干擾技術(shù)基本原理與應用

1、關(guān)于干擾技術(shù)基本原理與應用第1頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三什么是RNA干擾RNA干擾(RNA interference，RNAi),又稱轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing，PTGS)，是指將特異性同源雙鏈RNA(dsRNA)導入到細胞內(nèi)，使目的基因的不表達或表達水平下降.2001、2002年連續(xù)被Science評為年度十大成就!第2頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三目前應用的基因干擾技術(shù)DNA水平的基因干擾技術(shù)基因敲除技術(shù)寡核苷酸與雙鏈DNA 雜交采用多胺等小分子識別并阻遏特定轉(zhuǎn)錄因子第3

2、頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三目前應用的基因干擾技術(shù)mRNA水平的基因干擾技術(shù)用反義RNA 技術(shù)阻遏翻譯過程, 破壞內(nèi)源性mRNA設計寡核苷酸來破壞與mRNA 結(jié)合的蛋白質(zhì), 使mRNA 不穩(wěn)定雙鏈RNA 干擾技術(shù)（RNAi）第4頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三RNAi的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展歷程1984 年,Jonathan 研究小鼠L 細胞時發(fā)現(xiàn)反義mRNA 會干擾同源基因的表達，機制不清1990年 Jorgensen等 矮牽牛顏色加深實驗 “共抑制(co-suppresion)”第5頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三RNA

3、i的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展歷程1995年 Su Guo 和Ken Emphues 反義RNA阻斷秀麗小桿線蟲par-1基因的表達 實驗 首次發(fā)現(xiàn) RNA干擾現(xiàn)象1998年 Andrew Fire和Craig Mello 發(fā)現(xiàn)單鏈RNA抑制作用較弱，而純化的dsRNA可高效、特異地抑制基因的表達 Nature1998； 391: 806-11 正式提出RNA干擾的概念第6頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三RNAi的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展歷程1999年 Tuschl等 報道在哺乳動物中也存在RNAi2001 年 Berstein 等 提出只有22 核苷酸dsRNA才有特異性的阻斷效應，并發(fā)現(xiàn)體內(nèi)分

4、解dsRNA 為siRNAs (short/small interfering RNA) 的DICER 酶第7頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三RNAi的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展歷程2002 年 Novina 等 用RNAi 技術(shù)實現(xiàn)了對HIV-1 病毒的阻抑2004年 Morris 等 用RNAi技術(shù)實現(xiàn)了對人細胞基因的抑制 Science 2004(August 27)；305：1289-1292第8頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三RNAi的主要特點和優(yōu)勢誘導轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默具有高度的特異性抑制基因表達的高效性可在不同細胞之間傳遞甚至傳到子代中去 “

5、基因沉默系統(tǒng)化”第9頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三siRNA 與反義寡核苷酸、核酶、脫氧核酶共同點 特異性 靶向性第10頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三siRNA 與反義寡核苷酸、核酶、脫氧核酶不同點獨特的雙鏈結(jié)構(gòu)需要Dicer、RdRp 、解旋酶、激酶等協(xié)同因子siRNA 本身無催化活性在細胞內(nèi)可能具有相對的穩(wěn)定性具有一定的可遺傳性第11頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三RNAi的主要過程啟動階段 dsRNA (500nt左右最佳)被Dicer 酶特異性識別，以一種ATP依賴的方式逐步切割成siRNA長度：21-2

6、5nt結(jié)構(gòu)：3端懸垂兩個未配對的堿基UU第12頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三細胞中內(nèi)源性dsRNA的形成基因組中DNA 反向重復序列的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物同時轉(zhuǎn)錄反義和正義RNA 病毒RNA 復制中間體以單鏈RNA 為模板由細胞或病毒的RNA 依賴RNA 聚合酶(RdRp) 催化合成dsRNA第13頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三Dicer酶RNAase III超家族成員。結(jié)構(gòu)中包括一個螺旋酶結(jié)構(gòu)域，兩個RNA酶結(jié)構(gòu)域，一個雙鏈RNA結(jié)合位點對單鏈RNA沒有活性對200500nt的dsRNA作用效果最好，能降解成25nt左右的siRNA廣泛存在第14頁

7、，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三RdRp（RNA dependent RNA polymerase）使異常的RNA轉(zhuǎn)變?yōu)閐sRNA參與細胞內(nèi)dsRNA和siRNA的擴增siRNA與靶mRNA 的結(jié)合可激活RdRp，形成大量的dsRNA第15頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三RNAi的主要過程效應階段RNA誘導沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC） 的形成RISC的激活：ATP依賴的解雙鏈過程在siRNA反義鏈的指導下(靶序列的識別），RISC特異性切 割、降解靶mRNA，導致基因表達失活 第16頁，共4

8、8頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三第17頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三RNAi技術(shù)的實驗方法siRNA的設計原則序列大小 19-21nt ，最好以A或G開始從mRNA的AUG開始，尋找AA二連序列，作為潛在的RNAi靶位點不要針對5和3端非編碼區(qū)（untranslated regions，UTRs) 第18頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三RNAi技術(shù)的實驗方法siRNA的設計原則設計24個序列, BLAST 比對基因序列以確保序列設計的特異性優(yōu)先選擇 GC 含量30-50%的序列設計適當?shù)年幮詫φ招蛄械?9頁，共48頁，20

9、22年，5月20日，13點34分，星期三陰性對照序列的設計特異性siRNA中的堿基進行隨機排列，且行BLAST基因比對 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG ATTCGTGCTCAATGCAATCG在特異性siRNA引入12個錯配堿基 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG AGCCTTAGTTTAAATCCTAG第20頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三目標序列篩選的相關(guān)網(wǎng)站/Stu/shilin/rnai.html/sirna.pl/rnai/http:/RNAiD/rnaidesigner/:9331/RNAi/html/rnai.html 第21頁，共48頁

10、，2022年，5月20日，13點34分，星期三查找已經(jīng)證實的siRNA的網(wǎng)站/catalog/category.aspx?key=49/techlib/tb/tb_502.html/mmcmanus/www/siRNADB.html/Order_Entry/jsp/BrowseCatalog.jsp?Category=Published 第22頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三siRNA的制備方法體外制備方法化學合成siRNA體外轉(zhuǎn)錄獲取siRNA利用Dicer或 RNase消化長的dsRNA成siRNA第23頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三化

11、學合成法制備siRNA優(yōu)點： 純度高 合成量不受限 能被標記缺點：價格昂貴、合成周期長用途：已經(jīng)找到最有效的siRNA的情況下，需要大量siRNA進行研究 第24頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三體外轉(zhuǎn)錄法制備siRNA優(yōu)點：簡單 成本低 速度快 毒性小 穩(wěn)定性好 缺點：反應規(guī)模和量始終有一定的限制用途：篩選siRNAs，特別是需要制備多種 siRNAs 第25頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三siRNA的制備方法細胞內(nèi)制備方法依賴表達質(zhì)?；虿《据d體在細胞內(nèi)獲取siRNA通過PCR介導的siRNA表達試劑盒獲取siRNA第26頁，共48頁，202

12、2年，5月20日，13點34分，星期三siRNA載體依賴RNA聚合酶III 啟動子(pol III) ，操縱一段小的發(fā)夾siRNA在哺乳動物細胞中的表達。人源U6啟動子 鼠源的U6啟動子 人H1啟動子pol III可在細胞中表達許多的小分子RNA，通過添加一串（36個）U來終止轉(zhuǎn)錄的需要訂購2段編碼短發(fā)夾RNA序列的DNA單鏈再克隆到載體中 第27頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三表達載體法制備siRNA優(yōu)點：可以進行較長期研究。載體可以在細胞中持續(xù)抑制靶基因達數(shù)星期或更久缺點：需要進行克隆，周期長，質(zhì)粒載體表達效率較低用途：唯一可以用于長期基因沉寂研究的方法第28頁，

13、共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三基于PCR的siRNA表達框架(SECs) 組成：RNA pol III啟動子 發(fā)夾結(jié)構(gòu)siRNA RNA pol III終止位點制備：PCR ，無需克隆和測序第29頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三用SECs制備siRNA優(yōu)點：可直接由PCR得到，方法簡便，時間短在PCR片段兩端添加酶切位點，篩選出 最有效的siRNA可用于構(gòu)建表達載體可以用來篩選特定研究體系中啟動子和siRNA的最適搭配 第30頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三用表達框架制備siRNA缺點：PCR產(chǎn)物很難轉(zhuǎn)染到細胞中不能進

14、行序列測定，PCR和DNA合成時可能產(chǎn)生的誤讀不能被發(fā)現(xiàn)導致結(jié)果不理想 用途：篩選siRNA序列在將siRNA克隆到載體前篩選最佳啟動子 第31頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三第32頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三第33頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三第34頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三shRNA(short hairpin RNA) 文庫 Nature 2004 ；428： 427 - 431 (25 March) 針對：9,610 human genes 5,563 mouse gen

15、es 構(gòu)建成：28,000個shRNA表達盒(cassettes)商品化試劑盒：Expression Arrest(美國冷泉港實驗室 Open Biosystems公司) 網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫中選擇特定的shRNA克隆，無需再耗時耗力進行siRNA的設計、合成和驗證過程第35頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三CAM:氯霉素抗性基因 hr：同源重組位點Barcode：每個shRNA獨特的識別序列 MSCV：病毒載體骨架 PKG-Puro：哺乳動物細胞中載體穩(wěn)定性的選擇Kan、oriT、RK6：逆轉(zhuǎn)錄病毒信號序列第36頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三siRN

16、AshRNA使用代價高相對較低持久性最多2周可選擇獲得穩(wěn)定整合的細胞宿主類型細胞系原代細胞，胚胎干細胞、細胞系設計復雜的設計方法完成獲取需要合成完成應用瞬時轉(zhuǎn)染瞬時轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染、病毒侵染檢測方法Western雜交、表型分析RT-PCR、芯片檢測Western雜交、表型分析、RT-PCR、芯片檢測研究領域細胞培養(yǎng)細胞培養(yǎng)&體內(nèi)研究第37頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三第38頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三第39頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三第40頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三siRNA轉(zhuǎn)

17、染細胞 .磷酸鈣共沉淀 電穿孔法 DEAE-葡聚糖和polybrene 機械法 ：顯微注射和基因槍 陽離子脂質(zhì)體試劑 第41頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三提高轉(zhuǎn)染效率的方法純化的siRNA避免使用抗生素避免RNA酶污染 較低傳代數(shù)的細胞 合適的轉(zhuǎn)染試劑 合適的陽性對照熒光標記的siRNA 第42頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三RNAi技術(shù)的應用基因組功能研究的新方法研究信號傳導通路的新途徑 開展基因治療的新策略 （抗病毒、抗腫瘤等）篩選藥物靶點的新工具第43頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三RNAi技術(shù)抗病毒作用阻止

18、病毒入侵、抑制病毒的復制和轉(zhuǎn)錄自然界中普遍存在在醫(yī)學上的應用RNA病毒：如HIV、HCV、脊髓灰質(zhì)炎病毒DNA病毒：如HBV第44頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三RNAi技術(shù)阻止HIV的入侵Novina將針對CD4的dsRNA導入 能表達CD4、CCR 5、CXCR4的M agi2CCR 5 細胞系），能使細胞表面CD4 表達減少75%；轉(zhuǎn)染后60 小時后, 再用H IV 感染, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD4-siRNA 轉(zhuǎn)染的細胞很少有包涵體出現(xiàn)其它試驗的受體： CCR 5、CXCR4第45頁，共48頁，2022年，5月20日，13點34分，星期三RNAi技術(shù)抑制HIV的復制將HIV-1編碼rev的基因和同源的d