藥典附錄課件

1、高效液相色譜法2005版中國藥典天宇藥業(yè)2007年4月流程高效液相色譜法系采用高壓輸液泵將規(guī)定的流動相泵入裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法。注入的供試品，由流動相帶入柱內(nèi)，各成分在柱內(nèi)被分離，并依次進入檢測器，由數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號。洗脫分等度洗脫和梯度洗脫二種。梯度洗脫，可用兩臺泵或單臺泵加比例閥實現(xiàn)程序控制。色譜信息的收集和處理常用積分儀或數(shù)據(jù)工作站進行。適用范圍高效液相色譜法適用于能在特定填充劑的色譜柱上進行分離的藥品的分析測定，特別是多組分藥品的測定，雜質(zhì)檢查和大分子物質(zhì)的測定。有的藥品需在色譜分離前或后經(jīng)過衍生化反應方能進行分離或檢測。由于應用了各種特性的微粒填料和加壓的

2、液體流動相，本法具有分離性能高，分析速度快的特點。儀器組成高效液相色譜儀由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器和色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)組成。色譜柱 反相 非極性填充劑 常用的有C18 C8 氰基柱 氨基柱正相：極性填充劑，常用的填充劑有硅膠等。離子交換色譜：離子交換填充劑；分子排阻色譜：凝膠或高分子多孔微球等填充劑手性鍵合填充劑用于對映異構體的拆分分析。色譜柱填充劑的性能（如載體的形狀、粒徑、孔徑、表面積、鍵合基團的表面覆蓋度、含碳量和鍵合類型等）以及色譜柱的填充，直接影響待測物的保留行為和分離效果。孔徑在15nm（1nm=10A）以下的填料適合于分析分子量小于2000的化合物，分子量大于2000的化合物

3、則應選擇孔徑在30nm以上的填料。檢測器最常用的檢測器為紫外檢測器UV其他常見的檢測器有二極管陣列檢測器（PDAD、PAD、DAD）熒光檢測器FD電化學檢測器ECD示差折光檢測器RID蒸發(fā)光散射檢測器ELSD質(zhì)譜檢測器等MSD檢測器紫外、二極管陣列、熒光、電化學檢測器為選擇性檢測器，其響應值不僅與待測溶液的濃度有關，還與化合物的結構有關；示差折光檢測器和蒸發(fā)光散射檢測器為通用型檢測器，對所有化合物均有響應；蒸發(fā)光散射檢測器對結構類似的化合物，其響應值幾乎僅與待測物的質(zhì)量有關；二極管陣列檢測器可以同時記錄待測物在規(guī)定波長范圍內(nèi)的吸收光譜，故可用于待測物的光譜鑒定和色譜峰的純度檢查。紫外、熒光、電

4、化學和示差折光檢測器的響應值與待測溶液的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關系，但蒸發(fā)光散射檢測器響應值與待測溶液的濃度通常并不呈線性關系，必要時需對響應值進行數(shù)學轉(zhuǎn)換后進行計算。紫外檢測器紫外檢測器是液相色譜中使用最廣泛的檢測器，幾乎所有的液相色譜儀都配有此類檢測器，是一種選擇性檢測器。紫外檢測器靈敏度高，噪音低，線性范圍寬，對流速和溫度的波動不靈敏，適用于梯度洗脫及制備色譜，但是，紫外檢測器只能檢測有紫外吸收的物質(zhì)，流動相的選擇有一定限制，流動相的截止波長必須小于檢測波長。紫外檢測器工作原理：朗伯-比爾定律，即當一束單色光透過樣品池時，若流動相不吸收光，則吸光度（A）與吸光組分的濃度（C）和樣品池的光

5、徑長度（L）成正比。分類：紫外檢測器包括固定波長檢測器，可變波長檢測器和光電二極管陳列檢測器三類。紫外檢測器可變波長檢測器是目前配置最多的檢測器，光路系統(tǒng)類似于分光光度計，一般采用氘燈或鹵鎢燈為光源，光束經(jīng)單色器分光后按需要組分的最大吸收波長為檢測波長，從而提高靈敏度。有的還具有雙波長比例檢測功能，可用于峰純度檢查。二極管陣列檢測器是一種光學多通道檢測器。在晶體硅上緊密排列一系列光電二極管，每一個二極管相當于一個單色器出口狹縫，二極管越多分辯率越高，一般是一個二極管對應接受光譜上一個納米譜帶寬的單色光。DAD的工作原理是：復色光通過樣品池被組分選擇性吸收后再進入單色器，照射在二極管陳列裝置上，

6、使每個納米波長的光強度轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳碾娦盘枏姸?，即獲得組分的吸收光譜，從而獲得特定組分的結構信息，有助于未知組分復雜組分的結構確定。許多色譜工作站可將兩張色譜圖繪在一張三維坐標圖上而獲得三維光譜色譜圖，也可進行峰純度檢查。以峰純度數(shù)值說明某個色譜峰的純度，數(shù)值越高，色譜峰為單峰的可能性越大；數(shù)值越低，色譜峰為重疊峰的可能性越大，用于指導色譜分離條件的摸索。隨著化學計量學的發(fā)展，將色譜信息和相對應的光譜信息相結合，按一定的數(shù)學模型處理，能解決重疊峰的識別和定量難題。但DAD檢測器的靈敏度比通常的UV檢測器約低一個數(shù)量級。所以單純用于含量測定或雜質(zhì)檢查時，還是采用UV檢測器為好。流動相 由于C18鏈

7、在水相環(huán)境中不易保持伸展狀態(tài)，故對于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動相中有機溶劑的比例通常應不低于5%，否則C18鏈的隨機卷曲將導致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。流動相各品種項下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組成、檢測器類型不得改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長度、固定相牌號、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組成的比例、柱溫、進樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當改變，以適應具體的色譜系統(tǒng)并達到系統(tǒng)適用性試驗的要求。但對某些品種，必須用特定牌號的填充劑方能滿足分離要求者，可在該品種項下注明。流動相的制備用高純度的試劑配制流動相，必要時照紫外光光度法進行溶劑檢查，應符合規(guī)定，水應為

8、新鮮制備的高純水，可用超純水器制得或用重蒸餾水。凡規(guī)定PH值的流動相，應使用精密PH計進行調(diào)節(jié)。配制好的流動相應通過適宜的0.45um的濾膜濾過，用前脫氣。應配制足量的流動相備用。供試溶液的配制 供試品用規(guī)定的溶劑配制成供試品溶液。定量測定時，對照品溶液和供試品溶液均應分別配制二份。供試品溶液在注入色譜儀前，一般應經(jīng)適宜的0.45um的濾膜濾過，必要時，在配制供試品溶液前，樣品需經(jīng)預凈化，以免對色譜系統(tǒng)產(chǎn)生污染或影響色譜分離。色譜柱的理論板數(shù)（n）24在規(guī)定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項下規(guī)定的內(nèi)標物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分峰或內(nèi)標物質(zhì)峰的保留時間tR（以分鐘或長度計，下同

9、，但應取相同單位）和半高峰寬（Wh/2）,按n=5.54(tR/ Wh/2)2計算色譜柱的理論板數(shù)。分離度（R） 2(tR2 tR1) R= - W1 + W2式中 tR2為相鄰兩峰中后一峰的保留時間； tR1為相鄰兩峰中前一峰的保留時間； W1及W2為此相鄰兩峰的峰寬（如 圖）。除另有規(guī)定外，定量分析時分離度應大于1.5。拖尾因子（T） W0.05h T = - 2d1式中 W0.05h 為5%峰高處的峰寬； d1 為峰頂點至峰前沿間的距離除另有規(guī)定外，峰高法定量時T應在0.951.05之間。峰面積法測定時，T值偏離過大，也會影響小峰的檢測和定量的準確度。含量定量方法內(nèi)標法外標法雜質(zhì)檢查法按藥品標準規(guī)定的方法測定雜質(zhì)的含量或限量時，如雜質(zhì)對照品已經(jīng)建立，則可按規(guī)定用上述外標法進行測定；如雜質(zhì)對照品沒有建立，無法獲得，或雜質(zhì)未知，則可按下法測定