小鼠前向運(yùn)動精子分離采集技術(shù)改良

小鼠前向運(yùn)動精子別離采集技術(shù)改進(jìn)【摘要】目的進(jìn)步從小鼠附睪采集的精子中前向運(yùn)動精子的比例。方法設(shè)計“雙艙培養(yǎng)皿〞和“雙艙浮游法〔B法〕〞采集小鼠精子,并與當(dāng)前普遍采用的“常規(guī)浮游法〔A法〕〞進(jìn)展配比照擬實(shí)驗(yàn)。采用A,B法分別采集同一只小鼠的雙側(cè)附睪精子。結(jié)果前向運(yùn)動精子活潑地從“雙艙培養(yǎng)皿〞的內(nèi)艙游出至外艙。A、B兩法別離得到的前向運(yùn)動精子百分率分別為(56.83±7.23)％和(77.33±5.69)％,變異系數(shù)分別為12.72％和7.36％,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論“B法〞能穩(wěn)定顯著地進(jìn)步前向運(yùn)動精子的百分率,優(yōu)于“A法〞?！娟P(guān)鍵詞】附睪精子精子能動性疾病模型動物福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報2022年7月第42卷第4期江帆等：小鼠前向運(yùn)動精子別離采集技術(shù)改進(jìn)小鼠精子采集技術(shù)是受精機(jī)制研究和生殖工程中常用的實(shí)驗(yàn)方法[1]。自然小鼠精液中含有構(gòu)造、功能并不一致的多種精子和少量生殖道脫落細(xì)胞,只有活潑向前運(yùn)動的精子〔前向運(yùn)動精子〕具有正常生理功能,才能游到受精地點(diǎn)與卵細(xì)胞發(fā)生受精。因此,快速簡便地獲得高百分率的前向運(yùn)動精子,是進(jìn)展實(shí)驗(yàn)的重要前提。目前國內(nèi)外普遍采用的“常規(guī)浮游法〔A法〕〞是將含有成熟精子的小鼠附睪尾或輸精管放在培養(yǎng)液里剪開,讓其中的前向運(yùn)動精子浮游到培養(yǎng)液中[2],其收獲的前向運(yùn)動精子的百分率不高且不穩(wěn)定。筆者改進(jìn)設(shè)計一種新型簡便的“雙艙浮游法〔B法〕〞,并與A法進(jìn)展比擬。1材料與方法1.1材料1.1.1儀器1.1.2動物8～12周齡的普通級雄性昆明小鼠，體質(zhì)量18～25g〔福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心〕。1.1.3試劑小鼠精子培養(yǎng)液16按文獻(xiàn)[3]配制,配方主要成分為：Nal，Kl，KH2P4，gS4·7H2，乳酸鈉,葡萄糖,青霉素,鏈霉素,碳酸氫鈉,丙酮酸鈉,氯化鈣〔均為國產(chǎn)分析純試劑〕,BSA〔FratinⅤ,美國SigaA3311〕；胚胎培養(yǎng)級輕質(zhì)礦物油〔Siga，8410〕,氯仿〔廣東汕頭西隴化工廠〕,生理鹽水〔福州海王福藥制藥〕。1.2方法1.2.1“B法〞精子采集方案設(shè)計“A法〞是在直徑35的培養(yǎng)皿中央?yún)⒓蛹s1.0L培養(yǎng)液形成一個液滴,液滴四周及其外表覆蓋礦物油；小鼠附睪尾放在液滴中央剪開,使精液從組織中擴(kuò)散到培養(yǎng)液里；培養(yǎng)一段時間后從液滴的上層汲取懸液以收獲游出的精子〔圖1A〕。本研究設(shè)計的“B法〞在上述培養(yǎng)皿中央增加2個直徑不同的同心圓環(huán),制成“雙艙培養(yǎng)皿〞。內(nèi)環(huán)參加培養(yǎng)液并使其溢出至外環(huán)形成一個大液滴,液滴覆蓋的區(qū)域構(gòu)成內(nèi)、外半隔斷的2個“艙〞；小鼠附睪尾放在內(nèi)艙中剪開,精液只在內(nèi)艙中擴(kuò)散,而前向運(yùn)動精子那么可以跨越內(nèi)環(huán)而游到外艙；培養(yǎng)一段時間后從外艙底部汲取懸液以收獲游出的精子,大局部運(yùn)動功能差及或死亡的精子將被擋在內(nèi)艙而被排除〔圖1B〕,從而別離出前向運(yùn)動精子。1.2.2雙艙培養(yǎng)皿制作用手術(shù)刀平整切下0.5LEP管內(nèi)蓋上凸出的圓環(huán)〔直徑約8,高約3〕,于氯仿中浸泡下緣3in左右,鑷子夾起圓環(huán)立即貼于35塑料培養(yǎng)皿中央作為內(nèi)環(huán)；再從20L塑料注射器上剪下一圈圓環(huán)(直徑約22,高約2)同法浸泡后套在內(nèi)環(huán)之外作為外環(huán),高度略矮于內(nèi)環(huán)。內(nèi)外2圓環(huán)組成同心圓,確認(rèn)內(nèi)外環(huán)都貼緊培養(yǎng)皿而無縫隙,即制成雙艙培養(yǎng)皿〔圖2〕,內(nèi)環(huán)之內(nèi)的區(qū)域稱為內(nèi)艙,內(nèi)、外環(huán)之間的區(qū)域稱為外艙。1.2.3附睪尾取材在超凈工作臺無菌條件下操作?！凹棺靛e位法〞處死小鼠,仰臥,酒精噴灑體表消毒,在其下腹部橫向剪開一道小口,縱向撕開,暴露腹壁肌肉,組織鑷捏起膀胱投影區(qū)上方腹壁肌肉,細(xì)微抖動防止內(nèi)臟粘連,提起后橫向剪開至腹壁兩側(cè),充分暴露其下脂肪囊；拉出脂肪囊,暴露睪丸和附睪,鑷子夾住附睪體的尾部末端,剝離附睪尾周圍的脂肪和血管,沿鑷子夾取部位剪下雙側(cè)附睪尾,放入生理鹽水中清洗外表殘留脂肪及血污。1.2.4精子采集每次實(shí)驗(yàn)對同一只小鼠左右兩側(cè)附睪尾分別隨機(jī)編為A、B組：A組將附睪尾置于培養(yǎng)皿液滴中央,采用“A法〞采集精子；B組將附睪尾置于培養(yǎng)皿內(nèi)環(huán)中,采用“B法〞采集。切碎附睪尾時注意動作盡量輕巧,防止過分振動。將培養(yǎng)皿移入培養(yǎng)箱中，37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05％的2培養(yǎng)15in后移出至超凈臺上,用1000μL可調(diào)微量移液器分別從2組汲取500μL精子懸液并裝入2個1.5LEP管中。A組從液滴的上層汲取懸液,B組那么從外艙的底部貼近內(nèi)環(huán)處汲取懸液〔圖1〕。將EP管中的1只移回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)等待檢查,另1只EP管的精子懸液立即進(jìn)展顯微觀察與計數(shù)。1.2.5顯微觀察與計數(shù)用200μL可調(diào)微量移液器對EP管中的精子懸液反復(fù)吹吸數(shù)次使精子混勻,汲取40μL精子懸液滴加在載玻片上,覆蓋蓋玻片后觀察。對蓋玻片中央和四角〔防止蓋玻片邊沿〕的5個區(qū)域內(nèi)精子進(jìn)展觀察和計數(shù)。利用血球分類計數(shù)器對“前向運(yùn)動精子〞和“非前向運(yùn)動精子〞的數(shù)目進(jìn)展分別計數(shù),每片樣本計數(shù)精子總數(shù)〔前向運(yùn)動精子數(shù)＋非前向運(yùn)動精子數(shù)〕200個。1.2.6前向運(yùn)動精子百分率計算分別計算A、B樣品的前向運(yùn)動精子百分率,計算方法為：前向運(yùn)動精子數(shù)〔frardveentspernuber,FSN〕除以精子總數(shù)〔ttalspernuber,TSN〕再乘以100%,即等于前向運(yùn)動精子百分率〔frardveentsperrate,FSR〕。FSR=FSN/TSN×100%1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用iralringin3.0〔iralSftareIn.〕分別統(tǒng)計出2組前向運(yùn)動精子百分率的x±s,計算變異系數(shù)〔V=ean/SD〕并繪制成柱形圖。采用配對資料t檢驗(yàn)對均數(shù)進(jìn)展顯著性檢驗(yàn),P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果共進(jìn)展12例配對實(shí)驗(yàn)。A,B組的前向運(yùn)動精子百分率均值分別(56.83±7.23)％和(77.33±5.69)％,V分別為12.72％和7.36％。配對資料t檢驗(yàn)顯示差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義〔P＜0.01〕,B組顯著高于A組〔圖3〕。3討論3.12種精子采集技術(shù)的比擬3.2“B法〞技術(shù)優(yōu)勢分析“B法〞顯著進(jìn)步前向運(yùn)動精子比例的原因：〔1〕附睪尾放在內(nèi)艙中,在剪碎組織和隨后將培養(yǎng)皿移入或移出培養(yǎng)箱等操作中,附睪尾被局限于相對狹小的內(nèi)艙不易挪動,防止造成較大的液體波動而減少非前向運(yùn)動精子及其它組織碎片在培養(yǎng)液中隨機(jī)擴(kuò)散；〔2〕附睪尾切開,精液流出組織后將主要在內(nèi)艙中擴(kuò)散。內(nèi)環(huán)具有一定高度,只有前向運(yùn)動精子可以游到其頂端并跨越到外艙,而非前向運(yùn)動精子絕大局部將被內(nèi)環(huán)阻擋在內(nèi)艙區(qū)域并逐漸沉降于內(nèi)艙底部,從而實(shí)現(xiàn)了前向運(yùn)動精子與非前向運(yùn)動精子在一定程度上的區(qū)域別離。因重力的關(guān)系,游出到外艙的精子可能逐漸沉降到艙底而比擬難于游回到內(nèi)艙。故隨時間推移,外艙中的前向運(yùn)動精子數(shù)量將有富集的趨勢；〔3〕在汲取精子懸液時,“B法〞要求從外艙的底部貼近內(nèi)環(huán)處汲取懸液,可最大限度減少內(nèi)艙中產(chǎn)生液流,防止內(nèi)艙區(qū)域中高比例的非前向運(yùn)動精子被吸出。在實(shí)際操作過程中,培養(yǎng)皿及其液滴難免受到一些振動,大量前向運(yùn)動精子從內(nèi)艙游出時也會形成微小的液體潛流,這些因素都可造成一些非前向運(yùn)動精子漂浮于液滴中,在汲取懸液時被采集。因此,“B法〞采集到的精子中,仍將有一局部非前向運(yùn)動精子。另外,本研究為了適應(yīng)多種實(shí)驗(yàn)?zāi)康男枰?采用了較短的別離采集時間〔15in〕,內(nèi)艙區(qū)域中漂浮的“非前向運(yùn)動精子〞可能還未充分沉降,以致其中的一局部隨汲取懸液時產(chǎn)生的液流被吸出,從而降低了前向運(yùn)動精子的百分率。這可能是本研究中平均前向運(yùn)動精子百分率尚不是很高的原因。對于單純?yōu)榱双@取前向運(yùn)動精子進(jìn)展體外受精的研究而言,可以將精子采集步驟與隨后的精子獲能步驟合二而一,故允許培養(yǎng)皿在2培養(yǎng)箱里停留更長時間,那么將有更多的非前向運(yùn)動精子充分沉降于內(nèi)艙,有望