枸杞多糖檢測(cè)方法研究

枸杞多糖檢測(cè)方法研究姓名：王暢2010-8-5枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第1頁(yè)!內(nèi)容提要簡(jiǎn)介選題背景研究目的和意義研究動(dòng)態(tài)與趨勢(shì) 擬采取的研究方法枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第2頁(yè)!枸杞多糖簡(jiǎn)介來(lái)源：茄科植物枸杞的干燥果實(shí)枸杞多糖（Lyciumbarbarumpolysaccharide）簡(jiǎn)稱LBP，是以阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖與半乳糖醛酸組成的酸性雜多糖同多肽或蛋白質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合多糖為主,還含有中性雜多糖和葡聚糖同多肽或蛋白質(zhì)構(gòu)成的復(fù)合多糖，是天然的大分子物質(zhì)。枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第3頁(yè)!ClicktoaddtextClicktoaddtextClicktoaddtextClicktoaddtextClicktoaddtextClicktoaddtextClicktoaddtext白色略帶棕色絮狀，纖維狀無(wú)味吸濕性理化性質(zhì)（一）性狀枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第4頁(yè)!理化性質(zhì)（三）常見(jiàn)的化學(xué)性質(zhì)測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果結(jié)論硫酸—苯酚反應(yīng)陽(yáng)性含中性糖硫酸—半胱氨酸陽(yáng)性含半乳糖醛酸卡瑪斯亮藍(lán)反應(yīng)陽(yáng)性含有蛋白質(zhì)斐林試劑反應(yīng)陰性不含還原糖碘—碘化鉀反應(yīng)陰性不含有淀粉枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第5頁(yè)!保健食品的區(qū)分代保健食品：以民間的處方，秘方為基礎(chǔ)，根據(jù)原材料的功能推斷保健品的功能，未經(jīng)嚴(yán)格的科學(xué)檢測(cè)的保健食品第二代保健食品：經(jīng)過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體實(shí)驗(yàn)證明產(chǎn)品具有某項(xiàng)生理調(diào)節(jié)功能，其安全性，功能性都較為可靠第三代保健食品：經(jīng)過(guò)進(jìn)一步的嚴(yán)格實(shí)驗(yàn)及審核，除具備第二代產(chǎn)品的要求外，還要明確功能能因子及其結(jié)構(gòu)，含量，作用機(jī)理，類似于藥品的要求枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第6頁(yè)!蒽酮-硫酸法多糖在濃硫酸作用下先水解成單糖,并迅速脫水生成糠醛或羥甲基糠醛,而生成的糠醛或羥甲基糠醛與蒽酮脫水縮合,形成糠醛的衍生物,反應(yīng)后溶液呈藍(lán)綠色在620nm處有最大吸收，在10~100ug范圍內(nèi)其顏色的深淺與可溶性糖質(zhì)量濃度成正比其主要反應(yīng)式為枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第7頁(yè)!分子量測(cè)定高分子物質(zhì)的分子量測(cè)定有滲透壓法、蒸氣壓法,凝膠色譜法、超速離心法等，但已有的報(bào)導(dǎo)大多集中在有機(jī)溶劑體系的高分子聚合物如各種塑料產(chǎn)品、人工橡膠等，水體系大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多糖的分子量測(cè)定很少報(bào)導(dǎo)單糖組成測(cè)定方法主要有TLC、GC、HPLC、CE等,但是關(guān)于枸杞多糖柱前衍生化高效液相色譜法測(cè)單糖組成還未見(jiàn)報(bào)道。枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第8頁(yè)!在多糖的分子量測(cè)定方法、尤其是枸杞多糖的測(cè)定方法尚未確立標(biāo)準(zhǔn)，無(wú)據(jù)可依的情況下，繼承傳統(tǒng)保健理論的同時(shí)結(jié)合現(xiàn)代科學(xué)檢測(cè)技術(shù)，找出枸杞多糖的最優(yōu)檢測(cè)方法，制訂枸杞多糖的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，為以后的枸杞多糖檢測(cè)提煉提供依據(jù)。研究意義枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第9頁(yè)!枸杞多糖相對(duì)分子量的檢測(cè)方法蒸汽壓法凝膠過(guò)濾法HPLC滲透壓法光散射法粘度法afebcd枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第10頁(yè)!相對(duì)分子量LBP-Ⅰ，LBP-Ⅱ，LBP-Ⅲ，LBPⅣ相對(duì)分子量均大于200001LBPA3,LBPB1,LBPC2，LBPC4分子量分別為66000，18000，12000，100002Duan分離得到了4個(gè)均一枸杞多糖,其分子量在82～115kDa之間3黃等分離得到三類LbGP，其分子量分別為925000，2148000，2370004王建華通過(guò)SDS-不連續(xù)體系凝膠電泳法測(cè)得LBP2a分子量為774825枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第11頁(yè)!組成成分單糖：阿拉伯糖，鼠李糖，木糖，甘露糖，半乳糖，葡萄糖半乳糖醛酸---硫酸-半胱氨酸反應(yīng)定性蛋白質(zhì)---斐林-酚法枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第12頁(yè)!紅外光譜法方法：KBr壓片法波長(zhǎng)范圍：4000~650cm-1目的：主要是確定吡喃糖的苷鍵構(gòu)型及常規(guī)觀察其他官能團(tuán)。枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第13頁(yè)!紫外檢測(cè)在200nm處有多糖的特征吸收峰在260nm處沒(méi)有吸收峰，說(shuō)明不含核酸在280nm處吸收峰不明顯，說(shuō)明蛋白質(zhì)含量低枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第14頁(yè)!擬采取的研究方法及可行性分析(1)通過(guò)HPLC法測(cè)定枸杞多糖的分子量

可行性分析：嚴(yán)邦干曾采用此法測(cè)定香菇多糖的分子量，該方法較其他多糖測(cè)定法具有迅速，簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確的特點(diǎn)，是目前較為行之有效的測(cè)定方法.

(2)通過(guò)柱前衍生化高效液相色譜法測(cè)定枸杞多糖的單糖組成及其摩爾比

可行性分析：采用3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉酮(PMP)在堿性條件下與單糖定量縮合生成單糖PMP衍生物,用常規(guī)的紫外檢測(cè)器和C18烷基鍵合柱,建立適于多糖單糖組成測(cè)定的HPLC新方法,達(dá)到靈敏、快速、準(zhǔn)確、方便和可在線大批量分析的目標(biāo)。枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第15頁(yè)!HPLC檢測(cè)單糖組分和含量直接進(jìn)樣檢測(cè)：柱子：carbohydrate柱氨基鍵合相柱（SpherisorbNH2，HypersilNH2）檢測(cè)器：示差檢測(cè)器缺點(diǎn)：柱子成本高，氨基鍵合柱易與還原糖生成希夫堿，縮短柱子的壽命示差檢測(cè)器靈敏度低，不適用于梯度洗脫枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第16頁(yè)!柱前衍生化1.糖類衍生的試劑：2-氨基苯甲酸、對(duì)甲氧基苯胺、2-氨基吡啶、6-氨基喹啉、對(duì)硝基苯甲酰氯和3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉酮(PMP)2.步驟：a.對(duì)照品各種單糖標(biāo)準(zhǔn)品Ara，Rha，Xyl，Man，Gal，Glc，F(xiàn)uc按等量混合衍生化b.枸杞多糖水解液衍生化枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第17頁(yè)!枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第18頁(yè)!多糖組成分析及計(jì)算方法計(jì)算校正因子fx=（mx/Ax）/(mfuc/Afuc)計(jì)算樣品中各種單糖的比例：m1:m2:m3...mn=A1f1:A2f2:A3f3...AnfnAx,Afuc分別為對(duì)照品單糖x衍生物，內(nèi)標(biāo)衍生物的峰面積;mx,mfuc分別為對(duì)照品單糖x衍生物，內(nèi)標(biāo)衍生物的濃度（mmol/L）枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第19頁(yè)!指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)將不同產(chǎn)地的枸杞多糖按照相同方法制備供試品溶液，分別進(jìn)樣記錄色譜圖。比較各產(chǎn)地的枸杞中提取的枸杞多糖，確定了共有的指紋峰，并通過(guò)對(duì)照品的色譜圖，確定了主要的指紋峰采用由國(guó)家藥典委員會(huì)制定的中藥色譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)計(jì)算軟件分析，將全譜導(dǎo)入后，經(jīng)譜圖處理，以軟件自動(dòng)生成的對(duì)照?qǐng)D譜為參照?qǐng)D譜，多點(diǎn)校正將譜峰進(jìn)行比較，得到的相似度結(jié)果，查看各樣品的相關(guān)性和區(qū)別。枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第20頁(yè)!理化性質(zhì)（二）溶解性

1.溶于水，二甲基亞砜，溶解度隨中性單糖含量的減少而降低

2.不溶于高濃度乙醇，乙醚，丙酮，氯仿，正丁醇等有機(jī)溶劑枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第21頁(yè)!選題背景（一）生理活性：增強(qiáng)免疫、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、降血糖血脂、保肝，可作為第三代功能性食品的功能因子隨著生活水平的提高，由以治病為主向防病為主的觀念轉(zhuǎn)變，為功能食品的開(kāi)發(fā)帶來(lái)了良好機(jī)遇。功效明確的枸杞多糖符合新一代功能食品的要求，枸杞多糖的研究將推動(dòng)枸杞產(chǎn)品向更高層次發(fā)展枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第22頁(yè)!選題背景（二）多糖一般的檢測(cè)方法概括如下:1將無(wú)紫外吸收的多糖與顯色劑顯色，產(chǎn)生紫外吸收，從而用紫外法定量,如硫酸-苯酚法、硫酸-蒽酮法，3、5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定總糖。2直接測(cè)糖法，折光法測(cè)定多糖，主要是水溶性糖。原理是用折射計(jì)測(cè)得的折射指數(shù)值(糖度)代表著溶液中可溶性物質(zhì)的含量高低，若溶液中的溶質(zhì)是糖物質(zhì)或以糖為主的糖物質(zhì),則折射指數(shù)值就反映著糖含量的高低。3多糖檢測(cè)的HPLC法也是基于上面的思路，要么衍生化后使用紫外或熒光檢測(cè)器，要么使用通用型檢測(cè)器，這類檢測(cè)器主要有示差檢測(cè)器。枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第23頁(yè)!選題背景（三）質(zhì)量不易控制枸杞多糖是一個(gè)水溶性的大分子物質(zhì),不能如小分子物質(zhì)那樣,通過(guò)熔點(diǎn)測(cè)定、元素分析,四大光譜等鑒定后,制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

分子量測(cè)定決定了枸杞多糖的生物活性，分子量過(guò)大不易透過(guò)細(xì)胞膜，影響活性，分子量小一般是沒(méi)有活性的，因此分子量數(shù)據(jù)可以作為枸杞多糖質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的重要指標(biāo)。多糖的單糖組成分析是進(jìn)行多糖質(zhì)量控制和獲取多糖基本信息的重要環(huán)節(jié)。單糖組分及其摩爾比可以作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的重要指標(biāo)。枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第24頁(yè)!研究目的

建立一個(gè)枸杞多糖的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)—定量鑒別方法

：(1)通過(guò)HPLC法測(cè)定枸杞多糖的分子量(2)通過(guò)柱前衍生化高效液相色譜法測(cè)定枸杞多糖的單糖組成及其摩爾比枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第25頁(yè)!研究動(dòng)態(tài)常見(jiàn)的檢測(cè)方法化學(xué)方法物理方法苯酚-硫酸法，高碘酸氧化，Smith降解，甲基化分析比旋光儀、紫外分光光度計(jì)、紅外光譜儀、液相色譜儀、氣相色譜儀、質(zhì)譜、核磁共振從所得到的數(shù)據(jù)來(lái)看，國(guó)內(nèi)對(duì)枸杞多糖的分離純化，含量測(cè)定分離提取、分級(jí)純化組分鑒定及其分子量、結(jié)構(gòu)、基本性質(zhì)等方面有大量成果報(bào)道,但研究者所得出的枸杞多糖分子量、組成、結(jié)構(gòu)、等研究結(jié)果各不相同枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第26頁(yè)!分子量的測(cè)定方法凝膠過(guò)濾法將已知分子量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行凝膠層系，洗脫收集，用硫酸-蒽酮法檢測(cè)多糖，分別求得相應(yīng)的洗脫體積Ve

用藍(lán)色葡聚糖上柱求得外水體積Vo.以Ve/Vo為縱坐標(biāo)，lgMr為橫坐標(biāo)，得到分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。3.取枸杞多糖進(jìn)行一樣的操作求得Ve/Vo查標(biāo)準(zhǔn)曲線可求得多糖的分子量枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第27頁(yè)!多糖中單糖的組成及其摩爾比的測(cè)定方法對(duì)微量物質(zhì)的檢出體現(xiàn)了高分辨率的特點(diǎn)，但是所測(cè)樣品具有一定的揮發(fā)性，衍生化操作煩雜、費(fèi)時(shí)GC分離速度快，分離效果好，重現(xiàn)性好，不破壞樣品，前處理簡(jiǎn)單HPLC操作方便，靈活但是靈敏度不高，對(duì)含量微小的物質(zhì)不易檢出，且無(wú)法確定單糖摩爾比TLC枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第28頁(yè)!枸杞多糖中單糖的組成及其摩爾比名稱單糖組成摩爾比LBP-6Ara：Rha：Xyl：Man：Gal：Glc4.83:0.17：0.23：019:1:1LBP-ⅠAra：Rha：Xyl：Man：Gal：Glc1:3.15:0.48:0.84:5.17:4.13LBP-ⅡAra：Rha：Xyl：Man：Gal：Glc1:3.57:0.02:0.22:1.53:1.03LBP-ⅢAra：Rha：Xyl：Man：Gal：Glc2.43:4.22:0.95:0.38:0.38:1LBP-ⅣAra：Rha：Xyl：Man：Gal：Glc2.53:3.57:1.33:0.29:1:0.86蛋白多糖GAra：Rha：Xyl：Man：Gal：Glc2.8:0.2:0.08:0.2:2.6:1.0LBP-VAra：Gal：Glc2.5:1.0:10LBNPAra：Xyl：Man：Gal：Glc1.0：10.0：1.0:6.7:4.0LBPC2Xyl：Rha：Man8.8：2.3：1LBPC4Glc枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第29頁(yè)!枸杞多糖常見(jiàn)官能團(tuán)紅外光譜解析枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第30頁(yè)!

發(fā)展趨勢(shì)

1)枸杞多糖結(jié)構(gòu)與活性、功能的關(guān)系方面得到明確，市場(chǎng)上將有更多以枸杞多糖為主要成分的新藥，并且都是采用現(xiàn)代生物技術(shù)，從分子、細(xì)胞、器官等分子生物水平上研究活性因子的結(jié)構(gòu)、含量及其作用機(jī)理，準(zhǔn)確評(píng)價(jià)其功效。2）因?yàn)橛薪y(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，明確的結(jié)構(gòu)證明其新穎性，創(chuàng)新性，實(shí)用性，中國(guó)除了主要圍繞枸杞多糖的提取方法、純化工藝、分離技術(shù)、制備治療脂肪肝胃潰瘍藥物應(yīng)用等專利以外，還將得到更多關(guān)于枸杞多糖的組分結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制、藥理功效等方面的專利。枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第31頁(yè)!HPLC法測(cè)分子量色譜柱：proteinkw-804檢測(cè)器：示差折光檢測(cè)器溫度：室溫流動(dòng)相：醋酸鈉緩沖溶液以不同分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)右旋糖酐分子的分離保留時(shí)間與相應(yīng)的分子質(zhì)量建立分子質(zhì)量對(duì)數(shù)值繪制標(biāo)準(zhǔn)坐標(biāo)曲線，待測(cè)得枸杞多糖經(jīng)分離后得到不同分子質(zhì)量峰的保留時(shí)間值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可計(jì)算枸杞多糖的分子質(zhì)量分布（由分子質(zhì)量計(jì)算輔助軟件自行運(yùn)行）

枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第32頁(yè)!柱前衍生化HPLC測(cè)枸杞多糖中的單糖組成前處理：1.樣品水解：a.硫酸適合于中性糖的水解b.三氟醋酸適用于植物細(xì)胞壁多糖，糖蛋白，糖胺聚糖的水解（1）多糖的水解常用硫酸，其用量不易控制，過(guò)多會(huì)導(dǎo)致多糖樣品的炭化，而產(chǎn)生雜質(zhì)峰，過(guò)少又會(huì)水解不完全。本法采用三氟醋酸可較好的實(shí)現(xiàn)多糖的水解。（2）實(shí)驗(yàn)中要盡量減少樣品的水分含量，以免影響衍生化的結(jié)果，在衍生化時(shí)，適當(dāng)加大無(wú)水醋酸酐的用量也可減小水分的影響。

枸杞多糖檢測(cè)方法研究共37頁(yè)，您現(xiàn)在瀏覽的是第33頁(yè)!柱前衍生化反應(yīng)PMP的優(yōu)點(diǎn)：PM