G6PD缺乏高鐵血紅蛋白法檢查分子生物學(xué)設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)課件

——G6PD缺乏高鐵血紅蛋白法檢查分子生物學(xué)設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)

2010級(jí)臨床八大班第四實(shí)驗(yàn)室組員：主講：患兒，男性，3歲，因面色蒼白伴血尿1天入院。1天前食用新鮮蠶豆后，今日出現(xiàn)惡心、嘔吐、排尿呈醬油樣色，面色蒼白。據(jù)家長(zhǎng)反映，患者的姐姐也曾發(fā)生過類似情況。

體格檢查：體溫38℃，脈搏150次/分，呼吸40次/分，血壓80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色蒼白，皮膚及鞏膜黃染，體型較同齡人瘦小。心、肺未及異常，肝、脾未觸及，雙腎區(qū)無(wú)叩擊痛，神經(jīng)系統(tǒng)檢查未及異常。實(shí)驗(yàn)室檢查：紅細(xì)胞1.98×1012/L，血紅蛋白53g/L，血清總膽紅素85.5μmol/L，結(jié)合膽紅素13.7μmol/L，未結(jié)合膽紅素71.8μmol/L，尿蛋白（++），潛血(+)，尿膽紅素(－)，尿膽素原(+)，尿液鏡下未見紅細(xì)胞。案例：1.根據(jù)上述患兒的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室檢查，初步判斷患兒是何種疾?。啃Q豆病起病急遽，大多在進(jìn)食新鮮蠶豆后1～2天內(nèi)發(fā)生溶血，最短者只有2小時(shí)，最長(zhǎng)者可相隔9天。如因吸入花粉而發(fā)病者，癥狀可在數(shù)分鐘內(nèi)出現(xiàn)。潛伏期的長(zhǎng)短與癥狀的輕重?zé)o關(guān)。本病的貧血程度和癥狀大多很嚴(yán)重。癥狀有全身不適、疲倦乏力、畏寒、發(fā)熱、頭暈、頭痛、厭食、惡心、嘔吐、腹痛等。鞏膜輕度黃染，尿色如濃紅茶或甚至如醬油。一般病例癥狀持續(xù)2～6天。最重者出現(xiàn)面色極度蒼白，全身衰竭，脈搏微弱而速，血壓下降，神志遲鈍或煩躁不安，少尿或閉尿等急性循環(huán)衰竭和急性腎功能衰竭的表現(xiàn)。2.請(qǐng)?jiān)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確診斷要求：實(shí)驗(yàn)名稱，實(shí)驗(yàn)方法，主要試劑和儀器，實(shí)驗(yàn)操作流程及注意事項(xiàng)，結(jié)果如何分析。G6PD缺乏癥的檢查方法：高鐵血紅蛋白還原實(shí)驗(yàn)變性珠蛋白小體生成實(shí)驗(yàn)（可做為G6PD缺乏的篩選實(shí)驗(yàn)）G6PD活性測(cè)定G6PD熒光斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)（特異性較好、方法簡(jiǎn)單）抗壞血酸-氰化物實(shí)驗(yàn)硝基四氮唑藍(lán)定量法G6PD比值法高鐵血紅蛋白還原實(shí)驗(yàn)……高鐵血紅蛋白還原實(shí)驗(yàn)——G6PD缺乏癥檢查實(shí)驗(yàn)名稱：高鐵血紅蛋白還原實(shí)驗(yàn)——G6PD缺乏癥檢查高鐵血紅蛋白還原實(shí)驗(yàn)——G6PD缺乏癥檢查實(shí)驗(yàn)原理：在有足量的還原輔酶Ⅱ（NADPH)存在下，反應(yīng)液中的高鐵血紅蛋白能被高鐵血紅蛋白還原酶即細(xì)胞色素b5（黃素酶）還原成亞鐵血紅蛋白。在體外，這一還原過程還需要遞氫體亞甲藍(lán)的參與。但紅細(xì)胞內(nèi)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）含量正常時(shí)，由磷酸戊糖代謝途徑生成NADPH的數(shù)量足以完成上述還原反應(yīng)。當(dāng)紅細(xì)胞內(nèi)G6PD含量不足或缺乏時(shí)，高鐵血紅蛋白還原速度減慢，甚至不能還原。高鐵血紅蛋白呈褐色，在波長(zhǎng)635nm處有吸收峰，可用分光光度計(jì)加以測(cè)定。高鐵血紅蛋白還原實(shí)驗(yàn)——G6PD缺乏癥檢查操作：1.在試管中加入葡萄糖20mg，109mmol/L枸櫞酸鈉溶液0.2ml,靜脈血1.8ml,混勻。2.離心15min，取出，調(diào)整血細(xì)胞與血漿的比例為1：1后混勻。3.取上述抗凝血1ml,加亞硝酸鈉葡萄糖混合溶液和亞甲藍(lán)溶液各0.05ml，顛倒混合15次，使與氧氣充分接觸，加塞后放37℃水浴或孵箱中3h。高鐵血紅蛋白還原實(shí)驗(yàn)——G6PD缺乏癥檢查計(jì)算：高鐵血紅蛋白還原率（%）=[1–(SA-B)/(ST-B)]×100%式中：SA-B、ST-B分別為還原后和還原前高鐵血紅蛋白的吸光度；SA-B/ST-B為還原后剩余高鐵血紅蛋白的比值。高鐵血紅蛋白還原實(shí)驗(yàn)——G6PD缺乏癥檢查結(jié)果分析：高鐵血紅蛋白還原實(shí)驗(yàn)（MHb）正常人還原率>75%(比色法）蠶豆病患者M(jìn)Hb還原率31%~74%（雜合子遺傳者）還原率<30%（純合子型）患者如存在高鐵血紅蛋白（HbH）、不穩(wěn)定血紅蛋白、高脂血癥、巨球蛋白血癥等均可造成假陽(yáng)性。NADPH-MHb還原酶缺乏（罕見）也可出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果3.從生化代謝解釋患兒的臨床表現(xiàn)和實(shí)驗(yàn)檢查結(jié)果。紅細(xì)胞和血紅蛋白含量減少原因：G6PD缺陷不能通過磷酸戊糖途徑提供足夠的NADPH以維持還原型谷胱甘肽紅細(xì)胞脆性增加，易于破裂紅細(xì)胞在遇到蠶豆中的某些強(qiáng)氧化劑時(shí)，細(xì)胞膜破壞紅細(xì)胞減少實(shí)驗(yàn)檢查結(jié)果：大量血紅蛋白釋放

形成原尿后，超過腎小管和集合管的重吸收作用尿蛋白量增加形成醬油樣尿膽紅素增加紅細(xì)胞減少實(shí)驗(yàn)檢查結(jié)果：?jiǎn)魏送淌上到y(tǒng)紅細(xì)胞大量破壞單核吞噬細(xì)胞系統(tǒng)產(chǎn)生膽紅素增加超過肝攝取、轉(zhuǎn)化和排泄的能力未結(jié)合膽紅素濃度增加（血漿膽紅素、未結(jié)合膽紅素含量增高、結(jié)合膽紅素濃度改變不大）當(dāng)超過34.2mmol/L時(shí)出現(xiàn)顯性黃疸肝對(duì)膽紅素的攝取、轉(zhuǎn)化和排泄增多進(jìn)入膽道系統(tǒng)腸肝循環(huán)尿膽原和尿膽素增多實(shí)驗(yàn)檢查結(jié)果：實(shí)驗(yàn)檢查結(jié)果：潛血：潛在的出血，也就是由肉眼下或是顯微鏡下無(wú)法觀察到有紅血球的存在，但如果用試紙檢驗(yàn)時(shí)卻有反應(yīng)，當(dāng)紅血球被破壞時(shí)，其內(nèi)含的血紅素會(huì)釋放出來(lái)，所以，尿液試棒才能偵測(cè)到血紅素的反應(yīng)。尿液下沒有見紅細(xì)胞可能是因?yàn)榧t細(xì)胞本身的壽命已到，也可能是喝了大量水，尿液稀薄紅血球破裂。4.要想探討該病發(fā)生的分子基礎(chǔ)，可以用哪些技術(shù)檢測(cè)什么目的基因？可使用技術(shù)：擴(kuò)增G6PD基因第10、11、12、13外顯子639bpDNA片段結(jié)合寡核苷酸探針斑點(diǎn)雜交技術(shù)PCR/SSCP片段結(jié)合寡核苷酸探針斑點(diǎn)雜交技術(shù)PCR/SSCP分析法DNA序列分析探針技術(shù)G6PD基因定位于X染色體長(zhǎng)臂2區(qū)8帶ⅶ因子及18Kb，中國(guó)人紅-綠色盲基因之間（Xq28）,長(zhǎng)18Kb，中國(guó)人G6PD基因綠色盲基因之間（Xq28）Xq28目前依法顯得突變種類很多，但能引起題目中所訴臨床癥狀G1376Ｔ和G6PD的突變點(diǎn)可能是G1376Ｔ和G1388A點(diǎn)突變G6PD基因含（13