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第三篇基因信息的傳遞
第十章DNA的生物合成(復(fù)制)第十一章轉(zhuǎn)錄第十二章翻譯第十三章基因表達(dá)調(diào)控第三篇基因信息的傳遞第十章DNA的生物合成(復(fù)制1中心法則基因:是為生物活性產(chǎn)物編碼的DNA功能片段,這些產(chǎn)物主要是蛋白質(zhì)或是各種RNA中心法則基因:是為生物活性產(chǎn)物編碼的DNA功能片段,這些產(chǎn)物2第十章DNA的生物合成(復(fù)制)復(fù)制的要點(diǎn)1半保留復(fù)制2有起始點(diǎn)、終止點(diǎn)和方向3半不連續(xù)復(fù)制第十章DNA的生物合成(復(fù)制)復(fù)制的要點(diǎn)3第一節(jié)半保留復(fù)制半保留復(fù)制:當(dāng)細(xì)胞分裂,DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí),雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而成為單鏈,用于合成新的互補(bǔ)鏈。子代細(xì)胞出現(xiàn)新的DNA雙鏈,其中一股單鏈?zhǔn)菑挠H代完整地接受過(guò)來(lái)的舊鏈。另一股單鏈完全重新合成的新鏈,且按堿基配對(duì)原則與舊鏈互補(bǔ)。第一節(jié)半保留復(fù)制半保留復(fù)制:當(dāng)細(xì)胞分裂,DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí)41、Watson和Crick的半保留復(fù)制模型:
DNA雙螺旋的兩條鏈堿基通過(guò)A-T、G-C之間的氫鍵聯(lián)結(jié),并且兩條鏈互補(bǔ)。因此,Watson和Crick提出DNA的半保留復(fù)制模型:雙螺旋揭開(kāi),每條鏈作為模板,以四種脫氧核苷三磷酸(dNTP)為底物,在依賴于DNA的DNA聚合酶催化下,按照A-T、G-C配對(duì)方式,合成與兩條模板鏈脫氧核苷酸對(duì)應(yīng)的兩條新鏈,然后以一新一舊脫氧多核苷酸組成的雙鏈分別進(jìn)入子細(xì)胞。
1、Watson和Crick的半保留復(fù)制模型:52、模型的試驗(yàn)證明:
1958年Meselson和Stahl用密度梯度離心法結(jié)合同位素標(biāo)記法進(jìn)行證明試驗(yàn):(1)將大腸桿菌在含標(biāo)記的15NH4Cl的培養(yǎng)基內(nèi),繁殖12代,保證DNA上的N都是15N;(2)將上述培養(yǎng)好的細(xì)菌轉(zhuǎn)入到含14NH4Cl的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),并在細(xì)菌剛轉(zhuǎn)入14NH4Cl中(0代)以及在此培養(yǎng)基中分裂1、2、3、4代時(shí)分別取樣分析;2、模型的試驗(yàn)證明:6生物化學(xué)之DNA的生物合成課件7生物化學(xué)之DNA的生物合成課件8第二節(jié)DNA復(fù)制的酶學(xué)1.底物:dNTP(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)2.聚合酶:DNA聚合酶(DNA依賴的DNA聚合酶)DNA--pol3.模板:?jiǎn)捂湹腄NA母鏈4.引物:寡核苷酸引物(RNA)5.其他酶和蛋白質(zhì)因子:解鏈酶,解旋酶,單鏈結(jié)合蛋白,連接酶第二節(jié)DNA復(fù)制的酶學(xué)1.底物:dNTP(dATP,dG9DNA聚合酶的活性5′至3′的聚合活性5′→3′方向核酸外切酶活性5′→3′外切酶活性3′→5′外切酶活性DNA聚合酶的活性5′至3′的聚合活性10一、聚合酶催化的反應(yīng)5′至3′的聚合活性(5′→3′)一、聚合酶催化的反應(yīng)5′至3′的聚合活性(5′→3′)11
核酸外切酶活性
3′→5′外切酶活性
5′→3′外切酶活性
核酸外切酶活性12聚合反應(yīng)在DNA聚合酶催化下,四種脫氧核糖核苷三磷酸(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)被加到DNA鏈的3’末端,同時(shí)釋放出無(wú)機(jī)焦磷酸。1、DNA鏈的游離3’-羥基對(duì)進(jìn)入的dNTP磷原子發(fā)生親核攻擊,形成3’,5’-磷酸二酯鍵,并脫下焦磷酸2、形成磷酸二酯鍵的能量來(lái)自α-與β-磷酸基之間高能鍵的裂解3、聚合反應(yīng)可逆,但隨焦磷酸的水解可推動(dòng)反應(yīng)的完成4、DNA鏈由5’向3’方向延長(zhǎng)5、需要有游離的3’-羥基,即需要引物鏈聚合反應(yīng)13二、DAN聚合酶結(jié)構(gòu)(一)原核生物:polⅠ:與校讀,修復(fù)有關(guān)A、DNA聚合酶活力:通過(guò)核苷酸聚合反應(yīng)使DNA鏈沿5’→3’方向延長(zhǎng);B、
3’→5’核酸外切酶活力:由3’端水解DNA鏈。在正常情況下該活力受抑制,一旦出現(xiàn)錯(cuò)配堿基時(shí),聚合反應(yīng)停止,該活力會(huì)切去錯(cuò)配堿基,起校對(duì)作用;C、5’→3’核酸外切酶活力:由5’端水解DNA鏈。切除嘧啶二聚體和RNA引物。小片段:5′→3′核酸外切酶活性大片段(Klenow片段):聚合活性、3′→5′外切活性(常用的工具酶)二、DAN聚合酶結(jié)構(gòu)(一)原核生物:14polⅡ:以帶有缺口的雙鏈DNA為模板和引物,從5’→3’方向合成DNA,同時(shí)具有3’→5’外切酶活力??赡茉贒NA的修復(fù)中起作用。
polⅡ:15
polⅢ:真正起復(fù)制作用的酶。由10種亞基組成的不對(duì)稱二聚體,α、ε、θ組成核心酶活性:聚合活性、3′→5′外切活性
α+ε+θ
polⅢ(核心酶)
polⅢ(核心酶)+τ
polⅢ’polⅢ’+γ+δ
polⅢ*(全酶)
α具有聚合酶活力,ε具有校對(duì)功能,θ是組建核心酶因子,τ是二聚化因子,γ和δ是延長(zhǎng)因子,β識(shí)別引物并引導(dǎo)聚合酶結(jié)合,復(fù)制起始時(shí)被釋放。pol只作用于有缺口的雙鏈DNA,pol’可作用于有引物的長(zhǎng)單鏈DNA,pol*是天然的聚合酶polⅢ:16(二)真核生物(DNA-pol):DNA聚合酶α:與隨從鏈的合成有關(guān)。需要以缺口雙鏈或帶引物的單鏈DNA為模板,引物是DNA或RNA短鏈,RNA引物由引物合成酶合成DNA聚合酶β:核酸外切酶活性,與修復(fù)有關(guān)DNA聚合酶γ:存在于線粒體。以RNA為模板,以DNA短鏈為引物DNA聚合酶δ:與領(lǐng)頭鏈的合成有關(guān)。具有3’→5’外切酶活力DNA聚合酶ε:與校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口有關(guān)(二)真核生物(DNA-pol):17核酸外切酶活性和即時(shí)校讀DNA-polⅠ,Ⅱ的3′→5′外切酶活性(主要應(yīng)用在引物切除后的缺口復(fù)制)復(fù)制的保真性和堿基選擇polⅢ
的ε亞基先形成氫鍵,再生成磷酸二酯鍵依賴三種機(jī)理1遵守嚴(yán)格的堿基互補(bǔ)配對(duì)規(guī)律2聚合酶在復(fù)制延長(zhǎng)中對(duì)堿基的選擇功能3復(fù)制中出錯(cuò)時(shí)有即時(shí)校讀功能(三)DNA聚合酶的核酸外切酶活性和復(fù)制的保真性核酸外切酶活性和即時(shí)校讀(三)DNA聚合酶的核酸外切酶活性和18
三、復(fù)制中解鏈和DNA分子的拓?fù)鋵W(xué)變化(一)解鏈酶
領(lǐng)頭鏈
DnaB(解旋酶)
隨從鏈
解鏈酶ⅡSSB:?jiǎn)捂溄Y(jié)合蛋白三、復(fù)制中解鏈和DNA分子的拓?fù)鋵W(xué)變化(一)解鏈酶S19(二)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(解旋酶)
既能水解,又能連接磷酸二酯鍵
拓?fù)涿涪瘢呵袛郉NA雙鏈中的一股(原核生物中只能消除負(fù)超螺旋,真核生物中能消除正、負(fù)超螺旋)
拓?fù)涿涪颍呵袛郉NA雙鏈(同上)
(三)單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)維持模板處于單鏈狀態(tài)保護(hù)單鏈的完整(二)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(解旋酶)20四、引物酶和引發(fā)體引物酶:RNA聚合酶-DnaG引發(fā)體:DnaG和DnaBDnaA辨認(rèn)復(fù)制啟始點(diǎn),然后解鏈酶DnaB在DnaC幫助下結(jié)合解鏈區(qū),并在DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶協(xié)助下沿DNA鏈5’→3’方向解鏈,并由SSB蛋白保護(hù)單鏈。解鏈后,在復(fù)制起點(diǎn)DnaB活化DnaG,促使其合成RNA引物。四、引物酶和引發(fā)體21生物化學(xué)之DNA的生物合成課件22五、DNA連接酶(ligase)催化兩段DNA之間的連接NAD:煙酰胺腺嘌呤二核苷酸;NMN:煙酰胺單核苷酸+AMP但實(shí)際上在切口處5’端的往往是RNA引物切除后留下一個(gè)單磷酸基,不具備羥基親和攻擊的條件,由此:五、DNA連接酶(ligase)催化兩段DNA之間的連接N23DNA連接酶
催化雙鏈DNA切口處的5’-磷酸基和3’-羥基生成磷酸二酯鍵:(1)形成酶-AMP復(fù)合物:
NAD(細(xì)菌)連接酶-AMP+NMN+連接酶→
ATP(動(dòng)物)連接酶-AMP+PPi
(2)形成A-P-P-DNA:連接酶-AMP+5’P-DNA→A-P-P-DNA+連接酶
形成了焦磷酸鍵(3)生成3’,5’-磷酸二酯鍵:
DNA-OH3’+A-P-P-DNA→DNA-O-P-DNA+AMP
相鄰鏈3’-OH對(duì)活化的磷原子發(fā)生親核攻擊
DNA連接酶24第三節(jié)DNA生物合成過(guò)程一復(fù)制的起始
(一)復(fù)制起始點(diǎn)和復(fù)制叉原核生物從一個(gè)固定的起始點(diǎn)開(kāi)始,同時(shí)向兩個(gè)方向進(jìn)行的,稱為雙向復(fù)制真核細(xì)胞染色體比較復(fù)雜,可能有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn),同時(shí)形成多個(gè)復(fù)制單位復(fù)制叉----復(fù)制開(kāi)始后由于DNA雙鏈解開(kāi),在兩股單鏈上進(jìn)行復(fù)制,形成在顯微鏡下可看到的叉狀結(jié)構(gòu),稱為復(fù)制叉E.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriC跨度為245bp,包含有三組串聯(lián)重復(fù)序列和兩對(duì)反向重復(fù)序列第三節(jié)DNA生物合成過(guò)程一復(fù)制的起始真核細(xì)胞染色體25生物化學(xué)之DNA的生物合成課件261、復(fù)制的起點(diǎn):?jiǎn)蝹€(gè)固定的起點(diǎn):原核生物的染色體和質(zhì)粒、真核生物的細(xì)胞器DNA都是環(huán)狀雙鏈分子,具有單個(gè)固定的起點(diǎn);多個(gè)起點(diǎn):真核生物染色體是線性雙鏈分子,含有許多起點(diǎn)多復(fù)制子)。1、復(fù)制的起點(diǎn):272、復(fù)制方向:直線雙向式:?jiǎn)纹瘘c(diǎn),雙方向。有對(duì)稱的和不對(duì)稱多起點(diǎn)雙向式:真核生物染色體DNA的復(fù)制θ型雙、單向式:環(huán)狀DNA的復(fù)制。有雙向和單向(單向的形成一個(gè)復(fù)制叉,雙向的形成兩個(gè)復(fù)制叉),有對(duì)稱和不對(duì)稱(一個(gè)叉完成1/5,其余4/5由另一個(gè)叉完成)D-環(huán)式:?jiǎn)蜗驈?fù)制。在固定點(diǎn)解開(kāi)后一條鏈先復(fù)制,待復(fù)制到一定距離時(shí),露出另一鏈的復(fù)制起點(diǎn),才開(kāi)始另一鏈的復(fù)制2、復(fù)制方向:28滾動(dòng)環(huán)式:?jiǎn)蜗驈?fù)制,低等生物如質(zhì)粒共價(jià)閉環(huán)雙鏈分子的正鏈由核酸內(nèi)切酶在一特定位點(diǎn)切開(kāi),游離出的5’-磷酸基末端固定在細(xì)胞膜上,然后以環(huán)狀負(fù)鏈為模板,從正鏈的3’-OH末端延長(zhǎng)形成正鏈。不需要另外合成引物。滾動(dòng)環(huán)式:?jiǎn)蜗驈?fù)制,低等生物如質(zhì)粒29(二)引發(fā)體的生成復(fù)制過(guò)程需要引物--短鏈RNA引物酶:合成RNA引物(十個(gè)bp左右),方向?yàn)?’到3’DnaA辨認(rèn)復(fù)制啟始點(diǎn),然后引物酶(DnaG蛋白)進(jìn)入,加上DnaB蛋白和DnaC蛋白等,與DNA的起始復(fù)制區(qū)域形成引發(fā)體。DNA聚合酶Ⅲ
由其β亞單位辨認(rèn)引物,新鏈的第一個(gè)脫氧核苷酸與引物的3-OH形成磷酸二酯鍵,開(kāi)始復(fù)制拓?fù)洚悩?gòu)酶松弛螺旋。(二)引發(fā)體的生成30復(fù)制過(guò)程中各酶和蛋白質(zhì)因子的作用復(fù)制過(guò)程中各酶和蛋白質(zhì)因子的作用31二復(fù)制的延長(zhǎng)原核生物為polⅢ真核生物為DNA聚合酶α和δ,其中α與隨從鏈的合成有關(guān),δ與領(lǐng)頭鏈的合成有關(guān)(一)復(fù)制延長(zhǎng)的生化過(guò)程原核生物復(fù)制延長(zhǎng)的速度很快真核生物復(fù)制有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)(二)復(fù)制的半不連續(xù)性和岡崎片段領(lǐng)頭鏈?zhǔn)沁B續(xù)合成的,而隨從鏈則是不連續(xù)合成岡崎片段:岡崎用電子顯微鏡看到了DNA復(fù)制過(guò)程中出現(xiàn)一些不連續(xù)片段,這些不連續(xù)片段只存在于NA復(fù)制叉上其中的一股。后來(lái)就把這些不連續(xù)的片段稱為岡崎片段二復(fù)制的延長(zhǎng)32三復(fù)制的終止(一)原核生物復(fù)制終止及不連續(xù)片段連接復(fù)制有終止點(diǎn)ter領(lǐng)頭鏈?zhǔn)遣婚g斷延長(zhǎng)的,隨從鏈?zhǔn)巧梢粋€(gè)個(gè)的岡崎片段,最后連接成一條完整的DNA鏈。polⅠ5′→3′外切酶活性水解引物polⅠ聚合活性填補(bǔ)空隙DNA連接酶連接缺口。三復(fù)制的終止(一)原核生物復(fù)制終止及不連續(xù)片段連接33polⅠpolⅠ34(二)真核生物的端粒和端粒酶端粒:是真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)
富含GC的重復(fù)序列人:(TTAGGG)n端粒酶:RNA--蛋白質(zhì)復(fù)合物既有模板,又有逆轉(zhuǎn)錄酶以自身的RNA為模板延長(zhǎng)DNA單鏈,然后反折為雙鏈,爬行模式端粒酶與生物體的衰老、腫瘤的發(fā)生有關(guān)(二)真核生物的端粒和端粒酶35第四節(jié)DNA的損傷修復(fù)突變-----DNA分子上堿基的改變自發(fā)突變、人工誘變一突變的意義突變是進(jìn)化、分化的分子基礎(chǔ)只有基因型改變的突變致死性的突變突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)第四節(jié)DNA的損傷修復(fù)突變-----DNA分子上堿基的改36二、引發(fā)突變的因素
誘變因素及突變類型二、引發(fā)突變的因素誘37三、突變分子改變的類型錯(cuò)配(點(diǎn)突變)一個(gè)堿基改變?nèi)笔?、插入和框移突變片段插入或缺失重排較大片段重組或重排三、突變分子改變的類型38生物化學(xué)之DNA的生物合成課件39四、損傷的修復(fù)損傷--復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的DNA突變光修復(fù)切除修復(fù)重組修復(fù)SOS修復(fù)四、損傷的修復(fù)損傷--復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的DNA突變40(一)光修復(fù)紫外光照射可使相鄰的兩個(gè)T形成二聚體(T^T)
光修復(fù)酶可使二聚體解聚為單體狀態(tài),DNA完全恢復(fù)正常。光修復(fù)酶的激活需300-600μm波長(zhǎng)的光。(一)光修復(fù)41(二)切除修復(fù)參與的酶有核酸內(nèi)切酶,polⅠ,DNA連接酶核酸內(nèi)切酶識(shí)別損傷部位→切開(kāi)核酸單鏈→外切酶切除損傷部位→聚合酶修復(fù)→連接酶連接(二)切除修復(fù)核酸內(nèi)切酶識(shí)別損傷部位→切開(kāi)核酸單鏈→外切酶切42(三)重組修復(fù)重組蛋白R(shí)ecA,polⅠ,連接酶參與。損傷會(huì)保留下去聚合酶在損傷部位跳過(guò)去,在下一個(gè)岡崎片段的起始位置或前導(dǎo)鏈的相應(yīng)位置上重新合成引物和DNA鏈。這樣,新鏈在損傷相對(duì)應(yīng)處留下缺口。然后,完整的母鏈上相對(duì)應(yīng)于損傷部位的正確核苷酸序列片段移到有缺口的新鏈上,而母鏈上的空缺則通過(guò)聚合來(lái)補(bǔ)上。損傷鏈的損傷并未除去,但在后代中已被稀釋。(三)重組修復(fù)聚合酶在損傷部位跳過(guò)去,在下一個(gè)岡崎片段的起始43(四)SOS修復(fù)DNA損傷面太大,復(fù)制難以繼續(xù)。復(fù)制的酶,修復(fù)的酶,重組蛋白R(shí)ecA,調(diào)控蛋白LexA等組成一個(gè)龐大的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。特異性很低著色性干皮?。夯颊呷狈μ禺惖暮怂醿?nèi)切酶,紫外光照射后易患皮膚癌(四)SOS修復(fù)441、SOS反應(yīng)誘導(dǎo)的修復(fù)系統(tǒng):
(1)避免差錯(cuò)修復(fù):應(yīng)急反應(yīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生修復(fù)所需的酶和蛋白,增強(qiáng)切除修復(fù)和重組修復(fù)能力;
(2)傾向差錯(cuò)修復(fù):應(yīng)急反應(yīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生缺乏校對(duì)功能的聚合酶,可在損傷部位進(jìn)行復(fù)制,但帶來(lái)高變異率。1、SOS反應(yīng)誘導(dǎo)的修復(fù)系統(tǒng):452、誘導(dǎo)修復(fù)的機(jī)制:
SOS反應(yīng)是由RecA蛋白(在同源重組中也起重要作用)和LexA阻遏物相互作用引起的。
未誘導(dǎo)細(xì)胞:RecA蛋白不具有蛋白水解酶活力由lexA基因編碼的LexA蛋白成為許多基因(包括修復(fù)基因、recA基因及l(fā)exA基因本身等)的阻遏物SOS反應(yīng):激活RecA蛋白的蛋白水解酶活力,對(duì)
LexA蛋白產(chǎn)生水解作用,由此解除了許多基因的抑制,產(chǎn)生包括修復(fù)中關(guān)鍵酶和蛋白質(zhì)的產(chǎn)物。SOS反應(yīng)→(激活)RecA蛋白→(水解)LexA蛋白→(消除阻遏物L(fēng)exA蛋白)產(chǎn)生關(guān)鍵酶或蛋白質(zhì)。
2、誘導(dǎo)修復(fù)的機(jī)制:46第五節(jié)逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象和逆轉(zhuǎn)錄酶RNA病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(reversetranscriptase,RT)逆轉(zhuǎn)錄活性(依賴于RNA的DNA聚合酶活性)RNaseH活性DNA聚合酶活性(依賴于DNA的DNA聚合酶活性)第五節(jié)逆轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象和逆轉(zhuǎn)錄酶RNA病毒47生物化學(xué)之DNA的生物合成課件48本章要點(diǎn)1、掌握生物學(xué)中心法則。2、掌握DNA聚合酶催化的反應(yīng),復(fù)制保真性依賴的機(jī)理。3、掌握DNA點(diǎn)突變、缺失、插入、倒位的概念、損傷的修復(fù)方式。4、掌握半保留復(fù)制,不連續(xù)復(fù)制的概念。5、熟悉解鏈酶,拓?fù)洚悩?gòu)酶,引物酶及DNA連接酶催化的反應(yīng)。本章要點(diǎn)1、掌握生物學(xué)中心法則。49復(fù)習(xí)思考題1、DNA復(fù)制時(shí)不需要下列哪一種酶?ADNA指導(dǎo)的DNA聚合酶BRNA指導(dǎo)的DNA聚合酶CDNA指導(dǎo)的RNA聚合酶D連接酶E拓?fù)洚悩?gòu)酶
2下列過(guò)程中不需要DNA連接酶參與的是ADNA復(fù)制BDNA重組CDNA修復(fù)DDNA修飾復(fù)習(xí)思考題1、DNA復(fù)制時(shí)不需要下列哪一種酶?503DNA復(fù)制時(shí),如模板鏈為
5′-TAGA-3′將會(huì)合成哪種互補(bǔ)結(jié)構(gòu)?A5′-TCTA-3′B5′-ATCT-3′C5′-UCUA-3′D5′-AUCU-3′4名詞解釋半保留復(fù)制領(lǐng)頭鏈隨從鏈崗崎片段點(diǎn)突變5在DNA半保留復(fù)制中,兩條新合成的鏈為什么都可以5′→3′延長(zhǎng)?3DNA復(fù)制時(shí),如模板鏈為51第三篇基因信息的傳遞
第十章DNA的生物合成(復(fù)制)第十一章轉(zhuǎn)錄第十二章翻譯第十三章基因表達(dá)調(diào)控第三篇基因信息的傳遞第十章DNA的生物合成(復(fù)制52中心法則基因:是為生物活性產(chǎn)物編碼的DNA功能片段,這些產(chǎn)物主要是蛋白質(zhì)或是各種RNA中心法則基因:是為生物活性產(chǎn)物編碼的DNA功能片段,這些產(chǎn)物53第十章DNA的生物合成(復(fù)制)復(fù)制的要點(diǎn)1半保留復(fù)制2有起始點(diǎn)、終止點(diǎn)和方向3半不連續(xù)復(fù)制第十章DNA的生物合成(復(fù)制)復(fù)制的要點(diǎn)54第一節(jié)半保留復(fù)制半保留復(fù)制:當(dāng)細(xì)胞分裂,DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí),雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而成為單鏈,用于合成新的互補(bǔ)鏈。子代細(xì)胞出現(xiàn)新的DNA雙鏈,其中一股單鏈?zhǔn)菑挠H代完整地接受過(guò)來(lái)的舊鏈。另一股單鏈完全重新合成的新鏈,且按堿基配對(duì)原則與舊鏈互補(bǔ)。第一節(jié)半保留復(fù)制半保留復(fù)制:當(dāng)細(xì)胞分裂,DNA進(jìn)行復(fù)制時(shí)551、Watson和Crick的半保留復(fù)制模型:
DNA雙螺旋的兩條鏈堿基通過(guò)A-T、G-C之間的氫鍵聯(lián)結(jié),并且兩條鏈互補(bǔ)。因此,Watson和Crick提出DNA的半保留復(fù)制模型:雙螺旋揭開(kāi),每條鏈作為模板,以四種脫氧核苷三磷酸(dNTP)為底物,在依賴于DNA的DNA聚合酶催化下,按照A-T、G-C配對(duì)方式,合成與兩條模板鏈脫氧核苷酸對(duì)應(yīng)的兩條新鏈,然后以一新一舊脫氧多核苷酸組成的雙鏈分別進(jìn)入子細(xì)胞。
1、Watson和Crick的半保留復(fù)制模型:562、模型的試驗(yàn)證明:
1958年Meselson和Stahl用密度梯度離心法結(jié)合同位素標(biāo)記法進(jìn)行證明試驗(yàn):(1)將大腸桿菌在含標(biāo)記的15NH4Cl的培養(yǎng)基內(nèi),繁殖12代,保證DNA上的N都是15N;(2)將上述培養(yǎng)好的細(xì)菌轉(zhuǎn)入到含14NH4Cl的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng),并在細(xì)菌剛轉(zhuǎn)入14NH4Cl中(0代)以及在此培養(yǎng)基中分裂1、2、3、4代時(shí)分別取樣分析;2、模型的試驗(yàn)證明:57生物化學(xué)之DNA的生物合成課件58生物化學(xué)之DNA的生物合成課件59第二節(jié)DNA復(fù)制的酶學(xué)1.底物:dNTP(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)2.聚合酶:DNA聚合酶(DNA依賴的DNA聚合酶)DNA--pol3.模板:?jiǎn)捂湹腄NA母鏈4.引物:寡核苷酸引物(RNA)5.其他酶和蛋白質(zhì)因子:解鏈酶,解旋酶,單鏈結(jié)合蛋白,連接酶第二節(jié)DNA復(fù)制的酶學(xué)1.底物:dNTP(dATP,dG60DNA聚合酶的活性5′至3′的聚合活性5′→3′方向核酸外切酶活性5′→3′外切酶活性3′→5′外切酶活性DNA聚合酶的活性5′至3′的聚合活性61一、聚合酶催化的反應(yīng)5′至3′的聚合活性(5′→3′)一、聚合酶催化的反應(yīng)5′至3′的聚合活性(5′→3′)62
核酸外切酶活性
3′→5′外切酶活性
5′→3′外切酶活性
核酸外切酶活性63聚合反應(yīng)在DNA聚合酶催化下,四種脫氧核糖核苷三磷酸(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)被加到DNA鏈的3’末端,同時(shí)釋放出無(wú)機(jī)焦磷酸。1、DNA鏈的游離3’-羥基對(duì)進(jìn)入的dNTP磷原子發(fā)生親核攻擊,形成3’,5’-磷酸二酯鍵,并脫下焦磷酸2、形成磷酸二酯鍵的能量來(lái)自α-與β-磷酸基之間高能鍵的裂解3、聚合反應(yīng)可逆,但隨焦磷酸的水解可推動(dòng)反應(yīng)的完成4、DNA鏈由5’向3’方向延長(zhǎng)5、需要有游離的3’-羥基,即需要引物鏈聚合反應(yīng)64二、DAN聚合酶結(jié)構(gòu)(一)原核生物:polⅠ:與校讀,修復(fù)有關(guān)A、DNA聚合酶活力:通過(guò)核苷酸聚合反應(yīng)使DNA鏈沿5’→3’方向延長(zhǎng);B、
3’→5’核酸外切酶活力:由3’端水解DNA鏈。在正常情況下該活力受抑制,一旦出現(xiàn)錯(cuò)配堿基時(shí),聚合反應(yīng)停止,該活力會(huì)切去錯(cuò)配堿基,起校對(duì)作用;C、5’→3’核酸外切酶活力:由5’端水解DNA鏈。切除嘧啶二聚體和RNA引物。小片段:5′→3′核酸外切酶活性大片段(Klenow片段):聚合活性、3′→5′外切活性(常用的工具酶)二、DAN聚合酶結(jié)構(gòu)(一)原核生物:65polⅡ:以帶有缺口的雙鏈DNA為模板和引物,從5’→3’方向合成DNA,同時(shí)具有3’→5’外切酶活力??赡茉贒NA的修復(fù)中起作用。
polⅡ:66
polⅢ:真正起復(fù)制作用的酶。由10種亞基組成的不對(duì)稱二聚體,α、ε、θ組成核心酶活性:聚合活性、3′→5′外切活性
α+ε+θ
polⅢ(核心酶)
polⅢ(核心酶)+τ
polⅢ’polⅢ’+γ+δ
polⅢ*(全酶)
α具有聚合酶活力,ε具有校對(duì)功能,θ是組建核心酶因子,τ是二聚化因子,γ和δ是延長(zhǎng)因子,β識(shí)別引物并引導(dǎo)聚合酶結(jié)合,復(fù)制起始時(shí)被釋放。pol只作用于有缺口的雙鏈DNA,pol’可作用于有引物的長(zhǎng)單鏈DNA,pol*是天然的聚合酶polⅢ:67(二)真核生物(DNA-pol):DNA聚合酶α:與隨從鏈的合成有關(guān)。需要以缺口雙鏈或帶引物的單鏈DNA為模板,引物是DNA或RNA短鏈,RNA引物由引物合成酶合成DNA聚合酶β:核酸外切酶活性,與修復(fù)有關(guān)DNA聚合酶γ:存在于線粒體。以RNA為模板,以DNA短鏈為引物DNA聚合酶δ:與領(lǐng)頭鏈的合成有關(guān)。具有3’→5’外切酶活力DNA聚合酶ε:與校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口有關(guān)(二)真核生物(DNA-pol):68核酸外切酶活性和即時(shí)校讀DNA-polⅠ,Ⅱ的3′→5′外切酶活性(主要應(yīng)用在引物切除后的缺口復(fù)制)復(fù)制的保真性和堿基選擇polⅢ
的ε亞基先形成氫鍵,再生成磷酸二酯鍵依賴三種機(jī)理1遵守嚴(yán)格的堿基互補(bǔ)配對(duì)規(guī)律2聚合酶在復(fù)制延長(zhǎng)中對(duì)堿基的選擇功能3復(fù)制中出錯(cuò)時(shí)有即時(shí)校讀功能(三)DNA聚合酶的核酸外切酶活性和復(fù)制的保真性核酸外切酶活性和即時(shí)校讀(三)DNA聚合酶的核酸外切酶活性和69
三、復(fù)制中解鏈和DNA分子的拓?fù)鋵W(xué)變化(一)解鏈酶
領(lǐng)頭鏈
DnaB(解旋酶)
隨從鏈
解鏈酶ⅡSSB:?jiǎn)捂溄Y(jié)合蛋白三、復(fù)制中解鏈和DNA分子的拓?fù)鋵W(xué)變化(一)解鏈酶S70(二)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(解旋酶)
既能水解,又能連接磷酸二酯鍵
拓?fù)涿涪瘢呵袛郉NA雙鏈中的一股(原核生物中只能消除負(fù)超螺旋,真核生物中能消除正、負(fù)超螺旋)
拓?fù)涿涪颍呵袛郉NA雙鏈(同上)
(三)單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)維持模板處于單鏈狀態(tài)保護(hù)單鏈的完整(二)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶(解旋酶)71四、引物酶和引發(fā)體引物酶:RNA聚合酶-DnaG引發(fā)體:DnaG和DnaBDnaA辨認(rèn)復(fù)制啟始點(diǎn),然后解鏈酶DnaB在DnaC幫助下結(jié)合解鏈區(qū),并在DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶協(xié)助下沿DNA鏈5’→3’方向解鏈,并由SSB蛋白保護(hù)單鏈。解鏈后,在復(fù)制起點(diǎn)DnaB活化DnaG,促使其合成RNA引物。四、引物酶和引發(fā)體72生物化學(xué)之DNA的生物合成課件73五、DNA連接酶(ligase)催化兩段DNA之間的連接NAD:煙酰胺腺嘌呤二核苷酸;NMN:煙酰胺單核苷酸+AMP但實(shí)際上在切口處5’端的往往是RNA引物切除后留下一個(gè)單磷酸基,不具備羥基親和攻擊的條件,由此:五、DNA連接酶(ligase)催化兩段DNA之間的連接N74DNA連接酶
催化雙鏈DNA切口處的5’-磷酸基和3’-羥基生成磷酸二酯鍵:(1)形成酶-AMP復(fù)合物:
NAD(細(xì)菌)連接酶-AMP+NMN+連接酶→
ATP(動(dòng)物)連接酶-AMP+PPi
(2)形成A-P-P-DNA:連接酶-AMP+5’P-DNA→A-P-P-DNA+連接酶
形成了焦磷酸鍵(3)生成3’,5’-磷酸二酯鍵:
DNA-OH3’+A-P-P-DNA→DNA-O-P-DNA+AMP
相鄰鏈3’-OH對(duì)活化的磷原子發(fā)生親核攻擊
DNA連接酶75第三節(jié)DNA生物合成過(guò)程一復(fù)制的起始
(一)復(fù)制起始點(diǎn)和復(fù)制叉原核生物從一個(gè)固定的起始點(diǎn)開(kāi)始,同時(shí)向兩個(gè)方向進(jìn)行的,稱為雙向復(fù)制真核細(xì)胞染色體比較復(fù)雜,可能有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn),同時(shí)形成多個(gè)復(fù)制單位復(fù)制叉----復(fù)制開(kāi)始后由于DNA雙鏈解開(kāi),在兩股單鏈上進(jìn)行復(fù)制,形成在顯微鏡下可看到的叉狀結(jié)構(gòu),稱為復(fù)制叉E.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriC跨度為245bp,包含有三組串聯(lián)重復(fù)序列和兩對(duì)反向重復(fù)序列第三節(jié)DNA生物合成過(guò)程一復(fù)制的起始真核細(xì)胞染色體76生物化學(xué)之DNA的生物合成課件771、復(fù)制的起點(diǎn):?jiǎn)蝹€(gè)固定的起點(diǎn):原核生物的染色體和質(zhì)粒、真核生物的細(xì)胞器DNA都是環(huán)狀雙鏈分子,具有單個(gè)固定的起點(diǎn);多個(gè)起點(diǎn):真核生物染色體是線性雙鏈分子,含有許多起點(diǎn)多復(fù)制子)。1、復(fù)制的起點(diǎn):782、復(fù)制方向:直線雙向式:?jiǎn)纹瘘c(diǎn),雙方向。有對(duì)稱的和不對(duì)稱多起點(diǎn)雙向式:真核生物染色體DNA的復(fù)制θ型雙、單向式:環(huán)狀DNA的復(fù)制。有雙向和單向(單向的形成一個(gè)復(fù)制叉,雙向的形成兩個(gè)復(fù)制叉),有對(duì)稱和不對(duì)稱(一個(gè)叉完成1/5,其余4/5由另一個(gè)叉完成)D-環(huán)式:?jiǎn)蜗驈?fù)制。在固定點(diǎn)解開(kāi)后一條鏈先復(fù)制,待復(fù)制到一定距離時(shí),露出另一鏈的復(fù)制起點(diǎn),才開(kāi)始另一鏈的復(fù)制2、復(fù)制方向:79滾動(dòng)環(huán)式:?jiǎn)蜗驈?fù)制,低等生物如質(zhì)粒共價(jià)閉環(huán)雙鏈分子的正鏈由核酸內(nèi)切酶在一特定位點(diǎn)切開(kāi),游離出的5’-磷酸基末端固定在細(xì)胞膜上,然后以環(huán)狀負(fù)鏈為模板,從正鏈的3’-OH末端延長(zhǎng)形成正鏈。不需要另外合成引物。滾動(dòng)環(huán)式:?jiǎn)蜗驈?fù)制,低等生物如質(zhì)粒80(二)引發(fā)體的生成復(fù)制過(guò)程需要引物--短鏈RNA引物酶:合成RNA引物(十個(gè)bp左右),方向?yàn)?’到3’DnaA辨認(rèn)復(fù)制啟始點(diǎn),然后引物酶(DnaG蛋白)進(jìn)入,加上DnaB蛋白和DnaC蛋白等,與DNA的起始復(fù)制區(qū)域形成引發(fā)體。DNA聚合酶Ⅲ
由其β亞單位辨認(rèn)引物,新鏈的第一個(gè)脫氧核苷酸與引物的3-OH形成磷酸二酯鍵,開(kāi)始復(fù)制拓?fù)洚悩?gòu)酶松弛螺旋。(二)引發(fā)體的生成81復(fù)制過(guò)程中各酶和蛋白質(zhì)因子的作用復(fù)制過(guò)程中各酶和蛋白質(zhì)因子的作用82二復(fù)制的延長(zhǎng)原核生物為polⅢ真核生物為DNA聚合酶α和δ,其中α與隨從鏈的合成有關(guān),δ與領(lǐng)頭鏈的合成有關(guān)(一)復(fù)制延長(zhǎng)的生化過(guò)程原核生物復(fù)制延長(zhǎng)的速度很快真核生物復(fù)制有多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)(二)復(fù)制的半不連續(xù)性和岡崎片段領(lǐng)頭鏈?zhǔn)沁B續(xù)合成的,而隨從鏈則是不連續(xù)合成岡崎片段:岡崎用電子顯微鏡看到了DNA復(fù)制過(guò)程中出現(xiàn)一些不連續(xù)片段,這些不連續(xù)片段只存在于NA復(fù)制叉上其中的一股。后來(lái)就把這些不連續(xù)的片段稱為岡崎片段二復(fù)制的延長(zhǎng)83三復(fù)制的終止(一)原核生物復(fù)制終止及不連續(xù)片段連接復(fù)制有終止點(diǎn)ter領(lǐng)頭鏈?zhǔn)遣婚g斷延長(zhǎng)的,隨從鏈?zhǔn)巧梢粋€(gè)個(gè)的岡崎片段,最后連接成一條完整的DNA鏈。polⅠ5′→3′外切酶活性水解引物polⅠ聚合活性填補(bǔ)空隙DNA連接酶連接缺口。三復(fù)制的終止(一)原核生物復(fù)制終止及不連續(xù)片段連接84polⅠpolⅠ85(二)真核生物的端粒和端粒酶端粒:是真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)
富含GC的重復(fù)序列人:(TTAGGG)n端粒酶:RNA--蛋白質(zhì)復(fù)合物既有模板,又有逆轉(zhuǎn)錄酶以自身的RNA為模板延長(zhǎng)DNA單鏈,然后反折為雙鏈,爬行模式端粒酶與生物體的衰老、腫瘤的發(fā)生有關(guān)(二)真核生物的端粒和端粒酶86第四節(jié)DNA的損傷修復(fù)突變-----DNA分子上堿基的改變自發(fā)突變、人工誘變一突變的意義突變是進(jìn)化、分化的分子基礎(chǔ)只有基因型改變的突變致死性的突變突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)第四節(jié)DNA的損傷修復(fù)突變-----DNA分子上堿基的改87二、引發(fā)突變的因素
誘變因素及突變類型二、引發(fā)突變的因素誘88三、突變分子改變的類型錯(cuò)配(點(diǎn)突變)一個(gè)堿基改變?nèi)笔?、插入和框移突變片段插入或缺失重排較大片段重組或重排三、突變分子改變的類型89生物化學(xué)之DNA的生物合成課件90四、損傷的修復(fù)損傷--復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的DNA突變光修復(fù)切除修復(fù)重組修復(fù)SOS修復(fù)四、損傷的修復(fù)損傷--復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的DNA突變91(一)光修復(fù)紫外光照射可使相鄰的兩個(gè)T形成二聚體(T^T)
光修復(fù)酶可使二聚體解聚為單體狀態(tài),DNA完全恢復(fù)正常。光修復(fù)酶的激活需300-600μm波長(zhǎng)的光。(一)光修復(fù)92(二)切除修復(fù)參與的酶有核酸內(nèi)切酶,polⅠ,DNA連接酶核酸內(nèi)切酶識(shí)別損傷部位→切開(kāi)核酸單鏈→外切酶切除損傷部位→聚合酶修復(fù)→連接酶連接(二)切除修復(fù)核酸內(nèi)切酶識(shí)別損傷部位→切開(kāi)核酸單鏈→外切酶切93(三)重組修復(fù)重組蛋白R(shí)ecA,polⅠ,連接酶參與。損傷會(huì)保留下去聚合酶在損傷部位跳過(guò)去,在下一個(gè)岡崎片段的起始位置或前導(dǎo)鏈的相應(yīng)位置上重新合成引物和DNA鏈。這樣,新鏈在損傷相對(duì)應(yīng)處留下缺口。然后,完整的母鏈上相對(duì)應(yīng)于損傷部位的正確
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