生化分析實驗-圓盤電泳

實驗六聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳分離蛋白質(zhì)生化分析實驗-圓盤電泳共25頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁!簡述聚丙烯酰胺凝膠聚合的原理，如何調(diào)節(jié)凝膠的孔徑?2.為什么樣品會在濃縮膠中被壓縮成層？3.為什么在樣品中加含有少許溴酚藍的40％蔗糖溶液？蔗糖及溴酚藍各有何用途？4.上下兩槽電泳緩沖液電泳后，能否混合存放？為什么？5.根據(jù)實驗過程的體會，總結(jié)如何做好聚丙烯酰胺垂直板電泳？哪些是關(guān)鍵步驟？6.如何除去凝膠中過量的AP？未反應(yīng)的單體如何除去？

生化分析實驗-圓盤電泳共25頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁!一、目的要求1.學(xué)習(xí)聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳原理和技術(shù)2.學(xué)習(xí)和掌握圓盤電泳分離蛋白質(zhì)技術(shù)生化分析實驗-圓盤電泳共25頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁!二、原理

聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳和垂直平板電泳具有相同的原理。不連續(xù)：凝膠孔徑不連續(xù)性；緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性；電位梯度的不連續(xù)性：三種效應(yīng)：樣品濃縮效應(yīng)；分子篩效應(yīng)；電荷效應(yīng)生化分析實驗-圓盤電泳共25頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁!垂直平板：

1、多個樣品在同一塊凝膠上，電泳條件一致－－便于利用各種鑒定

方法，直接比較各種樣品區(qū)帶，保證結(jié)果的準(zhǔn)確可靠

2、可以進行雙向電泳

3、電泳時熱量容易消散，凝膠結(jié)果便于照相和易于制成干膠

圓盤電泳：

1、缺點是由于聚合效應(yīng)，凝膠的長度和直徑有細(xì)微差別，即使同一

樣品在兩個凝膠柱上以同樣的條件電泳，其結(jié)果也會不同

2、但是研究工作中還會用到圓盤電泳，例如測定放射性標(biāo)記的樣品

測定蛋白質(zhì)的生物活性；測定蛋白質(zhì)分離的最適pH，凝膠濃度；

雙向電泳中相的分離。

生化分析實驗-圓盤電泳共25頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁!三、試劑的配制：1、電極Buffer的配制：每排派一個同學(xué)配一份2、樣品溶液，染色液都已由實驗室的老師配好了。3、脫色液可在電泳的時候配制生化分析實驗-圓盤電泳共25頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁!（2）、濃縮膠[2.5%]貯液的配制：E：稱取Tris.0.958g；加1.0mol/LHCL4.8ml；TEMED200μl；最后加蒸餾水至10.0ml；pH6.9即可。

(TEMED最后在濃縮膠的混合液中加20μl）

F：分別稱取Acr1.0g；Bis0.25g；加蒸餾水至10.0ml溶解、混勻即可。G：稱取蔗糖4.0g；加蒸餾水至10.0ml溶解、混勻即可。H：稱取過硫酸銨(AP)0.028g；加蒸餾水至10.0ml溶解、混勻即可。分別取：E：F：G：H=0.5ml：1.0ml：0.5ml：2.0ml（4.0ml）生化分析實驗-圓盤電泳共25頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁!2、濃縮膠的制備：（1）、輕輕倒掉分離膠玻管上端的液體，并用吸水紙吸去未倒凈的液體（但不能觸及膠面）然后先小心用濃縮膠貯液洗滌凝膠表面1-2次，再小心加入該濃縮膠貯液1.5cm高。（2）、隨后同樣加1.0cm高的蒸餾水層覆蓋膠表面。大約也在20-40分鐘后，待濃縮膠出現(xiàn)乳白色時，表明膠已聚合完畢。生化分析實驗-圓盤電泳共25頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁!4、裝置凝膠管：將加好樣品的凝膠管的加樣端（上端），插入上電泳槽孔中，然后將已插滿凝膠管的上電泳槽放入加有電極溶液的下電泳槽內(nèi)。此時凝膠玻管下端管口易產(chǎn)生氣泡，可通過輕輕擺動凝膠玻管以去除氣泡，插入上電泳槽的玻管上端，用滴管輕輕滴滿電極溶液，以免產(chǎn)生氣泡，最后將上電泳槽裝滿電極液。生化分析實驗-圓盤電泳共25頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁!6、練習(xí)取出玻管內(nèi)的凝膠：將一支帶有長針頭的注射器吸有適量水（蒸餾水或自來水），把針頭慢慢插入玻管內(nèi)壁和凝膠柱表面之間，一邊開始壓水，一邊同時使針頭慢慢貼緊管壁呈螺旋式前進，如果一端不行，再在管的另一端按同樣的方法剝離，這樣依靠水流的壓力和滑潤力，使玻管內(nèi)壁與凝膠分離，最后用洗耳球在管的一端輕輕擠壓，另一端對著一干凈大小適宜的培養(yǎng)皿內(nèi)，此時可以將凝膠柱壓出玻管。生化分析實驗-圓盤電泳共25頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁!9、凝膠脫色：在培養(yǎng)皿（或試管）內(nèi)加入適量脫色液于搖床上進行振搖（2小時/次，需3次）脫色多次直至色帶完全清晰為止。生化分析實驗-圓盤電泳共25頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁!注意事項Acr和Bis有神經(jīng)毒性，可經(jīng)皮膚、呼吸道等吸收，故操作時要注意保護。

沒有聚合的丙烯酰胺不要傾倒到水源附近，實驗中全部的膠統(tǒng)一放到指定的容器中，由專門的人收集到一起，統(tǒng)一處理。各種廢液請集中在指定的容器中（組的水池邊的桶）生化分析實驗-圓盤電泳共25頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁!討論題1、在利用預(yù)電泳除去未反應(yīng)完全的單體時，在不連續(xù)電泳體系中，預(yù)電泳只能在分離膠聚合后進行，洗凈膠面后才能制備濃縮膠。濃縮膠制備后，不能進行預(yù)電泳，為什么？生化分析實驗-圓盤電泳共25頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁!討論題3、實驗的上樣量是多少，絕對量是多少？可不可以增加上樣量，或者說我們的合適上樣量是多少？生化分析實驗-圓盤電泳共25頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁!聚丙烯酰胺凝膠垂直平板電泳（左）和圓盤電泳（右）示意圖它們各有什么不同，各自的優(yōu)缺點是什么？

生化分析實驗-圓盤電泳共25頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁!圖1聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳示意圖

(A為正面,B為剖面)

(1)樣品膠pH6.9(2)濃縮膠pH6.9

(3)分離膠pH8.9(4)電極緩沖液pH8.3

生化分析實驗-圓盤電泳共25頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁!四、凝膠的配制：（1）、分離膠[7.5%]貯液的配制：A：稱取Tris.3.7g；加1.0mol/LHCL4.8ml；TEMED100μl；最后加蒸餾水至10ml；pH8.9即可。(TEMED最后在分離膠的混合液中加10μl）

B：分別稱取Acr3.0g；Bis0.08g；加蒸餾水至10.0ml溶解、混勻即可。C：稱取過硫酸銨(AP)0.028g；加蒸餾水至10.0ml溶解、混勻即可。D：蒸餾水分別取：A：B：C：D=1.0ml：2.0ml：4.0ml：1.0ml（8.0ml）生化分析實驗-圓盤電泳共25頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁!五、操作步驟1、分離膠的制備：（1）、將清潔、無破碎干燥的小玻管一端（同學(xué)們應(yīng)該挑選一下比較平的那頭），用膠布貼封后，朝下垂直放入有機玻璃凝膠玻管架的孔中，并在小玻管的7.0cm處作一記號。（2）、用自動取液器吸取上述配好的分離凝膠貯液沿著小玻管內(nèi)壁小心準(zhǔn)確加入7.0cm高。（3）、凝膠溶液加畢后，隨即吸取蒸餾水，加至管中的凝膠表面，使其表面覆蓋一水層（水封，1.0cm高）。在灌膠和封水的過程中，操作要輕，以避免產(chǎn)生氣泡。（4）、將加注好的凝膠管于室溫下靜置，以進行聚合反應(yīng)，在正常情況下大約30-60分鐘后，待界面出現(xiàn)明顯分層現(xiàn)象時，表明膠已聚合完畢，即可加濃縮膠。生化分析實驗-圓盤電泳共25頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁!3、加樣：取一根上次做好的凝膠小玻管用吸水紙輕輕吸去濃縮膠表面上的水層，然后用微量注射器加10ul測試樣品溶液。生化分析實驗-圓盤電泳共25頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁!5、接通電源：接通電泳槽的兩端電極與電泳儀的電源，上槽電極接負(fù)極，下槽電極接正極，穩(wěn)壓300V電泳開始時，電流應(yīng)由小逐步加大至額定值。這時的電流大約每管3.0-5.0mA電流，直至指示劑前沿到達凝膠管底部約0.5cm處，（大約需時2小時），停止電泳。確定電泳結(jié)束時，不應(yīng)將溴酚蘭跑出凝膠管，以防止標(biāo)準(zhǔn)分子量中的最低分子量蛋白質(zhì)也跑出凝膠管。生化分析實驗-圓盤電泳共25頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁!7、取出玻管內(nèi)的凝膠：8、凝膠染色：

將取出的凝膠柱，放入一合適干凈的培養(yǎng)皿內(nèi)，然后加入適量染色液，于搖床上進行振搖染色30分鐘，完畢，回收染色液，用清水洗凝膠柱2-3遍。在染色的同時，凝膠中蛋白質(zhì)區(qū)帶亦被固定。生化分析實驗-圓盤電泳共25頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁!10、繪圖：最后根據(jù)染色所出現(xiàn)的帶數(shù)和位置進行繪圖，以確定被分析樣品的組分。另一種方法是通過密度掃描儀掃出各組分的峰形位置，這樣不僅能確定組分，而且能比較出各組分所占比例（如果要計算出各分離區(qū)帶的相對遷移率，可參考教課書）。生化分析實驗-圓盤電泳共25頁，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁!友情提示:

分離膠:7.0CM濃縮膠:1.5CM上樣量:10ul穩(wěn)壓:300V電泳時間:1:30小時染色時間:30分鐘大家在等凝膠聚合的時