感受態(tài)細胞和質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化(C)課件

感受態(tài)細胞和質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化*感受態(tài)細胞和質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化*1導(dǎo)入大腸桿菌:

氯化鈣轉(zhuǎn)化法electroporation

電擊法又叫電穿孔法體外包裝感染法重組DNA導(dǎo)入哺乳動物細胞:DNA-磷酸鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法脂質(zhì)體介導(dǎo)法、原生質(zhì)體融合法

酵母菌轉(zhuǎn)化法:

完整細胞轉(zhuǎn)化法原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法電擊法

*導(dǎo)入大腸桿菌: *2大腸桿菌(Escherichiacoli)大腸桿菌(Escherichiacoli)大約含3000kb的環(huán)狀染色體DNA的棒狀細菌。革蘭氏陰性、兼性厭氧。最適生長溫度37℃，PH7.0～7.6(一般7.4)，保存加甘油，培養(yǎng)皿密封。大腸桿菌的生長曲線可分為遲緩期(生長滯后期)、對數(shù)生長期(20~30min)、穩(wěn)定期(飽和期)，約1×109~2×108/mL和衰老期。*大腸桿菌(Escherichiacoli)大腸桿菌(Esc3**4

大腸桿菌的不同菌株的保存期差別較大。有些菌株在液體培養(yǎng)基中，4℃可保存幾個月，而有些菌株在相同條件下只能保存幾天。如在相同條件下，大腸桿菌K12株比大腸桿菌X1776株保存期長。所以菌株首先應(yīng)劃平板分離單個菌落，經(jīng)擴增后再做抗藥性等鑒定，然后應(yīng)用或保存。保存一般用對數(shù)生長后期的細菌。根據(jù)不同需要做短期、中期或長期保存。2.菌株的保存*大腸桿菌的不同菌株的保存期差別較大。有些菌株5①LB瓊脂平板劃線，37℃，倒置平板培養(yǎng)(16-24hr)，形成單一菌落后，用石臘紙(parafilm)將平皿四周封嚴(使平皿隔絕空氣)，倒置放入4℃或-20℃冰箱中，可保存數(shù)周。

E.coli菌株的生存期差別大：有些菌株在液體培養(yǎng)基中，4℃能存活幾個月。有些菌株只能活幾天。②穿刺瓊脂(stabagar)，室溫，避光可保存數(shù)年。③冰凍：單一菌落，液體培養(yǎng)基中擴增后，稀釋后倒入10-50%甘油培養(yǎng)基中，分裝，置-20～

-70℃?？山?jīng)過30次凍融，細菌仍然存活。菌LB中過液培養(yǎng)，加入等體積2×冰凍培養(yǎng)基。液氮速凍后置-70℃，可經(jīng)15次凍融，保存5年以上。具體保存方法：*①LB瓊脂平板劃線，37℃，倒置平板培養(yǎng)(16-24hr6瓊脂穿刺培養(yǎng)基2×冰凍培養(yǎng)基瓊脂（Difco）6gK2HPO4

12.6g細菌胰蛋白胨（Difco）10gN++-檸檬酸0.19gNaCl8gMgSO4＞H2O0.18gHCl20mg(NH4)2SO4

1.8gddH2O至1LKH2PO4

3.6g甘油88gdH2O至1L菌株保存液的配制*瓊脂穿刺培養(yǎng)基2×冰凍培養(yǎng)基瓊脂（Difco）6gK7高壓滅菌 Phagemid -20℃ Enzyme -20℃ Buffers -20℃ Primer -4℃ Thiodeyivatives -20℃ Ribonucleotides -20℃ Helperphage -4℃ 置于—20℃或—80℃，并一個月檢查一次 *高壓滅菌 *8抗生素工作濃度松馳型質(zhì)粒嚴緊型質(zhì)粒

氨芐青霉素(Amp)50mg/mL（水）60ug/mL20ug/mL

氯霉素(Cm)34mg/mL（乙醇）170ug/mL25ug/mL

卡那霉素(Kan)50ug/mL（水）50ug/mL10ug/mL

鏈霉素(Sm)10mg/mL（水）50ug/mL10ug/mL

四環(huán)素(Tc)5mg/mL（乙醇）50ug/mL10ug/mL抗生素的配制*抗生素工作濃度松馳型質(zhì)粒嚴緊型質(zhì)粒氨芐青霉素(Am9大腸桿菌感受態(tài)細胞制備和貯存

在基因工程研究過程中，常常需要將外源DNA與載體DNA連接，重組后，導(dǎo)入大腸桿菌受體細胞中，進行DNA復(fù)制，擴增或表達，噬菌體單鏈或雙鏈DNA導(dǎo)入大腸桿菌宿主菌中復(fù)制擴增。但很久以前人們就試圖將DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌但都沒有成功。因此長期以來人們一直認為大腸桿菌缺乏天然的轉(zhuǎn)化機理。1970年M.Mandela和A.Higa提出，在轉(zhuǎn)化DNA之前，預(yù)先用氯化鈣溶液處理大腸桿菌，能夠人為地誘導(dǎo)這些大腸桿菌細胞呈現(xiàn)感受態(tài)，這種細胞稱為感受態(tài)細胞。從而提高重組DNA轉(zhuǎn)化入大腸桿菌的轉(zhuǎn)化頻率。目前對這種機制尚不清楚。*大腸桿菌感受態(tài)細胞制備和貯存在基因工程研究過10感受態(tài)細胞(Compenentcells)：將質(zhì)粒DNA或重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到宿主菌中之前，必須使細菌呈感受狀，即有能力攝取DNA的狀態(tài)。(主要介紹用氯化鈣溶液處理大腸桿菌制備感受態(tài)細胞的方法)①取出大腸桿菌HB101菌種管劃LB瓊脂平板，-70℃保存，37℃過夜(一般16小時)。②取一個菌落接種于3~5mlLB培養(yǎng)管中，37℃振培養(yǎng)，過夜(8~16小時)。③取出1mL過液菌加入新鮮配制的LB培養(yǎng)液50mL中(2%接種量)。37℃振蕩培養(yǎng)，2~4小時。測定光密度值(約5×107個細胞/mL)，OD550達0.3~0.5。注意：不同的大腸桿菌菌株，每mL培養(yǎng)物中細菌存活數(shù)與光密度值間關(guān)系不同。

HB101，OD600=0.5（約×107個細胞/mL）

X1776，OD600=0.2（約×107個細胞/mL）*感受態(tài)細胞(Compenentcells)：將質(zhì)粒DN11④細菌培養(yǎng)管取出置水浴中，10~15分鐘。⑤細菌移入預(yù)冷的離心管中，4℃4000GSA轉(zhuǎn)頭，轉(zhuǎn)離心5分鐘；棄上清，留沉淀置于冰浴中。⑥加0.1mol/LCaCl2(預(yù)冷)溶液25mL，將沉淀充分懸浮，置冰浴中20~30分鐘。延長CaCl2處理時間，可增加感受態(tài)，所以也可在0℃過夜。⑦4℃，4000~2500rpm轉(zhuǎn)離心5分鐘，棄上清，留沉淀，置冰浴中。⑧用預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2溶液2.5mL，小心輕輕懸浮沉淀，4℃過夜?？芍苯邮褂?。⑨次日加20%(最終濃度)滅菌預(yù)冷甘油。⑩分裝成每Eppendorf管200uL。

新鮮感受態(tài)細胞用于質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化最好。但新鮮感受態(tài)細胞0℃~4℃貯存不超過3天。長期保存，必須將細胞在-70℃干冰或液氮氣體部分速凍5分鐘，再置于-80℃冰箱中保存，一般可保存1年。*④細菌培養(yǎng)管取出置水浴中，10~15分鐘。新12①

CaCl2處理4℃，0.1M低滲CaCl2處理使細菌表面的細胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，即局部失去細胞壁或局部溶解細胞壁，俗稱“打孔”，使DNA分子能夠進入細胞內(nèi)。②

CaCl2處理使感受態(tài)細胞的表面形成一種能接受DNA的酶位點，使DNA分子能進入細胞。在細菌中能發(fā)展為感受態(tài)細胞占極小數(shù)，只有感受態(tài)的細胞才能穩(wěn)定的攝取外來DNA分子。保持感受態(tài)的時間約1~2天，一般出現(xiàn)在生長對數(shù)期的后期。兩種假設(shè)：*①CaCl2處理4℃，0.1M低滲CaCl2處理使細菌135.DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞

抗生素

抽濾除菌并均置

-20℃保存?？股夭荒蜔?，在加入到瓊脂板中時，應(yīng)等瓊脂冷至48~50℃時再加入抗生素

Mg++是四環(huán)素拮抗物，需加MgCl2時改加NaCl(6g/L)

四環(huán)素光敏感應(yīng)避光保存（1）抗性瓊脂板中抗生素的配制*5.DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞抗生素抽濾除菌并均置抗生14①感受態(tài)細胞新鮮配制的或從-80℃凍存取出后置于冰水中融化。②取出分裝到Eppendorf管中，每管100~200uL。③加入需轉(zhuǎn)化的DNA溶液25ul充分混勻(1~5ug/mLDNA)。④冰水中放置30分鐘。⑤37℃或42℃水浴2分鐘。(熱休克)⑥冰浴2min。⑦每管再加入1mLLB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時。⑧取出后稍加離心，去掉部分上清，留500uL或250mL

LB則全部鋪板。（2）轉(zhuǎn)化步驟*①感受態(tài)細胞新鮮配制的或從-80℃凍存取出后置于冰水中融15⑨取100~200uL，置于有選擇性標(biāo)記的瓊脂培養(yǎng)皿上，用無菌玻璃棒涂勻；靜置5~10分鐘。⑩倒置37℃培養(yǎng)12~18小時(一般過夜)；次日，挑選單菌落，擴增，提取DNA酶切，電泳檢測，篩選重組子。

并設(shè)下列對照：A．不加需轉(zhuǎn)化的DNA溶液（用蒸餾水或LB培養(yǎng)基代替）。B．用普通LB瓊脂平板代替有選擇性標(biāo)記的瓊脂平板。

DNA超螺旋轉(zhuǎn)化最好

DNA環(huán)狀次之

DNA線狀有干擾作用

1ugpBR322DNA轉(zhuǎn)化入HB101可得：5×106/2×107轉(zhuǎn)化子。

DNA分子量小比分了量大的轉(zhuǎn)化率高，一般不超過10kb，最高限為15kb。一般1ugDNA可得5×107~1×108個轉(zhuǎn)化菌。*⑨取100~200uL，置于有選擇性標(biāo)記的瓊脂培養(yǎng)皿上，16（3）注意事項①宿主菌取出時應(yīng)注意菌株名及編號。②檢查宿主菌，應(yīng)無質(zhì)粒污染，無抗菌素抗性。③整個操作過程應(yīng)保持無菌狀態(tài)。④LB培養(yǎng)液中不能有抗生素。⑤不同受體菌，培養(yǎng)要求不同。如K802株，OD550=0.5

最好，而X1776株，OD550=0.2~0.3最好。

質(zhì)粒的DNA比較小，有助于其轉(zhuǎn)于宿主細胞中的效率。轉(zhuǎn)化效率與質(zhì)粒大小成反比。而質(zhì)粒大于15kb時，轉(zhuǎn)化率成為限制因素。同時質(zhì)粒大，復(fù)制的拷貝數(shù)低。*（3）注意事項①宿主菌取出時應(yīng)注意菌株名及編號。*17（4）質(zhì)粒的三種構(gòu)型①超螺旋閉合環(huán)狀DNA，cccDNA。②開環(huán)DNA，至少一股DNA上有缺口，一處或多處使DNA鮮旋。③線狀DNA

瓊脂糖(Agrose)電泳可將這三種構(gòu)型的DNA分開，Agrose電泳中cccDNA位置最前。*（4）質(zhì)粒的三種構(gòu)型①超螺旋閉合環(huán)狀DNA，cccDNA18二、閱讀微生物的基因型符號

在描述一個微生物的品系時，最重要的事就是區(qū)分它的基因型和表現(xiàn)型?；蛐驼f明它的遺傳決定子，這是看不見的特性；而表現(xiàn)型反映的是可觀察到的特性。

1．由于一個微生物的基因組中有成百個基因。因此，一般而言，在描述一個品系的基因型時只給出它與野生型有所不同的等位基因，而不必一一描述那些與野生型相同的基因。也就是說，在它們名稱后面所給出的是這些品系的基因組中發(fā)生了突變的基因。如：某菌，trp、his和metA，是表示它的trp、his和metA基因座是突變了的，其他基因組仍然正常。在上下文貫通地具體描述微生物的某個基因(如trp)時，可以用trp+，或者只是簡單地用“+”表示它的野生型品系，而不必在每次提到它時都寫作trp+。有些突變型是缺失突變，就用△表示，如△lon表示lon基因的缺失突變。*二、閱讀微生物的基因型符號在描述一個微生物的192．有些細菌中有附加體或者其他特殊的傳導(dǎo)噬菌體。最常見的是性因子F。細菌中有F因子的描述為F+；沒有的為F-。有些F因子上面帶有細菌的某些基因，這樣的F因子寫作Fˊ，它所帶基因的描述方法同上。例如Flac+，proA+，B+表示F因子上面帶有細菌的lac和proA，B基因。又如，F(xiàn)lacZ，proA+，B+表示F因子上面帶有l(wèi)ac和proA，B基因，但是，其中的Z基因是突變的基因。

3．校正基因(sup)座位的描述常常令人眼花繚亂。因為野生型品系雖然不帶有校正基因，它的基因型卻理所當(dāng)然地應(yīng)當(dāng)寫作sup+，表現(xiàn)型則應(yīng)該寫為Sup-?？墒?，帶有sup基因的突變型品系的基因型必需寫為sup-或者sup，它的表現(xiàn)型是Sup+。也就是說，字面上的概念與實際上的情況正好倒了一個個兒。因此，在閱讀它時要特別小心，以免搞錯。此外，在談到特殊的校正基因時，它的表現(xiàn)型常用數(shù)字來表示，如Sul；但是，它的基因型卻用字母來表示supD。鑒于這種情況，有人建議對校正基因野生型(Su-)的品系干脆不用任何符號，只標(biāo)出突變型品系(Su+)的特殊基因座位符號，如supD和supE等。*2．有些細菌中有附加體或者其他特殊的傳導(dǎo)噬菌體。20JM83，F(xiàn)-，ara，△(lac-proAB)，rpsL，Ф80d，lacZ△M15是這樣一個品系：不帶F因子，ara基因座突變(因此不能代謝阿拉伯糖)，lac操縱子缺失(因此不能利用乳糖)，30S核糖體的S12亞基突變(因此有鏈霉素抗生)，β-D-半乳糖苷酶基因部分缺失(因此在含X-gal的平板中有α-互補作用。如果將克隆的pUC質(zhì)粒的重組DNA轉(zhuǎn)化入這個細菌，就可以通過藍/白菌斑來篩選出轉(zhuǎn)化子)。野生的大腸桿菌具有大約4700kbp的DNA分子，上面有約2800個基因。當(dāng)這些基因中有突然變異發(fā)生時，基因產(chǎn)物隨之變化，并且有可能給大腸桿菌帶來可以觀察到的變化。這種能夠觀察到的特征叫做大腸桿菌的表現(xiàn)型(Phenotype)，而把基因的構(gòu)成叫做大腸桿菌的基因型(Genotype)。試舉一例來說明上述概念：*JM83，F(xiàn)-，ara，△(lac-proAB21

通常情況下，基因工程中使用的大腸桿菌的基因型只有在基因發(fā)生變異，表現(xiàn)型發(fā)生變化時才被表示。但是需要特別的表示時，則在野生的基因型上加“+”，在變異的基因型上加“-”以示區(qū)別。表示方法是用基因產(chǎn)物或其作用的名稱的三個斜體字素表示(如DNAAedninemethylase-dam)。如果不同的基因變導(dǎo)致相同的作用結(jié)果，則加上一個大寫字母(如Recombination-recA、recB、recC)。某個基因或者是某領(lǐng)域缺失時，在基因型前向加上“△”表示，如“從lac到proAB基因缺失時表示為△(lac-proAB)。野生的大腸桿菌本來還有具有F因子等的質(zhì)粒DNA，并且感染噬菌體。把被野生的大腸桿菌感染的噬菌體特稱為原噬菌體(Prophage)，例如e14。一般當(dāng)這些質(zhì)?；蛟删w缺失或變異時也用“()”或“/”等加以區(qū)別表示。*通常情況下，基因工程中使用的大腸桿菌的基因型22表現(xiàn)型是用羅馬字母體表示(第一個字母大寫)。一般通過變異而獲得了能夠觀察到的抗藥性或者活性表達等特征時，用“+”表示(Steptomycin抗性：Str+)；相反地當(dāng)成為藥物敏感性或者活性喪失時，用“-”表示(Ampicillin敏感性：Amp-)?；蛐捅憩F(xiàn)容易混淆，使用時注意。*基因工程中經(jīng)常使用的大腸桿菌幾乎都來自于K-12菌株，最近也常使用由B株及C株來源的大腸桿菌。*大腸桿菌B株原來就為lon-，另外MV1184株不具有琥柏抑制基因(Ambersuppressorfree)，由于這些都是原始菌株所不具備的基因，因此不在基因型中加以表示，要注意。*表現(xiàn)型是用羅馬字母體表示(第一個字母大寫)。一般通過變異23supE(suppressor)抑制基因

supE變異時，即使存在終止密碼UAG，此處也會插入谷氨酰胺(Glutamine)，從而可使蛋白質(zhì)繼續(xù)合成。

supF(suppressor)抑制基因

supF變異時，即使存在終止密碼子UAG，此處也會插入酪氨酸(Tyrosine)，從而可使蛋白質(zhì)繼續(xù)合成。停止密碼回復(fù)*supE(suppressor)抑制基因停止密碼回復(fù)24recA(recombination)重組相同的DNA重組活性缺失由于導(dǎo)入DNA與宿主DNA的重組受到阻害，可以保持插入DNA的穩(wěn)定性。與recA13宿主菌相比，recA1宿主菌能夠使插入DNA穩(wěn)定存在。

recB，C(recombination)重組內(nèi)切核酸酶V變異。抑制重組并能影響放射線損傷的修復(fù)。

traD(transmissibility)遺傳穩(wěn)定性在質(zhì)粒F因子內(nèi)部，與大腸桿菌的結(jié)合有關(guān)。

TraD變異后，F(xiàn)因子自身的傳遞能力顯著下降。重組機能缺失*recA(recombination)重組重組機能缺25dam(DNAadeninemethylase)DNA腺嘌呤甲基化酶宿主菌來源的腺嘌呤甲化酶(GmATC)缺失

dcm(DNAcytsinemethylase)DNA胞嘧啶甲基化酶宿主菌來源的胞嘧啶甲基化酶（CmCWGG）缺失

hsdR(hostspecificitydefective)宿主特異性缺陷宿主菌來源的I型限制酶Ecok(或EcoB)的切斷部位蛋白變異轉(zhuǎn)化的外源DNA不被限制酶EcoK切斷，可以進行克隆

hsdM(hostspecificitydefective)

宿主菌來源的I型限制酶EcoK(或EcoB)的甲基化酶部位蛋白變異

hsdS（hostspecificitydefective）宿主菌來源的I型限制酶EcoK(或EcoB)的識別部位蛋白變變異轉(zhuǎn)化的外源DNA不被限制酶EocK切斷，可以進行克隆對插入DNA具有直接作用因子的缺失*dam(DNAadeninemethylase)26

endA(endonuclease)內(nèi)切核酸酶宿主菌來源的非特異性內(nèi)切核酸酶I活性缺失，可以提高純化的質(zhì)粒DNA的質(zhì)量。

NcrA(methylcytsinerestriction)mCG序列的甲基化活性缺失。

mcrB，C(methylcytsinerestriction)GmC序列的甲基化活性缺失。

mrr(methylationrequiringrestricion)mA以及mC序列的甲基化活性缺失。*endA(endonuclease)內(nèi)切核酸酶*27

rpsL(ribosomalproteinsmallsubunit)

由30S核糖體蛋白變異而獲得鏈霉素(Steptomycine)抗性(Strr)。

gyrA(gyrase)

由DNA回旋酶亞基A的變異而獲得的萘啶酮酸(Nalidxicacid)抗性(Nalr)。

Tn5(transposon)

轉(zhuǎn)座子變異，獲得卡那霉素(Kanamycine)抗性(Kmr)。

Tn10(transposon)

轉(zhuǎn)座子變異，獲得四環(huán)素（Tetracycline）抗性（Tetr）?？顾幮缘淖儺?rpsL(ribosomalproteinsmal28lon(longform)

分解異型蛋白質(zhì)的ATP依賴型蛋白分解酶活性缺失。大腸桿菌B株原來就為lon-?？梢种破浔磉_的融合蛋白質(zhì)的分解。

omp(outermembraneprotein)外膜蛋白膜結(jié)合性蛋白分解酶活性缺失。抑制表達的融合蛋白質(zhì)的分解。宿主蛋白酶缺失*lon(longform)宿主蛋白酶缺失*29lacIq(lactose)

乳糖操縱子中控制β-半乳糖苷酶表達的調(diào)節(jié)蛋白基因。由于lacIq變異，表達調(diào)節(jié)蛋白過量形成，因此從乳糖啟動子開始的轉(zhuǎn)錄過程完全受到抑制。

lacZ(lactose)β-半乳糖苷酶活性缺失

lacZ△M15β-半乳糖苷酶蛋白的w-fragment得到表達。當(dāng)與多數(shù)載體質(zhì)粒中所具有的α-fragment共同存在時，可使β-半乳糖苷酶的活性回復(fù)(α-互補性)。在含有X-gal的平板培養(yǎng)基上，可以通過藍白菌的差別選擇重組體。

deoRdeoR變異，可以選擇性地改善大分子DNA的轉(zhuǎn)化。有利于選擇轉(zhuǎn)化體的基因*lacIq(lactose)有利于選擇轉(zhuǎn)化體的基因*30

dut(dUTPase)dUTP酶

dUTP分解酶活性缺失，當(dāng)dUTP分解酶存在時，dUTP不能摻入到DNA鏈中。

ung(Urasil-N-glycosylase)尿嘧淀-N-糖苷酶尿嘧啶-N-糖苷酶活性缺失。當(dāng)具有這種基因時，可以特異性地分解DNA含U的那條鏈。

mutS(mutator)突變子未被甲基化的新合成DNA鏈的錯配序列修復(fù)受到阻礙。有利于點突變的基因*dut(dUTPase)dUTP酶有利于點突變的基因31

leuB(leucine)亮氨酸在最小培養(yǎng)基中必須添加亮氨酸(Leu)proAB(proline)脯氨酸脯氨酸代謝基因變異。在最小培養(yǎng)基中只有添加脯氨酸才能生長。用于確認JM109等大腸桿菌菌株的F因子是否脫落。

Thi-1(thiamine)硫胺素

硫胺素代謝基因變異，在最小培養(yǎng)基中必須添加硫胺素。菌株篩選用基因*leuB(leucine)亮氨酸菌株篩選用基因*32

LacZ、lac5、

trpE、bio、bio256從大腸桿菌lac、trp和bio區(qū)置換而來

imm80、QSR80從φ80噬體置換而來

imm434從φ434噬菌體置換而來

imm21從φ21噬菌體置而來

int29從φ29噬菌體置換而來

b2、b1007、b527、b189B域的缺失突變，使att位點受破壞并因而阻止溶源化

KH52φ80噬菌體DNA的缺失突變

KH53類似于λ噬菌體cI區(qū)域的φ80噬菌體區(qū)域的缺失突變，可有效地防止溶源化

KH54Rex－cI區(qū)域的缺失突變，可有效地防止溶源化

nin5轉(zhuǎn)錄終止位點tR2的缺失突變，可使延遲早期轉(zhuǎn)錄不依賴于N基因產(chǎn)物，并且也刪除了ral基因附近的BamHI位點

ninL44轉(zhuǎn)錄終止位點tR2的缺失突變，可使延遲早期轉(zhuǎn)錄不依賴于N基因產(chǎn)物，并且也刪除了ral基因附近的BamHI位點。

WL113從33240位的SalI到34500位的BamHI之間的1，3kb缺失突變，不損傷gam基因，但kil，cⅢ、ssb和ral基因被刪除。

sslIλ1-2從第一到第二個SalI之間的0.5kb缺失突變，gam基因和部分bet基因被刪除。*LacZ、lac5、從大腸桿菌lac、trp和bio區(qū)置換33續(xù)上表shndⅢλ2-3λ噬菌體第二與第三個HindⅢ之間的2.3kb缺失突變，部分b區(qū)被刪除sxIλ1oXbaI酶切后經(jīng)外切核酸酶消化而造成的0.5kb缺失突變

鼠填充片段大腸桿菌填充片段

lac操縱基因+

腺病毒DNA在重組體中將被置換的載體DNA片段BluescriptM13-重組入λZAP載體的噬菌粒，當(dāng)用M13輔助噬菌體感染后，噬菌粒部分可在體內(nèi)被切下。lacY、lacZ、lacPO

、lacIq、ampr插入ΛOPF8的lac和氨芐青霉素抗生基因Aam、Bam、Eam、

Wam、gamam可被supE和（或）supF抑制的琥珀突變。intamInt基因內(nèi)的BamHI位點被消除后形成的琥珀突變。Sam7、Sam100參與溶解細菌細胞膜的一個基因內(nèi)的琥珀突變。該突變可被supF抑制，但不被supE抑制，失卻野生型S基因產(chǎn)物后，引起感染性噬菌體顆粒在細胞內(nèi)發(fā)生積累。cIts857使cI基因產(chǎn)物對熱不穩(wěn)定的溫度敏感突變chi促進λ噬菌體定向重組的特定八核苷酸序列g(shù)amGam基因編碼大腸桿菌recBC外切核酸酶的抑制物，因此可使Q型DNA復(fù)制有效地轉(zhuǎn)向滾環(huán)復(fù)制。Gam基因產(chǎn)物對于λ噬菌體有recA-菌株（Fec表型）和P2噬菌體溶源的recA+菌株（Spi表型）內(nèi)的生長非常重要。exobet(red)Exo和bet是位于λ噬菌體red區(qū)域的兩個基因（red表示兩個基因或任一個基因）。這兩處基因產(chǎn)物參與當(dāng)從Q型DNA復(fù)制向滾環(huán)復(fù)制轉(zhuǎn)變時的重組過程。這兩個基因產(chǎn)物對于λ噬菌體在recA-菌株（Fec表型）和P2噬菌體溶源的recA+菌株（Spi表型）內(nèi)的生長非常重要。*續(xù)上表shndⅢλ2-3λ噬菌體34常用細菌菌株C600F-thi-1thrleuB6lacY1ton21supE44λ-常用于制備裂解物及增殖λgt10的抑制型菌株

該菌株也叫CR34C600:HflA150(Y1073)F-thi-1thrleuB6lacY1tonA21supE44λ-hflA150(chr:Tn10)·hostforrepressingbackgroundplaquesofλgt10whenestablishingcDNAlibrariesDH5F-endA1recA1hsdR17(rk-mk+)λdeoRthi-1supE44λ-gyrA96relA1·hostforpBR322orothernon-Pucvectors·usefulforcDNAcloningDH5αF-φ80dlacZ△M15(lacZYA-argF)U169endA1recA1hsdR17(rk-mk+)deoRthi-1supE44λ-gyrA96relA1·hostforpUCandotherα-complementationvectors;pBR322·usefulforcDNAcloningDH5αFˊFˊ-φ80dlacZ△(lacZYA-argF)U169endA1hsdR17(rk-mk+)deoRthi-1supE44λ-gryA96relA1·HostforgrowthofM13,phagemids,orothermale-specificbacteriophage·providesα-complementationforM13mpvectors*常用細菌菌株F-thi-1thrleuB6lacY135續(xù)上表DH5αFˊIQFˊproAB+lacIqZ△M15zzf::Tn5[Kmr]/φ80dlacZ△M15△(lacZYA-ARGf)U169andA1recA1hsdR17(rk-mk+)deoRthi-1supE44λ-gyrA96relA1·hostofrexpressionfromthelacpromother·hostforgrowthofM13,phagemids,orothermale-specificbacteriophage·providesα-complementationforM13mpvectorsDH5α-MCRF-mcrA△(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80dlacZ△M15△(lacZYA-argF)U169endA1recA1deoRthi-1supE44λ-gyrA96relA1·hostforpUCandotherα-complementationvectors;pBR322·usefulforgeneratinggenomiclibrariescontainingmethylatedcytosineoradenineresiduesDH10BF-mcrA△(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80dlacZ△M15△lacX74endA1recA1deoR△(ara,leu)7697araD139galUgalKnupGrpsLλ-·hostforpUCandotherα-complementationvectors;pBR322·usefulforgeneratinggenomiclibrariescontainingmethylatedcytosineoradenineresidues·usfulforplasmidrescueproceduresDH10BACF-mcrA△(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80dlacZ△M15△lacX74endA1recA1deoR△(ara,leu)7697araD139galUgalKnupGrpsLλ-/bmon14272/Pmon7124·hostforpEASTtBACvectors·usefulforgeneratingrecombinantbacmidDNAforuseinBEVStechnology*續(xù)上表DH5αFˊFˊproAB+l36續(xù)上表DH10B(ZIP)F-mcrA△(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80dlacZ△M15△lacX74endA1recA1deoR△(ara,leu)7697araD139galUgalKnupGrpsLλxisbind-pZIP1(P1ori-kanr-cre)·hostforλZIPLoxvectorstorecoverrecombinantdoble-standedphagemidHP101F-mcrBmrrhsdS20(rB-mB-)recA13LeuB6ara-14proA2lacY1galK2Xyl-5mtl-1rpsL20(Smr)supE44λ-·抗菌株是E.colK-12xE.coliB的雜交菌，通常用作轉(zhuǎn)化的受體菌。它是大規(guī)模培養(yǎng)和純化質(zhì)粒的理想宿主。RR1F-mcrBmrrhsdS20(rB-mB-)leuB6ara-14proA2lacY1galK2xyl-5mtl-1rpsL20(Smr)supE44λ-·由E.Rodriguez構(gòu)建的HB101的

recA+衍生菌株。CDNA經(jīng)同聚接尾與載體構(gòu)成的重組質(zhì)粒，可以高頻率轉(zhuǎn)化該菌。JM83F-φ80dlacZ△M15△(lac-proAB)ararpsL·PUC質(zhì)粒和PBR322宿主菌JM101△(lac-proAB)supEthi/FˊlacIqZ△M15traD36proAB+·M13mp載體宿主菌

JM107(lac-proAB)thigyrA96endA1hsdR17(rK-mK+)relA1supE44λ-/FˊtraD36proAB+lacIqZ△M15·M13mp載體宿主菌

TB1F-ara△(lac-proAB)rpsLφ80dlacZ△M15hsdR17(rK-mK+)·PUC質(zhì)粒的宿主菌*續(xù)上表DH10BF-mcrA△(mr37續(xù)上表JM103△(lacpro)thistrAsupEendAsbcBhsdR-FˊtraD36proABlacIqz△M15一種常用于M13系列噬菌體的增殖與轉(zhuǎn)染，并支持帶有琥珀突變的載體生長的宿主菌株。JM109rk-Rec-supE△(lac-proAB)hsdR17recA1Fˊ[traD36proAB+lacIqlacZ△M15對轉(zhuǎn)染的DNA有修飾作用而無限制作用，它支持帶有琥珀突變的載體生長的重組缺陷的抑制型菌株。K802hsdR+hsdM+gal-met-supE常用于增殖λ噬菌體及其重組體的抑制型菌株TGIrk-rm-supE△(lac-proAB)hsd△5Fˊ[trdD36proAB+lacIqlacZ△M15]是JM101的EcoK-衍生株，對轉(zhuǎn)染的DNA既無修飾作用，也無限制作用，它能支持帶琥珀突變的載體的生長。Y1090hsdR表型rk-Lac-Lon-相關(guān)基因型hsdRSupE△Lac△Lonpmc9用于增殖λgtll和λgt18—23，含高水平的Lac阻抑物，Lon蛋白酶缺陷，可甲基化修飾DNA，但不限制外源DNA，帶有琥珀突變抑制基因。*續(xù)上表JM103△(lacpro)thistrAs38**39**40感受態(tài)細胞和質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化*感受態(tài)細胞和質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化*41導(dǎo)入大腸桿菌:

氯化鈣轉(zhuǎn)化法electroporation

電擊法又叫電穿孔法體外包裝感染法重組DNA導(dǎo)入哺乳動物細胞:DNA-磷酸鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法脂質(zhì)體介導(dǎo)法、原生質(zhì)體融合法

酵母菌轉(zhuǎn)化法:

完整細胞轉(zhuǎn)化法原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法電擊法

*導(dǎo)入大腸桿菌: *42大腸桿菌(Escherichiacoli)大腸桿菌(Escherichiacoli)大約含3000kb的環(huán)狀染色體DNA的棒狀細菌。革蘭氏陰性、兼性厭氧。最適生長溫度37℃，PH7.0～7.6(一般7.4)，保存加甘油，培養(yǎng)皿密封。大腸桿菌的生長曲線可分為遲緩期(生長滯后期)、對數(shù)生長期(20~30min)、穩(wěn)定期(飽和期)，約1×109~2×108/mL和衰老期。*大腸桿菌(Escherichiacoli)大腸桿菌(Esc43**44

大腸桿菌的不同菌株的保存期差別較大。有些菌株在液體培養(yǎng)基中，4℃可保存幾個月，而有些菌株在相同條件下只能保存幾天。如在相同條件下，大腸桿菌K12株比大腸桿菌X1776株保存期長。所以菌株首先應(yīng)劃平板分離單個菌落，經(jīng)擴增后再做抗藥性等鑒定，然后應(yīng)用或保存。保存一般用對數(shù)生長后期的細菌。根據(jù)不同需要做短期、中期或長期保存。2.菌株的保存*大腸桿菌的不同菌株的保存期差別較大。有些菌株45①LB瓊脂平板劃線，37℃，倒置平板培養(yǎng)(16-24hr)，形成單一菌落后，用石臘紙(parafilm)將平皿四周封嚴(使平皿隔絕空氣)，倒置放入4℃或-20℃冰箱中，可保存數(shù)周。

E.coli菌株的生存期差別大：有些菌株在液體培養(yǎng)基中，4℃能存活幾個月。有些菌株只能活幾天。②穿刺瓊脂(stabagar)，室溫，避光可保存數(shù)年。③冰凍：單一菌落，液體培養(yǎng)基中擴增后，稀釋后倒入10-50%甘油培養(yǎng)基中，分裝，置-20～

-70℃?？山?jīng)過30次凍融，細菌仍然存活。菌LB中過液培養(yǎng)，加入等體積2×冰凍培養(yǎng)基。液氮速凍后置-70℃，可經(jīng)15次凍融，保存5年以上。具體保存方法：*①LB瓊脂平板劃線，37℃，倒置平板培養(yǎng)(16-24hr46瓊脂穿刺培養(yǎng)基2×冰凍培養(yǎng)基瓊脂（Difco）6gK2HPO4

12.6g細菌胰蛋白胨（Difco）10gN++-檸檬酸0.19gNaCl8gMgSO4＞H2O0.18gHCl20mg(NH4)2SO4

1.8gddH2O至1LKH2PO4

3.6g甘油88gdH2O至1L菌株保存液的配制*瓊脂穿刺培養(yǎng)基2×冰凍培養(yǎng)基瓊脂（Difco）6gK47高壓滅菌 Phagemid -20℃ Enzyme -20℃ Buffers -20℃ Primer -4℃ Thiodeyivatives -20℃ Ribonucleotides -20℃ Helperphage -4℃ 置于—20℃或—80℃，并一個月檢查一次 *高壓滅菌 *48抗生素工作濃度松馳型質(zhì)粒嚴緊型質(zhì)粒

氨芐青霉素(Amp)50mg/mL（水）60ug/mL20ug/mL

氯霉素(Cm)34mg/mL（乙醇）170ug/mL25ug/mL

卡那霉素(Kan)50ug/mL（水）50ug/mL10ug/mL

鏈霉素(Sm)10mg/mL（水）50ug/mL10ug/mL

四環(huán)素(Tc)5mg/mL（乙醇）50ug/mL10ug/mL抗生素的配制*抗生素工作濃度松馳型質(zhì)粒嚴緊型質(zhì)粒氨芐青霉素(Am49大腸桿菌感受態(tài)細胞制備和貯存

在基因工程研究過程中，常常需要將外源DNA與載體DNA連接，重組后，導(dǎo)入大腸桿菌受體細胞中，進行DNA復(fù)制，擴增或表達，噬菌體單鏈或雙鏈DNA導(dǎo)入大腸桿菌宿主菌中復(fù)制擴增。但很久以前人們就試圖將DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌但都沒有成功。因此長期以來人們一直認為大腸桿菌缺乏天然的轉(zhuǎn)化機理。1970年M.Mandela和A.Higa提出，在轉(zhuǎn)化DNA之前，預(yù)先用氯化鈣溶液處理大腸桿菌，能夠人為地誘導(dǎo)這些大腸桿菌細胞呈現(xiàn)感受態(tài)，這種細胞稱為感受態(tài)細胞。從而提高重組DNA轉(zhuǎn)化入大腸桿菌的轉(zhuǎn)化頻率。目前對這種機制尚不清楚。*大腸桿菌感受態(tài)細胞制備和貯存在基因工程研究過50感受態(tài)細胞(Compenentcells)：將質(zhì)粒DNA或重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化到宿主菌中之前，必須使細菌呈感受狀，即有能力攝取DNA的狀態(tài)。(主要介紹用氯化鈣溶液處理大腸桿菌制備感受態(tài)細胞的方法)①取出大腸桿菌HB101菌種管劃LB瓊脂平板，-70℃保存，37℃過夜(一般16小時)。②取一個菌落接種于3~5mlLB培養(yǎng)管中，37℃振培養(yǎng)，過夜(8~16小時)。③取出1mL過液菌加入新鮮配制的LB培養(yǎng)液50mL中(2%接種量)。37℃振蕩培養(yǎng)，2~4小時。測定光密度值(約5×107個細胞/mL)，OD550達0.3~0.5。注意：不同的大腸桿菌菌株，每mL培養(yǎng)物中細菌存活數(shù)與光密度值間關(guān)系不同。

HB101，OD600=0.5（約×107個細胞/mL）

X1776，OD600=0.2（約×107個細胞/mL）*感受態(tài)細胞(Compenentcells)：將質(zhì)粒DN51④細菌培養(yǎng)管取出置水浴中，10~15分鐘。⑤細菌移入預(yù)冷的離心管中，4℃4000GSA轉(zhuǎn)頭，轉(zhuǎn)離心5分鐘；棄上清，留沉淀置于冰浴中。⑥加0.1mol/LCaCl2(預(yù)冷)溶液25mL，將沉淀充分懸浮，置冰浴中20~30分鐘。延長CaCl2處理時間，可增加感受態(tài)，所以也可在0℃過夜。⑦4℃，4000~2500rpm轉(zhuǎn)離心5分鐘，棄上清，留沉淀，置冰浴中。⑧用預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2溶液2.5mL，小心輕輕懸浮沉淀，4℃過夜?？芍苯邮褂?。⑨次日加20%(最終濃度)滅菌預(yù)冷甘油。⑩分裝成每Eppendorf管200uL。

新鮮感受態(tài)細胞用于質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化最好。但新鮮感受態(tài)細胞0℃~4℃貯存不超過3天。長期保存，必須將細胞在-70℃干冰或液氮氣體部分速凍5分鐘，再置于-80℃冰箱中保存，一般可保存1年。*④細菌培養(yǎng)管取出置水浴中，10~15分鐘。新52①

CaCl2處理4℃，0.1M低滲CaCl2處理使細菌表面的細胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，即局部失去細胞壁或局部溶解細胞壁，俗稱“打孔”，使DNA分子能夠進入細胞內(nèi)。②

CaCl2處理使感受態(tài)細胞的表面形成一種能接受DNA的酶位點，使DNA分子能進入細胞。在細菌中能發(fā)展為感受態(tài)細胞占極小數(shù)，只有感受態(tài)的細胞才能穩(wěn)定的攝取外來DNA分子。保持感受態(tài)的時間約1~2天，一般出現(xiàn)在生長對數(shù)期的后期。兩種假設(shè)：*①CaCl2處理4℃，0.1M低滲CaCl2處理使細菌535.DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞

抗生素

抽濾除菌并均置

-20℃保存?？股夭荒蜔幔诩尤氲江傊逯袝r，應(yīng)等瓊脂冷至48~50℃時再加入抗生素

Mg++是四環(huán)素拮抗物，需加MgCl2時改加NaCl(6g/L)

四環(huán)素光敏感應(yīng)避光保存（1）抗性瓊脂板中抗生素的配制*5.DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞抗生素抽濾除菌并均置抗生54①感受態(tài)細胞新鮮配制的或從-80℃凍存取出后置于冰水中融化。②取出分裝到Eppendorf管中，每管100~200uL。③加入需轉(zhuǎn)化的DNA溶液25ul充分混勻(1~5ug/mLDNA)。④冰水中放置30分鐘。⑤37℃或42℃水浴2分鐘。(熱休克)⑥冰浴2min。⑦每管再加入1mLLB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1小時。⑧取出后稍加離心，去掉部分上清，留500uL或250mL

LB則全部鋪板。（2）轉(zhuǎn)化步驟*①感受態(tài)細胞新鮮配制的或從-80℃凍存取出后置于冰水中融55⑨取100~200uL，置于有選擇性標(biāo)記的瓊脂培養(yǎng)皿上，用無菌玻璃棒涂勻；靜置5~10分鐘。⑩倒置37℃培養(yǎng)12~18小時(一般過夜)；次日，挑選單菌落，擴增，提取DNA酶切，電泳檢測，篩選重組子。

并設(shè)下列對照：A．不加需轉(zhuǎn)化的DNA溶液（用蒸餾水或LB培養(yǎng)基代替）。B．用普通LB瓊脂平板代替有選擇性標(biāo)記的瓊脂平板。

DNA超螺旋轉(zhuǎn)化最好

DNA環(huán)狀次之

DNA線狀有干擾作用

1ugpBR322DNA轉(zhuǎn)化入HB101可得：5×106/2×107轉(zhuǎn)化子。

DNA分子量小比分了量大的轉(zhuǎn)化率高，一般不超過10kb，最高限為15kb。一般1ugDNA可得5×107~1×108個轉(zhuǎn)化菌。*⑨取100~200uL，置于有選擇性標(biāo)記的瓊脂培養(yǎng)皿上，56（3）注意事項①宿主菌取出時應(yīng)注意菌株名及編號。②檢查宿主菌，應(yīng)無質(zhì)粒污染，無抗菌素抗性。③整個操作過程應(yīng)保持無菌狀態(tài)。④LB培養(yǎng)液中不能有抗生素。⑤不同受體菌，培養(yǎng)要求不同。如K802株，OD550=0.5

最好，而X1776株，OD550=0.2~0.3最好。

質(zhì)粒的DNA比較小，有助于其轉(zhuǎn)于宿主細胞中的效率。轉(zhuǎn)化效率與質(zhì)粒大小成反比。而質(zhì)粒大于15kb時，轉(zhuǎn)化率成為限制因素。同時質(zhì)粒大，復(fù)制的拷貝數(shù)低。*（3）注意事項①宿主菌取出時應(yīng)注意菌株名及編號。*57（4）質(zhì)粒的三種構(gòu)型①超螺旋閉合環(huán)狀DNA，cccDNA。②開環(huán)DNA，至少一股DNA上有缺口，一處或多處使DNA鮮旋。③線狀DNA

瓊脂糖(Agrose)電泳可將這三種構(gòu)型的DNA分開，Agrose電泳中cccDNA位置最前。*（4）質(zhì)粒的三種構(gòu)型①超螺旋閉合環(huán)狀DNA，cccDNA58二、閱讀微生物的基因型符號

在描述一個微生物的品系時，最重要的事就是區(qū)分它的基因型和表現(xiàn)型。基因型說明它的遺傳決定子，這是看不見的特性；而表現(xiàn)型反映的是可觀察到的特性。

1．由于一個微生物的基因組中有成百個基因。因此，一般而言，在描述一個品系的基因型時只給出它與野生型有所不同的等位基因，而不必一一描述那些與野生型相同的基因。也就是說，在它們名稱后面所給出的是這些品系的基因組中發(fā)生了突變的基因。如：某菌，trp、his和metA，是表示它的trp、his和metA基因座是突變了的，其他基因組仍然正常。在上下文貫通地具體描述微生物的某個基因(如trp)時，可以用trp+，或者只是簡單地用“+”表示它的野生型品系，而不必在每次提到它時都寫作trp+。有些突變型是缺失突變，就用△表示，如△lon表示lon基因的缺失突變。*二、閱讀微生物的基因型符號在描述一個微生物的592．有些細菌中有附加體或者其他特殊的傳導(dǎo)噬菌體。最常見的是性因子F。細菌中有F因子的描述為F+；沒有的為F-。有些F因子上面帶有細菌的某些基因，這樣的F因子寫作Fˊ，它所帶基因的描述方法同上。例如Flac+，proA+，B+表示F因子上面帶有細菌的lac和proA，B基因。又如，F(xiàn)lacZ，proA+，B+表示F因子上面帶有l(wèi)ac和proA，B基因，但是，其中的Z基因是突變的基因。

3．校正基因(sup)座位的描述常常令人眼花繚亂。因為野生型品系雖然不帶有校正基因，它的基因型卻理所當(dāng)然地應(yīng)當(dāng)寫作sup+，表現(xiàn)型則應(yīng)該寫為Sup-?？墒?，帶有sup基因的突變型品系的基因型必需寫為sup-或者sup，它的表現(xiàn)型是Sup+。也就是說，字面上的概念與實際上的情況正好倒了一個個兒。因此，在閱讀它時要特別小心，以免搞錯。此外，在談到特殊的校正基因時，它的表現(xiàn)型常用數(shù)字來表示，如Sul；但是，它的基因型卻用字母來表示supD。鑒于這種情況，有人建議對校正基因野生型(Su-)的品系干脆不用任何符號，只標(biāo)出突變型品系(Su+)的特殊基因座位符號，如supD和supE等。*2．有些細菌中有附加體或者其他特殊的傳導(dǎo)噬菌體。60JM83，F(xiàn)-，ara，△(lac-proAB)，rpsL，Ф80d，lacZ△M15是這樣一個品系：不帶F因子，ara基因座突變(因此不能代謝阿拉伯糖)，lac操縱子缺失(因此不能利用乳糖)，30S核糖體的S12亞基突變(因此有鏈霉素抗生)，β-D-半乳糖苷酶基因部分缺失(因此在含X-gal的平板中有α-互補作用。如果將克隆的pUC質(zhì)粒的重組DNA轉(zhuǎn)化入這個細菌，就可以通過藍/白菌斑來篩選出轉(zhuǎn)化子)。野生的大腸桿菌具有大約4700kbp的DNA分子，上面有約2800個基因。當(dāng)這些基因中有突然變異發(fā)生時，基因產(chǎn)物隨之變化，并且有可能給大腸桿菌帶來可以觀察到的變化。這種能夠觀察到的特征叫做大腸桿菌的表現(xiàn)型(Phenotype)，而把基因的構(gòu)成叫做大腸桿菌的基因型(Genotype)。試舉一例來說明上述概念：*JM83，F(xiàn)-，ara，△(lac-proAB61

通常情況下，基因工程中使用的大腸桿菌的基因型只有在基因發(fā)生變異，表現(xiàn)型發(fā)生變化時才被表示。但是需要特別的表示時，則在野生的基因型上加“+”，在變異的基因型上加“-”以示區(qū)別。表示方法是用基因產(chǎn)物或其作用的名稱的三個斜體字素表示(如DNAAedninemethylase-dam)。如果不同的基因變導(dǎo)致相同的作用結(jié)果，則加上一個大寫字母(如Recombination-recA、recB、recC)。某個基因或者是某領(lǐng)域缺失時，在基因型前向加上“△”表示，如“從lac到proAB基因缺失時表示為△(lac-proAB)。野生的大腸桿菌本來還有具有F因子等的質(zhì)粒DNA，并且感染噬菌體。把被野生的大腸桿菌感染的噬菌體特稱為原噬菌體(Prophage)，例如e14。一般當(dāng)這些質(zhì)?；蛟删w缺失或變異時也用“()”或“/”等加以區(qū)別表示。*通常情況下，基因工程中使用的大腸桿菌的基因型62表現(xiàn)型是用羅馬字母體表示(第一個字母大寫)。一般通過變異而獲得了能夠觀察到的抗藥性或者活性表達等特征時，用“+”表示(Steptomycin抗性：Str+)；相反地當(dāng)成為藥物敏感性或者活性喪失時，用“-”表示(Ampicillin敏感性：Amp-)。基因型表現(xiàn)容易混淆，使用時注意。*基因工程中經(jīng)常使用的大腸桿菌幾乎都來自于K-12菌株，最近也常使用由B株及C株來源的大腸桿菌。*大腸桿菌B株原來就為lon-，另外MV1184株不具有琥柏抑制基因(Ambersuppressorfree)，由于這些都是原始菌株所不具備的基因，因此不在基因型中加以表示，要注意。*表現(xiàn)型是用羅馬字母體表示(第一個字母大寫)。一般通過變異63supE(suppressor)抑制基因

supE變異時，即使存在終止密碼UAG，此處也會插入谷氨酰胺(Glutamine)，從而可使蛋白質(zhì)繼續(xù)合成。

supF(suppressor)抑制基因

supF變異時，即使存在終止密碼子UAG，此處也會插入酪氨酸(Tyrosine)，從而可使蛋白質(zhì)繼續(xù)合成。停止密碼回復(fù)*supE(suppressor)抑制基因停止密碼回復(fù)64recA(recombination)重組相同的DNA重組活性缺失由于導(dǎo)入DNA與宿主DNA的重組受到阻害，可以保持插入DNA的穩(wěn)定性。與recA13宿主菌相比，recA1宿主菌能夠使插入DNA穩(wěn)定存在。

recB，C(recombination)重組內(nèi)切核酸酶V變異。抑制重組并能影響放射線損傷的修復(fù)。

traD(transmissibility)遺傳穩(wěn)定性在質(zhì)粒F因子內(nèi)部，與大腸桿菌的結(jié)合有關(guān)。

TraD變異后，F(xiàn)因子自身的傳遞能力顯著下降。重組機能缺失*recA(recombination)重組重組機能缺65dam(DNAadeninemethylase)DNA腺嘌呤甲基化酶宿主菌來源的腺嘌呤甲化酶(GmATC)缺失

dcm(DNAcytsinemethylase)DNA胞嘧啶甲基化酶宿主菌來源的胞嘧啶甲基化酶（CmCWGG）缺失

hsdR(hostspecificitydefective)宿主特異性缺陷宿主菌來源的I型限制酶Ecok(或EcoB)的切斷部位蛋白變異轉(zhuǎn)化的外源DNA不被限制酶EcoK切斷，可以進行克隆

hsdM(hostspecificitydefective)

宿主菌來源的I型限制酶EcoK(或EcoB)的甲基化酶部位蛋白變異

hsdS（hostspecificitydefective）宿主菌來源的I型限制酶EcoK(或EcoB)的識別部位蛋白變變異轉(zhuǎn)化的外源DNA不被限制酶EocK切斷，可以進行克隆對插入DNA具有直接作用因子的缺失*dam(DNAadeninemethylase)66

endA(endonuclease)內(nèi)切核酸酶宿主菌來源的非特異性內(nèi)切核酸酶I活性缺失，可以提高純化的質(zhì)粒DNA的質(zhì)量。

NcrA(methylcytsinerestriction)mCG序列的甲基化活性缺失。

mcrB，C(methylcytsinerestriction)GmC序列的甲基化活性缺失。

mrr(methylationrequiringrestricion)mA以及mC序列的甲基化活性缺失。*endA(endonuclease)內(nèi)切核酸酶*67

rpsL(ribosomalproteinsmallsubunit)

由30S核糖體蛋白變異而獲得鏈霉素(Steptomycine)抗性(Strr)。

gyrA(gyrase)

由DNA回旋酶亞基A的變異而獲得的萘啶酮酸(Nalidxicacid)抗性(Nalr)。

Tn5(transposon)

轉(zhuǎn)座子變異，獲得卡那霉素(Kanamycine)抗性(Kmr)。

Tn10(transposon)

轉(zhuǎn)座子變異，獲得四環(huán)素（Tetracycline）抗性（Tetr）?？顾幮缘淖儺?rpsL(ribosomalproteinsmal68lon(longform)

分解異型蛋白質(zhì)的ATP依賴型蛋白分解酶活性缺失。大腸桿菌B株原來就為lon-?？梢种破浔磉_的融合蛋白質(zhì)的分解。

omp(outermembraneprotein)外膜蛋白膜結(jié)合性蛋白分解酶活性缺失。抑制表達的融合蛋白質(zhì)的分解。宿主蛋白酶缺失*lon(longform)宿主蛋白酶缺失*69lacIq(lactose)

乳糖操縱子中控制β-半乳糖苷酶表達的調(diào)節(jié)蛋白基因。由于lacIq變異，表達調(diào)節(jié)蛋白過量形成，因此從乳糖啟動子開始的轉(zhuǎn)錄過程完全受到抑制。

lacZ(lactose)β-半乳糖苷酶活性缺失

lacZ△M15β-半乳糖苷酶蛋白的w-fragment得到表達。當(dāng)與多數(shù)載體質(zhì)粒中所具有的α-fragment共同存在時，可使β-半乳糖苷酶的活性回復(fù)(α-互補性)。在含有X-gal的平板培養(yǎng)基上，可以通過藍白菌的差別選擇重組體。

deoRdeoR變異，可以選擇性地改善大分子DNA的轉(zhuǎn)化。有利于選擇轉(zhuǎn)化體的基因*lacIq(lactose)有利于選擇轉(zhuǎn)化體的基因*70

dut(dUTPase)dUTP酶

dUTP分解酶活性缺失，當(dāng)dUTP分解酶存在時，dUTP不能摻入到DNA鏈中。

ung(Urasil-N-glycosylase)尿嘧淀-N-糖苷酶尿嘧啶-N-糖苷酶活性缺失。當(dāng)具有這種基因時，可以特異性地分解DNA含U的那條鏈。

mutS(mutator)突變子未被甲基化的新合成DNA鏈的錯配序列修復(fù)受到阻礙。有利于點突變的基因*dut(dUTPase)dUTP酶有利于點突變的基因71

leuB(leucine)亮氨酸在最小培養(yǎng)基中必須添加亮氨酸(Leu)proAB(proline)脯氨酸脯氨酸代謝基因變異。在最小培養(yǎng)基中只有添加脯氨酸才能生長。用于確認JM109等大腸桿菌菌株的F因子是否脫落。

Thi-1(thiamine)硫胺素

硫胺素代謝基因變異，在最小培養(yǎng)基中必須添加硫胺素。菌株篩選用基因*leuB(leucine)亮氨酸菌株篩選用基因*72

LacZ、lac5、

trpE、bio、bio256從大腸桿菌lac、trp和bio區(qū)置換而來

imm80、QSR80從φ80噬體置換而來

imm434從φ434噬菌體置換而來

imm21從φ21噬菌體置而來

int29從φ29噬菌體置換而來

b2、b1007、b527、b189B域的缺失突變，使att位點受破壞并因而阻止溶源化

KH52φ80噬菌體DNA的缺失突變

KH53類似于λ噬菌體cI區(qū)域的φ80噬菌體區(qū)域的缺失突變，可有效地防止溶源化

KH54Rex－cI區(qū)域的缺失突變，可有效地防止溶源化

nin5轉(zhuǎn)錄終止位點tR2的缺失突變，可使延遲早期轉(zhuǎn)錄不依賴于N基因產(chǎn)物，并且也刪除了ral基因附近的BamHI位點

ninL44轉(zhuǎn)錄終止位點tR2的缺失突變，可使延遲早期轉(zhuǎn)錄不依賴于N基因產(chǎn)物，并且也刪除了ral基因附近的BamHI位點。

WL113從33240位的SalI到34500位的BamHI之間的1，3kb缺失突變，不損傷gam基因，但kil，cⅢ、ssb和ral基因被刪除。

sslIλ1-2從第一到第二個SalI之間的0.5kb缺失突變，gam基因和部分bet基因被刪除。*LacZ、lac5、從大腸桿菌lac、trp和bio區(qū)置換73續(xù)上表shndⅢλ2-3λ噬菌體第二與第三個HindⅢ之間的2.3kb缺失突變，部分b區(qū)被刪除sxIλ1oXbaI酶切后經(jīng)外切核酸酶消化而造成的0.5kb缺失突變

鼠填充片段大腸桿菌填充片段

lac操縱基因+

腺病毒DNA在重組體中將被置換的載體DNA片段BluescriptM13-重組入λZAP載體的噬菌粒，當(dāng)用M13輔助噬菌體感染后，噬菌粒部分可在體內(nèi)被切下。lacY、lacZ、lacPO

、lacIq、ampr插入ΛOPF8的lac和氨芐青霉素抗生基因Aam、Bam、Eam、

Wam、gamam可被supE和（或）supF抑制的琥珀突變。intamInt基因內(nèi)的BamHI位點被消除后形成的琥珀突變。Sam7、Sam100參與溶解細菌細胞膜的一個基因內(nèi)的琥珀突變。該突變可被supF抑制，但不被supE抑制，失卻野生型S基因產(chǎn)物后，引起感染性噬菌體顆粒在細胞內(nèi)發(fā)生積累。cIts857使cI基因產(chǎn)物對熱不穩(wěn)定的溫度敏感突變chi促進λ噬菌體定向重組的特定八核苷酸序列g(shù)amGam基因編碼大腸桿菌recBC外切核酸酶的抑制物，因此可使Q型DNA復(fù)制有效地轉(zhuǎn)向滾環(huán)復(fù)制。Gam基因產(chǎn)物對于λ噬菌體有recA-菌株（Fec表型）和P2噬菌體溶源的recA+菌株（Spi表型）內(nèi)的生長非常重要。exobet(red)Exo和bet是位于λ噬菌體red區(qū)域的兩個基因（red表示兩個基因或任一個基因）。這兩處基因產(chǎn)物參與當(dāng)從Q型DNA復(fù)制向滾環(huán)復(fù)制轉(zhuǎn)變時的重組過程。