素材：濾膜法測定微生物數(shù)量-高二下學(xué)期生物人教版選擇性必修3

濾膜法測定微生物數(shù)量高中生物學(xué)選擇性必修三介紹了稀釋涂布平板法測定微生物數(shù)量，必修二介紹了血球計數(shù)板測定酵母數(shù)量菌。在科學(xué)研究和生產(chǎn)實踐，還會用到一種定微生物數(shù)量的方法——濾膜法。人們在檢查病原菌污染的飲用水、近海海水和水源水時，經(jīng)常以檢查水中大腸桿菌的數(shù)量作為指標(biāo)（我國《生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定：每升水中大腸桿菌不多于3個，可作為飲用水）來說明水受人畜糞便污染的程度。因水中由病人和病畜或帶菌者的糞便污染而來的病原菌數(shù)量很少，不易直接檢查，而水中的大腸桿菌群，如果超過一定數(shù)量，就說明被檢查水可能有病菌存在。實際上這種檢查過程，首先是應(yīng)用選擇性培養(yǎng)基，將大腸桿菌群從雜菌中分離出來的一種過程。其檢驗方法有兩種：一是發(fā)酵法，即根據(jù)大腸桿菌群具有能分解乳糖生成CO2等氣體的特性酶，而其他腸道細菌如沙門氏菌屬，由于沒有這種特性酶，不能產(chǎn)氣，可被區(qū)別開來；另一種是濾膜法，它是利用細菌不能通過微孔性薄膜，在抽濾下液體濾過而細菌被截留在膜上，然后用具有高度選擇性的品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基分離培養(yǎng)，本實驗將應(yīng)用這種方法分離鑒定大腸桿菌群。濾膜法的大致流程：用濾膜過濾待測水樣→水樣中的細菌留在濾膜上→將濾膜轉(zhuǎn)移到EMB培養(yǎng)基上培養(yǎng)→統(tǒng)計菌落數(shù)目．1.濾膜與濾器的滅菌（1）將濾膜放入燒杯中，加入蒸餾水，于沸水浴中煮沸滅菌三次，每次15分鐘。前二次煮沸后需換水洗滌2-3次，以除去殘留的溶劑。（2）濾器滅菌，用點燃的酒精棉球火焰滅菌，也可用紗布和牛皮紙包裝好于121℃蒸汽下，高壓滅菌20分鐘2.分離培養(yǎng)（1）過濾水樣（海水、飲用水、自來水，水庫水及各種水源水），用滅菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣，使粗糙面向上，貼放于已滅菌的濾器上，穩(wěn)妥地固定好濾器，將水樣注入濾器內(nèi)，加蓋，打開濾器閥門，在負0.4大氣壓下抽濾，水樣抽完后，再抽氣5秒鐘，關(guān)上濾器閥門，取下濾器。（2）用滅菌攝于夾濾膜邊緣，移放在EMB培養(yǎng)基平板培養(yǎng)基上，使濾膜的截留細菌面向上，另一面完全緊貼培養(yǎng)基，兩者之間不得留有氣泡，重復(fù)以上的步驟，再接種一、二個平板，倒置培養(yǎng)皿于37℃下培養(yǎng)20-24小時。（3）原理：大腸桿菌在含有伊紅美藍的固體培養(yǎng)基（EMB培養(yǎng)基）上長出的菌落呈黑色。3.含量（污染程度）的計算1毫升水樣中的大腸桿菌群數(shù)等于濾膜上生長的大腸桿菌群的菌落平均數(shù)乘以稀釋倍數(shù)，最后除以樣品的毫升數(shù)，即得。例如，無菌操作下將90ml無菌水加入到10ml待測水樣中，這樣就將待測水樣稀釋了10倍，將稀釋后的菌液通過濾膜法測得EMB培養(yǎng)基上的菌落數(shù)為45，黑色菌落為5，根據(jù)大腸桿菌鑒定的原理可知，黑色菌落為大腸桿菌，因此1升待測水樣中的大腸桿菌數(shù)目=5×（1000÷10）=500個。例、測定水樣是否符合飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，常用濾膜法測定大腸桿菌的數(shù)目。濾膜法的大致流程：用濾膜過濾待測水樣→水樣中的細菌留在濾膜上→將濾膜轉(zhuǎn)移到伊紅美藍的培養(yǎng)基(EMB培養(yǎng)基)上培養(yǎng)→統(tǒng)計菌落數(shù)目。流程示意圖如下圖所示。其中，指示劑伊紅美藍可使大腸桿菌菌落呈現(xiàn)紫黑色。請據(jù)圖回答問題：（1）過濾待測水樣需要用到濾杯、濾膜和濾瓶，其中需要進行滅菌處理的是

，與過濾有關(guān)的操作都要在

旁進行。（2）將完成過濾之后的濾膜緊貼在EMB培養(yǎng)基上，這屬于微生物培養(yǎng)中的

操作。從物理狀態(tài)角度分析，EMB培養(yǎng)基屬于

培養(yǎng)基，從功能上分屬于

培養(yǎng)基。（3）某生物興趣小組的同學(xué)嘗試按照上述方法進行測定，無菌操作下將10mL待測水樣加入到90mL無菌水中，稀釋后的菌液通過濾膜法測得EMB培養(yǎng)基上的菌落數(shù)平均為124，紫黑色菌落數(shù)平均為31，則推測1L待測水樣中的大腸桿菌數(shù)目為

。（4）大腸桿菌進行擴大培養(yǎng)時，用搖床振蕩培養(yǎng)的目的是

。（5）在配制尿素培養(yǎng)基中，通過選用合適

的濾膜代替G6玻璃砂漏斗，也可去除尿素溶液中雜菌。答案：（1）濾杯、濾膜和濾瓶酒精燈火焰（2）接種固體鑒別（3）3100（4）提供氧氣、使大腸桿菌與營養(yǎng)物質(zhì)充分接觸（5）孔徑解析（1）過濾待測水樣需要用到濾杯、濾膜和濾瓶，其中需要進行滅菌處理的有濾杯、濾膜和濾瓶，與過濾有關(guān)的操作都要在酒精燈火焰旁進行，防止雜菌的污染。（2）將完成過濾之后的濾膜緊貼在EMB培養(yǎng)基上，可將濾膜上的菌體“復(fù)印”在培養(yǎng)基上，使其在培養(yǎng)基上生長，這屬于微生物培養(yǎng)中的接種操作。從物理狀態(tài)分析，EMB培養(yǎng)基屬于固體培養(yǎng)基，從功能上分析，由于培養(yǎng)基上加有伊紅美藍，所以屬于鑒別培養(yǎng)基。（3）在無菌操作下將10毫升待測水樣加入到90毫升無菌水中，即稀釋了10倍，稀釋后的菌液通過濾膜法測得EMB培養(yǎng)基上的菌落數(shù)平均為124，黑色菌落數(shù)平均為31，由于黑色菌落為大腸桿菌，所以可推測1升待測水樣中的大腸桿菌數(shù)目為3100個。