基于貝爾曼漏斗法的土壤線蟲最優(yōu)分離時(shí)長探究

基于貝爾曼漏斗法的土壤線蟲最優(yōu)分離時(shí)長探究:摘要］貝爾曼漏斗法是土壤線蟲分離中較為常用的方法，但現(xiàn)有研究使用的分離時(shí)長差異較大，缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。為探究其最優(yōu)分離時(shí)長，該研究利用貝爾曼漏斗法分離土壤線蟲，連續(xù)72h進(jìn)行計(jì)數(shù)，分別計(jì)算12、24、36、48、60、72h的累積分離率。結(jié)果顯示，就分離種類而言24h為峰值，與48h比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(21.00±2.54!s.21.00±1.00,$=0.817)；就分離數(shù)量而言36h是最適時(shí)長，累計(jì)分離率達(dá)99.63%。實(shí)驗(yàn)共分離出線蟲24777頭，屬2綱6目21科35屬，涵蓋了較多的線蟲類群，具有普適性。綜合分離種類和數(shù)量，推薦貝爾曼漏斗法的分離時(shí)長為36h。:關(guān)鍵詞］土壤線蟲；貝爾曼漏斗法;分離時(shí)長土壤是生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)能量循環(huán)的重要載體,是生物圈中最為重要的生態(tài)系統(tǒng)之一,也是綠色植物生長的基礎(chǔ)〔1］。土壤生態(tài)系統(tǒng)中存在著世界上最大的動(dòng)物類群——土壤動(dòng)物，土壤線蟲是土壤動(dòng)物中的優(yōu)勢類群，在土壤食物網(wǎng)中占據(jù)多個(gè)營養(yǎng)級地位〔2］,其群落組成能夠反映氣候條件、土壤質(zhì)地、土壤有機(jī)質(zhì)輸入以及自然和人為的擾動(dòng)情況〔3〕。它們被視為一個(gè)地區(qū)生物多樣性及其可持續(xù)性的指示生物，尤其是運(yùn)用其評價(jià)土壤健康程度、土壤動(dòng)物學(xué)效應(yīng)、生態(tài)系統(tǒng)演替或外界干擾強(qiáng)度等〔4］。土壤線蟲類群龐大、物種數(shù)量巨大，傳統(tǒng)分類工作較為困難。線蟲分離是對土壤線蟲分類、進(jìn)行形態(tài)和生態(tài)學(xué)研究的基礎(chǔ)，分離率也限制了后續(xù)的研究⑶。根據(jù)不同的研究目的及原理，目前國內(nèi)外對土壤線蟲分離的方法主要分為3類：過篩法、懸浮法、貝爾曼漏斗法〔5］，前兩類分離方法得到的線蟲懸液含有較多的土壤礦質(zhì)顆粒和有機(jī)物殘?bào)w，貝爾曼漏斗法分離得到的線蟲懸液幾乎無雜質(zhì)，蟲體干凈完整、活性高，操作簡單,方便后續(xù)的計(jì)數(shù)和鑒定，能大大降低實(shí)驗(yàn)的前期投入，被視為最節(jié)省時(shí)長，分離過程最簡便，分離后雜質(zhì)最少的分離方法〔5〕。該方法利用線蟲的趨水性和自身重力,脫離土壤進(jìn)入水中，因此分離率受時(shí)長的影響較大〔6］。目前使用貝爾曼漏斗法對土壤線蟲進(jìn)行分離沒有較為統(tǒng)一的分離時(shí)長，利用中國知網(wǎng)和WebofScience，本研究隨機(jī)搜集了100項(xiàng)采用貝爾曼漏斗法分離線蟲的研究，統(tǒng)計(jì)其使用的分離時(shí)長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各研究中分離時(shí)長極不統(tǒng)一(12?168h)，其中24h和48h使用頻率較多，分別占40%和50%。見圖1。5040寥30曲2010012 16 24 30 48 72 168分離時(shí)長/h圖1100項(xiàng)研究中不同分離時(shí)長的使用頻率對貝爾曼漏斗法的最優(yōu)分離時(shí)長選擇、兼顧研究需求的同時(shí)減少不必要的時(shí)間投入等問題尚無系統(tǒng)研究。為探究貝爾曼漏斗法在土壤線蟲分離過程中的最優(yōu)分離時(shí)長，本研究基于貝爾曼漏斗法，對所采集的土壤樣品進(jìn)行線蟲分離，分離過程中連續(xù)72h收集分離出來的線蟲,比較12、24、36、48、60、72h分離時(shí)長下的累積分離率與分離種類，為貝爾曼漏斗法提取土壤線蟲時(shí)分離時(shí)長的設(shè)定提供參考依據(jù)，幫助研究人員快速有效地完成實(shí)驗(yàn)，促進(jìn)土壤線蟲及其相關(guān)生態(tài)學(xué)的研究。1材料與方法1.1研究區(qū)概況樣品采集地點(diǎn)蒼山位于云南省大理市（99°58'-100°27'E,25°34'~26°00'N）,地處低緯度山區(qū)，屬亞熱帶高原季風(fēng)氣候，南北長950km，東西寬19km，總面積950km2,海拔1980-4122mo植被囊括云南松林及灌叢草坡帶、華山林人工帶、常綠棟類、杜鵑箭竹灌叢林、蒼山冷杉林帶、高山杜鵑灌叢草甸。生物多樣性極為豐富獨(dú)特,并具有明顯的植物垂直分布帶譜，使蒼山成為南北生物交匯過渡帶，生物的分布和分化中心，為全球生物多樣性最為豐富的地區(qū)之一⑺。1.2研究方法1.2.1樣點(diǎn)設(shè)置及樣品采集在蒼山黑龍溪海拔2300m處（100。14'E,25°67'N）設(shè)置3個(gè)采樣點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)利用劈裂式采樣器（直徑38mm）分別采集3個(gè)樣品，樣品僅選取土柱5~10cm處的土壤，共采集土壤樣品9份⑻。1.2.2土壤線蟲分離將直徑為10cm的玻璃漏斗置于木架上，在漏斗內(nèi)鋪墊濾網(wǎng),漏斗下管連接長約10cm的橡膠管，距離橡膠管最末端1~2cm處用止水夾夾緊。把每份土壤樣品混勻后,去除肉眼可見的大石子和樹根等雜質(zhì)，平行稱取50g的土壤樣品3份,分別置于加墊濾網(wǎng)的漏斗中，加入超純水使土壤全部浸潤，1h后打開漏斗下端的止水夾收集分離出來的土壤線蟲，然后關(guān)閉止水夾，再加入超純水使土壤全部浸潤。重復(fù)上述操作，每隔1h取樣1次⑻，直至72ho將收集到的線蟲溶液放置于100mL的血清瓶中,72h/蟲收集完成后將線蟲溶液定容至100mLo1.2.3計(jì)數(shù)將血清瓶中溶液搖勻后，用移液槍吸取10mL的線蟲溶液至蛇形計(jì)數(shù)）中，在體視鏡下用解剖針挑取/蟲至細(xì)胞板中保存并用計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。當(dāng)所挑取的線蟲數(shù)量大于150條/10mL時(shí)，重復(fù)計(jì)數(shù)3次，取平均值后計(jì)算每個(gè)樣品的線蟲總數(shù)（100mL/蟲溶液中的線蟲數(shù)量即為對應(yīng)樣品中的線蟲總數(shù)）；若每次所取樣品挑取的線蟲數(shù)量不足150條/10mL時(shí)則需完全取樣，直至全部線蟲溶液被挑取計(jì)數(shù)完畢為止。1.2.4裝片制作將石蠟放置于培養(yǎng)皿中并在電熱板上加熱至融化，用自制的中空玻璃印章蘸取融化的石蠟，迅速蓋在載玻片上，冷卻后在載玻片中央形成一個(gè)密閉的石蠟圈，之后在石蠟圈中央滴1滴甘油，挑取不多于10條的線蟲到甘油中,輕輕蓋上蓋玻片，并置于電熱板上使石蠟融化，融化后移開電熱板冷卻，冷卻后固化的石蠟將載玻片與蓋玻片黏合，在制作好的裝片上標(biāo)記樣品編號及裝片編號后待檢。1.2.5拍照與鑒定用CCD成像顯微鏡（尼康E100+奧林巴斯DP26CCD采集器）拍攝土壤/蟲的形態(tài)（唇、口針、食道球、生殖腺、陰門、尾及尾腺），同時(shí)測量線蟲的體長、口針長度、最大體寬、體前端至食道與腸連接處的距離、尾長，并計(jì)算！=體長/最大體寬；"=體長/體前端至食道與腸連接處的距離；#=體長/尾長，用來輔助鑒定。分類鑒定參考《長白山森林土壤線蟲》〔8《中國土壤動(dòng)物檢索圖鑒及DenematodenvanNederland^10］，鑒定至屬。1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)對分離得到的線蟲進(jìn)行累積計(jì)數(shù)（即2h的結(jié)果為第1h與第2h結(jié)果的加和,3h的結(jié)果為第1、2、3h結(jié)果的加和，以此類推,直到第72h），分別計(jì)算12、24、36、48、60、72h的累積分離率。累積分離率=該時(shí)長累積分離線蟲數(shù)量/72h累積線蟲總數(shù)量X100%。線蟲種類的鑒定每隔24h鑒定1次，分別鑒定24、48、72h所收集的每份樣品的線蟲種類。1.4營養(yǎng)類群劃分依據(jù)Yeates等〔11］的方法將線蟲劃分為4個(gè)營養(yǎng)類群:植食性/蟲、食細(xì)菌線蟲、食真菌/蟲、雜食-捕食線蟲。2結(jié)果2.1土壤線蟲群落組成及營養(yǎng)類群所有土壤樣品中共分離得到土壤線蟲24777頭，屬/蟲門2綱6目21科35屬(其中有2科未鑒定到屬)。在所處理的樣品中，稀有類群分布于原桿屬(Protorhabditis)#滑刃屬(Aphelenchus)、螺旋屬(Helieotylenchus)等26個(gè)科屬中;常見類群中棱咽屬(Rhabdolaimus)為食細(xì)菌線蟲,其他均為雜食—捕食線蟲；無優(yōu)勢類群。見表1o表1實(shí)驗(yàn)樣品中土壤線蟲的群落構(gòu)成屬/科多度屬/科多度食細(xì)菌線蟲(bacterial-feedingnematode)食真菌線蟲(fungal-feedingnematode)原桿屬Protorhabditis+滑刃屬Aphelenchus+"桿屬M(fèi)esorhabditis+細(xì)齒屬Leptonchus+單宮屬M(fèi)onhystera+雜食-捕食/蟲(omnivores-predatorsnematode)擬X突屬Acrobeloides+單齒屬M(fèi)ononchus+X突屬Acrobeles+長尾屬Seinura+)唇屬Chiloplacus+三孔屬Tripyla++繞線屬Plectus+環(huán)總科Criconematoidea+鹿角唇屬Cervidellus+克拉克屬Clarkus++頭葉屬Cephalobus+矛線屬Dorylaimus++真頭葉屬Eucephalobus+真矛/屬Eudorylaimus++似繞線屬Anaplectus+鋸齒屬Prionchulus+隱咽屬Aphanolaimus+庫曼屬Coomansus++桿咽屬Rhabdolaimus+鏗齒屬M(fèi)ylonchulus+棱咽屬Rhabdolaimus++盆咽屬Panagrolaimus++畸頭屬Teratocephalus+孔咽科Aporcelaimidae++植食性線蟲(plantparasiticnematode)小桿屬Rhabditihabditis+墊刃屬Tylenchus+齒矛屬Enchodorus++盤旋屬Rotylenchus+"矛線屬M(fèi)esodorylaimus++螺旋屬Helicotylenchus+異矛線屬Allodorylaimus+注:+++表示優(yōu)勢類群；++表示常見類群；+表示稀有類群。2.2不同分離時(shí)長下土壤線蟲種類的分離差異從線蟲的分離種類看,24h與48h之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(21.00±2.54cs.21.00±1.00,n=9,P=0.817)，說+24h分離時(shí)長就可滿足種類分離要求。2.3不同分離時(shí)長下土壤線蟲的累積分離率實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在分離時(shí)長為12hX,線蟲的平均累積分離率為75.86%(69.99%?81.11%)；24h平均累積分離率為97.09%(95.59%?98.35%)；36h平均累積分離率已經(jīng)到99.63%(99.17%?99.80%)。見圖2。3討論本次收集到的線蟲數(shù)量龐大、類群完整,包括植食性/蟲、食細(xì)菌線蟲、食｛菌/蟲、雜食-捕食線蟲，結(jié)論具有普適性且可靠，為貝爾曼漏斗法分離X長的設(shè)定提供了有力支持。就分離的種類而時(shí)間/h圖2不同分離時(shí)長土壤線蟲的累積分離率言,24h的分離時(shí)長已經(jīng)滿足了實(shí)驗(yàn)的分離要求;就分離數(shù)量而言,36h累積分離率達(dá)到99%以上,是最優(yōu)的分離時(shí)長。綜合分離種類及數(shù)量兩方面的要求，我們建議貝爾曼漏斗法分離時(shí)長為36h,這個(gè)時(shí)長與24h相比，可多收集近3%的個(gè)體，分離完整性顯著增加;而與48h相比,可減少12h的實(shí)驗(yàn)時(shí)長，較大程度降低了分離時(shí)間，兼顧了實(shí)驗(yàn)的工作量和可信度。貝爾曼漏斗法利用線蟲的蠕動(dòng)和自身重力進(jìn)行分離收集，要求被分離的線蟲相對活躍,時(shí)間過長線蟲死亡后也必定會(huì)影響分離效果，結(jié)果也顯示36h后線蟲的累積分離率基本穩(wěn)定。同時(shí)受到物種活動(dòng)特性和樣品