依次為0.4‰、0.6‰、0.3‰、0.3‰[10]，對大腸桿菌Escherichiacoli和福氏志賀氏菌Shigellaflexneri作用最為明顯（MIC均為25μg/mL，MBC（最小殺菌濃度）均為50μg/mL）[11]。丁香精油的主要化學成分為丁香酚和石竹烯[12]，其對食品中常見腐敗菌及致病菌具有較強的抑制作用[13-15]。薄荷精油的主要成分為薄荷酮、異佛爾酮等[16]，對多種革蘭氏陰性和陽性菌具有較好的抑制作用，MIC值范圍為2.50%～0.62%[17]。八角精油主要成分為茴香腦、草蒿腦、茴香醚等，可顯著抑制大腸桿菌E.coli、枯草芽胞桿菌Bacillussubtilis、金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus、黑曲霉Aspergillusniger和黃曲霉A.flavus、棉花枯萎病菌F.oxysporumf.sp.vasinfectum（Atk.）Snyder&Hansen，MIC值為0.5～80mL/L[18-19]。生姜精油的主要化學成分為α-姜烯、β-倍半水芹烯[20-21]，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌Salmonella的MIC值均為0.1g/mL，對志賀氏痢疾桿菌S.castellani和蘇云金桿菌B.thuringiensis的MIC值均為0.05g/mL[22]，對青霉Penicillium和黑曲霉的MIC值均為0.78%[23]。5種精油化學成分及抑菌活性雖有報道，但對于產(chǎn)地為貴州的5種植物精油的主要化學成分及抑菌活性鮮有報道，另外，5種精油針對農(nóng)業(yè)致病菌的活性報道較少。鑒于此，本文采用水蒸氣蒸餾法提取了產(chǎn)自貴州的5種植物的精油，并系統(tǒng)測試了5種精油對多種植物病原真菌、細菌及其他致病菌的抑制作用。以期能篩選出可有效防控植物病原微生物和其他致病菌的天然產(chǎn)物，為下一步開發(fā)為植物源殺菌劑奠定基礎。1材料和方法1.1試驗材料1.1.1植物樣品八角I.verum和孜然C.cyminum的籽，丁香S.aromaticum的花蕾，生姜Z.officinale的塊根，薄荷M.haplocalyx葉，5種植物樣品均采自貴陽周邊地區(qū)。1.1.2供試菌株細菌：綠膿桿菌Pseudomonasaeruginosa、金黃色葡萄球菌S.aureus、大腸桿菌E.coli、青枯菌Ralstoniasolanacearum和枯草芽胞桿菌B.subtilis，均由貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室提供。真菌：黃瓜菌核病菌Sclerotiniasclerotiorum、人參銹病菌Cylindrocarpondestructans、油菜菌核病菌S.sclerotiorum（Lib.）de.Bary、腐皮鐮刀菌F.solani、立枯絲核菌R.solani、梨黑星病菌VenturiapiritnaAderh、蒼術黑斑病菌Alternariatenuissima和根腐病菌P.cinnamomi，均由貴州省中國科學院天然產(chǎn)物化學重點實驗室提供。1.1.3培養(yǎng)基Luria-Bertani液體培養(yǎng)基（LB）：胰蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl10.0g，加入去離子水至1000mL，用5mol/LNaOH調(diào)pH至7.4，滅菌后備用。馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）固體培養(yǎng)基（上海博微生物科技有限公司）：馬鈴薯浸粉5.0g，葡萄糖20.0g，瓊脂15.0g，氯霉素0.1g，加蒸餾水1000mL，加熱煮沸溶解，滅菌后備用。1.2儀器與試劑1.2.1儀器RE52-99型亞榮旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;ZNHW型電熱套（杭州明遠儀器有限公司）;DLSB-5/20型低溫冷卻液循環(huán)泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）;HBM-106型粉碎機（瑞安市瀚博機電有限公司）;FA2204B萬分之一電子天平（上海精密科學儀器有限公司）;HZQ-F160A恒溫振蕩器（上海一恒科學儀器有限公司）;LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）;SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設備有限公司）;HP6890/5975CGC/MS聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）。1.2.2試劑無水乙醇、二氯甲烷、無水硫酸鈉、二甲基亞砜（DMSO）均為市售分析純，吐溫-80為市售化學純，純水為本實驗室制備。1.3試驗方法1.3.1精油的提取采用水蒸氣蒸餾法提取5種植物精油[24]。將原材料陰干粉碎后過20目篩，各稱取1500g新鮮樣品置于5000mL的燒瓶中，按固液比1∶2加入3000mL蒸餾水，加熱，保持沸騰3～4h，回流冷凝收集蒸餾液。用二氯甲烷萃取收集到的蒸餾液，萃取液以無水硫酸鈉干燥，過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除溶劑，得到精油，密封，保存在4℃冰箱中備用。1.3.2抑菌活性測試采用抑制菌絲生長法測試抑制真菌的活性[25]：將樣品用一定量的二甲基亞砜（DMSO）溶解配制成300mg/mL溶液，加入少許吐溫-80，用滅菌的PDA培養(yǎng)基將溶液稀釋至2000、1000、500、250mg/L和125mg/L，使DMSO含量低于0.5%，將帶藥培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，待其凝固后接入活化后的待測真菌菌餅，每樣重復3次，以加入少許吐溫-80的等量DMSO溶劑作為空白對照，以三唑酮為陽性對照。置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6d，用十字交叉法測量菌落直徑，根據(jù)菌絲生長抑制率計算抑制中濃度（IC50）[26]。抑制細菌的活性[27]：將所選測試菌種活化后，用LB液體培養(yǎng)基稀釋菌液至0.5麥氏濁度;將樣品用一定量的DMSO溶解并用活化后的菌液配制成4000mg/L溶液，加入少許吐溫-80，使DMSO含量低于1.0%。采用96孔板2倍稀釋法測試5種精油的抑制細菌活性，以加入少許吐溫-80的等量DMSO的菌液作為空白對照，以環(huán)丙沙星為陽性對照。置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，以孔板上沒有渾濁的最小藥液濃度為樣品對供試細菌的最低抑菌濃度（MIC）。1.3.3化學成分分析氣相色譜條件：色譜柱為彈性石英毛細管柱（ZB-5MSI，30m×0.25μm×250μm），用正己烷將植物精油配制成150mg/L的溶液。測定八角、丁香、生姜、薄荷精油時，程序升溫：初始溫度為58℃保持2min，以3℃/min升溫速度升至160℃，再以10℃/min的速度升至310℃，八角和丁香處理運行40min，生姜和薄荷處理運行56min;孜然處理程序升溫：初始溫度48℃保持2min，以4℃/min升溫速度升至206℃，再以8℃/min的速度升至310℃，運行35min;柱子參數(shù)：汽化室溫度250℃，接口溫度280℃，進樣量1μL，載氣為99.99%的高純氦氣，丁香、薄荷、八角、生姜精油柱前壓均為8.11psi，孜然柱前壓為7.38psi，載氣流量1.0mL/min，分流比20∶1，溶劑滯后時間4.0min。5種植物精油的質(zhì)譜條件：電子能量70eV，離子源為EI源，EI源溫度230℃，發(fā)射電流34.6μA，四極桿溫度150℃，倍增器電壓1482V，質(zhì)量范圍29～500amu。各峰經(jīng)質(zhì)譜計算機數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索，標準圖譜庫Nist2005和Wiley275確定各精油的化合物結構，用峰面積歸一化法確定各成分的相對含量。2結果與分析2.15種植物精油抑制真菌活性5種植物精油對8種植物病原真菌的抑制活性測試結果見表1。由表可知，5種植物精油對測試真菌均有不同程度的抑制作用，其中丁香精油活性最好，對梨黑星病菌的作用最強，IC50為93.44mg/L。其次為孜然精油，其對人參銹病菌的活性最好，IC50為112.28mg/L。薄荷精油的抑菌作用最弱，對所有測試菌的IC50均高于300mg/L，其中對梨黑星病菌的活性最差，其IC50為797.04mg/L。在所有測試精油中，生姜精油對根腐病菌的抑制作用最弱，其IC50為1279.38mg/L，但對其他測試真菌的抑制作用較強，對立枯絲核菌的IC50也達到146.83mg/L。該結果表明5種植物精油具有較為廣譜的抑制真菌的作用，但與陽性對照相比活性較差。2.25種植物精油抑制細菌活性5種植物精油對細菌的抑制作用結果見表2。由表可知，5種植物精油對5種測試細菌均有一定的抑制作用，但遠遠小于陽性對照環(huán)丙沙星。與抑制真菌結果相似，亦是丁香和孜然精油的活性最好，對5種測試菌均有一定的抑制作用。孜然精油對青枯菌的MIC最小，為125mg/L，丁香精油對青枯菌和枯草芽胞桿菌的MIC均為250mg/L。八角、生姜、薄荷精油只對部分測試菌具有抑制作用，其中八角精油的活性最差，只對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌具有抑制作用，但MIC均大于1000mg/L。2.35種植物精油化學成分分析GC-MS檢測5種植物精油的主要化學成分見表3。八角精油中檢測出的化合物含量占總成分的98.97%，其主要成分是茴香腦和茴香醛，茴香腦占53.16%，茴香醛占25.68%。另外，芳樟醇的含量為7.18%，萜品烯醇-4和α-萜品醇的含量分別是2.44%和2.34%。薄荷精油中的化合物含量占總含量的99.30%，其中含量最多的為長葉薄荷酮，含量為15.85%，其次為異薄荷腦，含量為15.21%。薄荷烯酮醚和反-胡椒酮氧化物的含量分別為13.04%和12.66%，異薄荷酮9.07%。丁香精油中化合物較少，其含量占總含量的99.90%，其中含量最多的為丁子香酚，含量達到82.65%，其次為乙酰丁香酚，含量為15.81%，其余的化合物含量均較少。生姜精油檢測出的化合物，含量占總含量的74.41%。含量最多的香葉醛，含量為16.80%;其次為橙花醇，含量為11.89%;姜烯的含量為5.93%。孜然精油檢測出的化合物占總含量的99.99%。其中茴香甲醛和茴香腦的含量分別是46.06%和38.69%，這2種化合物含量為84.75%，是孜然揮發(fā)油中的主要物質(zhì)。草蒿腦的含量為7.96%，萜品烯和傘花烴的含量分別為2.80%和1.96%。3討論本文通過水蒸氣蒸餾法提取了5種藥食兼用植物的精油，采用抑制菌絲生長速率法和96孔板微量稀釋法測試了5種植物精油對多種植物病原真菌和細菌的抑制作用。結果表明，5種植物精油對多種植物病原真菌和細菌具有一定程度的抑制作用。本試驗中檢測出八角精油中的主要成分是茴香腦（53.16%）和茴香醛（25.68%），對8種測試植物病原真菌均有一定的抑制作用，但對所測細菌的活性較弱或沒有抑制作用，該結果與已報道的精油活性相差較大[18-19]。張赟彬等報道了檸檬烯為八角精油中的主要抑菌活性物質(zhì)[28]，而本試驗檢測出的檸檬烯含量僅為0.03%。文獻報道的主要成分與本文所測相似，但抑菌活性相差較大，推測與檸檬烯的含量有關。本試驗檢測出的生姜精油的主要成分是香葉醛（16.80%）和橙花醇（11.89%），對所測的植物病原真菌均有中等強度的抑菌活性，對細菌的抑制作用較弱。文獻報道生姜精油的主要成分為α-姜烯[20，29]、β-姜烯[21]、β-水芹烯[30]，本試驗檢測出的姜烯含量為5.93%，與文獻報道含量差距甚遠，推測可能是受提取工藝、采摘地點和采摘時節(jié)等因素的影響。多篇文章報道了生姜精油具有較強的抑菌活性，推測可能與姜精油中姜辣素、黃酮和多酚成分含量有關[22-23，31-32]，而這些物質(zhì)本試驗中并未檢測出，可能這就是本次測試活性較弱的原因。本試驗檢測出薄荷精油中的主要化學成分為長葉薄荷酮（15.85%）、異薄荷腦（15.21%），生測結果顯示其對植物病原真菌和一些細菌的抑制作用均較弱，且對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌沒有抑制作用。與本試驗檢測結果不同，文獻報道薄荷精油的主要成分為異佛爾酮[17]、香薷酮[33]、薄荷醇[34]，對一些病原細菌均具有良好的抗菌活性[17，35]，MIC值為5.00%～0.04%[17]。國內(nèi)亦有多篇文獻報道了不同品種、不同產(chǎn)地、不同采摘時間、不同提取方法的薄荷精油的成分及抑菌活性，結果表明薄荷精油中的化學成分相差較大，但均有較好的抑菌活性，推測可能原料品種、產(chǎn)地和提取方法不同導致了成分的差異[36]。本試驗所測孜然精油的主要成分為茴香甲醛（46.06%）和茴香腦（38.69%），而文獻報道其主要成分為2-蒈烯-10-醛、枯茗醛、3-蒈烯-10-醛[8-9，24]，這些化合物本次試驗均未檢出。另外，抑菌活性試驗顯示孜然精油對測試真菌和細菌均有中等強度的抑制作用，與文獻報道相似[11，24，37]，推測孜然精油中有多種成分具有抑菌活性。本試驗檢測出丁香精油中含量最多的為丁子香酚（82.68%），其次為乙酰丁香酚（15.81%），與文獻報道相似[12]。本試驗生測結果顯示丁香精油在5種被測精油中抑菌活性最強，該結果與文獻報道一致[14-15，37-38]。丁子香酚為丁香中的主要氣味物質(zhì)和抑菌物質(zhì)[14]，貴州產(chǎn)丁香中丁子香酚的含量高于文獻報道，據(jù)此可推測貴州產(chǎn)丁香應具有更強的丁香氣味及抑菌活性，故其品質(zhì)更優(yōu)。本文研究的5種貴州產(chǎn)藥食兼用植物精油的主要成分及抑菌活性雖與報道有差別，但其抑菌作用是毋庸置疑的，它們的活性與陽性對照相比較差，是因為5種植物精油均為粗提物，成分較多，活性物質(zhì)含量較低，故下一步本實驗室將在活性追蹤下分離這些植物精油中的活性物質(zhì)，以期尋找到新的抑菌活性物質(zhì)。本試驗研究結果顯示，5種植物精油對多種植物病原微生物具有抑制作用，但本次試驗均為體外測試，且精油往往對植物具有化感作用，故這些精油對于植物相關病癥的效果，還需進一步的盆栽試驗驗證。另外，本文中的植物均為人們通常添加到食物中的香料植物，千百年來的食用結果表明這些植物對人體無毒、無副作用，本研究的結果將為食物及食材的保鮮提供新的方法，為天然產(chǎn)物在食品安全領域的應用開發(fā)提供理論依據(jù)。Reference[1]疏秀林，施慶珊，歐陽友生，等.植物精油的抗菌特性及在食品工業(yè)中研究進展[J].生物技術，2006，16（6）：89-92.[2]肖崇厚.中藥化學[M].上海：上?？茖W技出版社，1993：75-78.[3]李文茹，施慶珊，莫翠云，等.幾種典型植物精油的化學成分與其抗菌活性[J].微生物學通報，2013，40（11）：2128-2137.[4]CEYLANE，F(xiàn)UNGDYC.Antimicrobialactivityofspices[J].JournalofRapidMethodsandAutomationinMicrobiology，2004，12（1）：1-55.[5]BAJPAIVK，YOONJI，KANGSC.AntifungalpotentialofessentialoilandvariousorganicextractsofNandinadomesticaThunb.againstskininfectiousfungalpathogens[J].AppliedMicrobiologyandBiotechnology，2009，83（6）：1127-1133.[6]DELESPAULQ，BILLERBECKVG，ROQUESCG，etal.Theantifungalactivityofessentialoilsasdeterminedbydifferentscreeningmethods[J].JournalofEssent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