分子生物學第七章part1課件

1、1000多種EULEC分別識別不同底物，靈活地降解各種不同的蛋白，協(xié)調各種生理活動 被EULEC識別的N-end aa marker of targeting protein Met, Gly, Ala, Ser, Thr, Val 20 hrs (穩(wěn)定因子) Ile, Glu 30 (不穩(wěn)定因子) Gln 10 Leu, Phe, Asn, Lys 3 (極不穩(wěn)定因子)Arg 2Pro 7N-end aa of targeting protein halflife- 決定與Ubiquitin 發(fā)生isopeptide bond 的難易程度- 決定被 E3 識讀結合難易程度- N 端氨基酸種類

2、對蛋白質壽命的決定性，從原核到 真核生物高度一致 泛素/26S蛋白酶體通路與 植物激素應答 植物抗病反應 植物光形態(tài)建成 高等植物有性生殖 植物環(huán)境脅迫抗性 Molecular BiologyGibberellin Signaling Pathwaya de-repressible system moderated by DELLA-p degradation induced by GA Induce seed germinationGerminating pea seedGerminating maize seeds GAs control plant growth and developm

3、ent Green Revolution 第一次綠色革命； 糧食作物增產(chǎn)20%Norman E. Borlaug Director of wheat program (CIMMYT)1970 Nobel Peace PrizeGreen Revolution Gene Highly conserved in G.R. gene Arabidopsis: (RGA, GAI, RGL1, RGL2, RGL3) maize : (d8), wheat (Rht) rice : (SLR1), barley (SLN1) grape: (VvGAI1), Brassica rapa (BrRGA1

4、)phosphotyrosine binding domainThe DELLA subfamily of GRAS proteinsChoke back growth A conserved and unique N-terminal domain, named DELLA, after a DELLA motif Wild type DELLA proteins localize in cell nuclei and disappear by GA treatment phosphotyrosine binding domain DELLA domain-mutated are resis

5、tant (G.R.gene ) to GA-induced degradation (GA-insensitive) By using immunoblot analysis and GFP fusion protein analysis, it is shown that GA induces rapid degradation of the wild type DELLA proteins, such as GFP-At-RGA GFP-Os-SLR1 GFP-(rga-17) proteins are resistant to GA-induced degradation+H2O+GA

6、3(rga-17 has the same 17AA deletion in the DELLA region as in gai-1)GFP-RGAGFP-(rga-17)GFP-(rga-17)From Dill et al., Proc Natl Acad Sci USA, 2001, 98:14162-14167Scheme of the functional domains of SLR1 for GA signaling pathwayPoly S/T/VFrom Itoh et al., Plant Cell, 2002, 14:57-70 Involvement of the

7、ubiquitin-proteasome pathway in degradation of DELLA proteinsIn response to GA, DELLA proteins are rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome pathwayUbiquitylating enzyme E3 complex NegativeG.R. gene ？) 6.3.真核生物基因表達與調控的特殊模式 以positive control為主的基因表達調控真核生物染色質的狀態(tài)對基因表達的調控m5C與基因表達的相關轉錄后多種方式的加工調節(jié)個體發(fā)育的階段

8、調控 真核生物基因表達調控的特異性6.3.1. mRNA的結構對翻譯水平的調控Leading seq.(5-Untranslation region, UTR)Cap 具有增譯作用Cap + poly(A) 具有增譯的協(xié)同效應Cap對eIF4b的相對濃度的選擇 Shatkin (1976) -m7GpppN(Cap)-AUG flanked seq. effect5 L.S 存在AUG 對第一個AUG密碼的起譯產(chǎn)生負控效應5-AUG-AUG-NNN- L.S錯誤起譯改變讀框降低速率Effect of multiple replicas of the translation initiation

9、 siteimmunoprecipitatd proinsulin-containing polypeptidesthe farthest upstream AUG codon was used which is again consistent with the scanning model-AUG flanked consensus seq (-3A, +4G) Kozak modelKozak (1986) Rat preproinsulin gene under the control of SV40 promoter mutagenized Nt at -3 and +4 posit

10、ion introduction them into monkey cell Effects of single base changes in positions -3(A) and +4(G)Rat preproinsulin gene under the control of an an SV40 promoterKozak Cell 44(31) Jan 1986mutationmutationKozak model35S-MetcapChloramphenicol AcetylTransferase氯霉素乙酰轉移酶Higher stability 62 kca/mollower st

11、ability 30 kca/mol1) 30-kcal stem loop only 12 nt downstream of the cap strongly inhibits translation, because it interferes with binding of the 40S ribosome and factors at the cap. 2) 62-kcal stem loop placed 71 nt downstream of the cap completely blocked appearance of the CAT protein.Why?6.3.2 染色質

12、重建對基因表達的控制表觀遺傳及其分子機制Epigenetic and Molecular MechanismEpigenetic inheritence:The ability of different states, which may have different phenotype consequences, to be inherited without any change in the DNA sequence.在DNA序列沒有發(fā)生任何改變的情況下，不同表型效應具有可以遺傳的能力（Ww in euchromatin）w Ww Red eye （W (near heterochrom

13、atin) be silenced WwWw white eye Position effect of variegation in Drosophila eyes Epigenetic phenomenaSpot eye Cellular Memory : Arabidopsis VernalizationEpigenetic phenomenaOne X chromosome is inactived at randomparental imprinting BCDAAllelic interaction (paramutation)- Position-effect variegatio

14、n - Inactivation of chromosome X- Cell-type conversion- Allelic interaction (paramutation)- Transgene silencing- Parental imprintingCell memory: VernalizationHeterosis?。縀pigenetic phenomena染色質結構的調整核小體的松弛組蛋白的乙?；M蛋白的甲基化沉默子.染色質重建 Chromatin RemodelingEpigenetic and Molecular Mechanism Basic unit of chro

15、matin Nucleosome (-body 200bp)Histone 1 + linker DNA of 20-60bp (diff. From diff. creature)2 H2A H2B H3 H4 Octamer + core DNA of 146 bp1.75 cycle 染色質結構6nm11nm30 nm10nm fibreHeterochromatinEuchromatin組蛋白中富含 Lys+, Arg.+ 量大， 進化保守， 與DNA 無專一性結合區(qū)N端外露Arg與DNA14個小溝結合富含Lys的 N端（特別是H4）能保證Histone間的穩(wěn)定性和與DN

16、A的結合N端磷酸化、乙?；饶芙档徒M蛋白正電荷，使組蛋白間以及與DNA的結合狀態(tài)發(fā)生 松弛Histone acetyltransferase (HAT) Histone deacetylase (HDAC)Histone methyltransferase (HMT)LysArgLysSerLysHistone Codon Histone code組蛋白一個位點的修飾可以激活或抑制另一個位點的修飾，這種信號的組合可以寓意染色質的類型與性質。這種組合也被稱為組蛋白密碼 chromatin 狀況與基因表達相關Euchromatingene onHeterochromatingene

17、offHeterochromatin；Constitutive Heterochromatin: 組成型異染色質除DNA復制以外，一直處于高度致密的固縮狀態(tài)，DNA從不轉錄（高度重復序列，著絲點，端粒等） Facultative Heterochromatin: 特異型異染色質有時處于異染色質狀態(tài)，有時為常染色質狀態(tài)轉錄活化區(qū)/ 非轉錄活化區(qū) chromatin 的結構差異 DNaseS Nucleosome incomplete No Histone1 in linker DNAin transcriptional activated region 表達非常活躍的rDNA 區(qū)無核小體 結構

18、凡被Trans-factor 結合的區(qū)域 均能阻止nucleosome再形成 H2A、 H2B,、H3、 H4 acetylated降低組蛋白的正電荷組蛋白解聚-body松弛80%H3, H4 乙?；?丁酸鈉（去乙?；敢种苿〩ela cell基因高效表達Pazin Kadonaga 1997 Cell. 89: 325-328 從酵母中分離出 組蛋白去乙?；窤B 以及相應的催化組分 HDAC1RPD3 HDAC1RPD3基因突變導致H3/H4超乙酰化 引起基因高效表達Over acetylationModel for participation of histone deacetylas

19、e in transcription repressionhistone deacetylase cooperator HDAC1 Nucleosome relaxedNucleosome reconstructedHistone methylation causes inactive chromatinHeterochromatin protein 1 分離得到與甲基化DNA結合 抑制轉錄的MeCP2Jones P.L. 1998. Methylated DNA and MeCP2 recurit histone deacetylase to repress transcription .

20、Nature Genet. 19: 187-191組蛋白去乙?；窤 (dHAT-A)dHAT-A的催化因子(SIN3)MeCP2(m5C結合蛋白)complexMeCP2SIN3dHAT-AMeCP2與m5C結合阻止TFII與DNA結合Histone去乙酰化作用, 重建核小體抑制基因表達Histone methylation causes inactive chromatinHeterochromatin protein 1HP1 may propagate heterochromatinInactive Chromatin. m5C對基因表達的調控a) m5C是真核生物 DN

21、A中的主要修飾成分 多發(fā)生在CpG序列中,不同細胞間m5C 相差甚大胚胎細胞與特化體細胞相差106b) m5C對基因轉錄抑制的表現(xiàn) DNA大溝內的m5C 影響與T.F.間氫鍵的形成 DNA大溝內的m5C 導致空間擁擠,破壞構象的平衡 使B-DNA Z-DNA T.F. 結合空間的改變 染色質重建 降低轉錄因子與DNA的結合Genome and gene imprint in Eukaryots一定組織和細胞中，某些基因在DNA水平上的表達程度及表達時空受到一種“后成修飾，表觀修飾”（epigenetic modification 相同的DNA結構，不同的表型）機制控制。使僅來自雙親中某一親本的

22、基因得以表達 。這一現(xiàn)象也稱為“基因組印記”DNA 的甲基化、異染色質化是“imprint” 的重要機制染色體區(qū)域性印記中相鄰印記基因具有“相反”的印記作用模式 父本基因印記 母本基因印記 合子及幼胚期，DNA去甲基化程度高，gene imprint被抑制，表現(xiàn)了細胞的“全能性” Genome / gene imprint表現(xiàn)的特點 Genome imprint具有染色體區(qū)域性或整體性 印記現(xiàn)象具有組織細胞的特異性 基因印記的發(fā)生常與該基因的編碼區(qū)， 啟動子區(qū)及其上下游的CpG序列甲基化相關Genome / gene imprint表現(xiàn)的特點 印記效應會因去甲基化而消失 (水稻白葉枯病成株抗性

23、？)One X chromosome is inactived at randomTwo X chro. Euchromatin in 16 day precursor cellOne X chro. inactived at randomVariegation Prader-willi癥(PWS)：肌肉無力、矮小、神經(jīng)疾病 Argelmen癥（Ag）：平衡性差、過分興奮與發(fā)笑 共同的病因：15q11-q13 缺失，基因型相同子女的 父 父染色體 母 母 病癥： Ag PWS 母本基因印記 父本基因印記 被異染色質化的X染色體 常染色質化 導致雌性哺乳動物宮頸癌，胃癌雙重遺傳病因：缺失 / 印

24、記3 types of modification affect chromatin甲基化的CpG序列可招募組蛋白去乙酰化酶，抑制基因的表達。 Vernalisation植物低溫春化現(xiàn)象的分子機理AfterVernalization FLC Leafy MADS FloweringFLC methylationN5-C 的春化效應Without Vernalization FLC Leafy MADS Flowering低溫春化處理消除對MADS Box基因表達的負控制效應Vernalization低溫春化 引起脫乙?；⒓谆揎?導致異染色質化Regulation of the floral

25、 repressor FLC by histone deacetylation (FLD)yesNoNoACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAC mut.- Chromatin structureand remodeling- DNA methylation- Histone modification (Ac & Me)- Relationship between DNA Me and HistoneMe - Creation of repressive domain - ncRNA- Heterochromatin formation Chromati

26、n modification & remodeling as the epigenetic basis No-coding RNA ncRNA 看家RNA rRNA，tRNA，UsnRNA，telomere RNA. 調節(jié)RNA microRNA（miRNA），siRNA， anti-sense RNA.What is microRNA?MicroRNAs are a newly identified class of small single-stranded non-coding RNAs;MicroRNAs regulate their target genes via two main

27、 mechanisms: target mRNA cleavage translational repression.The characters of miRNALength: 18-25 nt;Single-strand;Conserved among species;Encoded by internal DNA sequences, which are located in the whole genome, mostly in the interval regions of coding genes, centromeres, or, occasionally in the intr

28、ons;Temporally and tissue-specifically expressed The biogenesis of miRNAReview: Geogre S Mack, Nature Biotech., 2007dsRNA由Dicer加工成21NtsiRNA，在RDRP的作用下可以擴增，siRNA與靶mRNA來源與同一基因60100nt，3具有2Nt突起莖環(huán)結構的premiRNA，由Dicer加工成一條雙鏈的21miRNA，與靶mRNA來自不同的基因 siRNA miRNA來源于mRNA，病毒RNA，轉座子，外源RNA來源于基因組內的microDNA、剪切的intron.（

29、內源性）與靶基因可不完全配對，因此可調控若干不同的基因在近緣物種間具有較高的保守性與靶基因完全配對，專一性強不同內源siRNA具有較大的差異與mRNA結合，或剪切mRNA，抑制翻譯，沉默基因表達(特別是轉錄因子)。 進入RISC體系，在轉錄后水平上沉默基因表達進入RISC體系降解靶mRNA，轉錄后水平上沉默基因表達，RNAi works by generating siRNADicerRISC置換Lin14蛋白調節(jié)秀麗新線蟲的幼蟲發(fā)育，但受lin4基因的控制Lin4 編碼22Nt的microRNA, 與Lin14mRNA3端非翻譯區(qū)出現(xiàn)7次重復的10Nt序列互補，抑制Lin14蛋白的翻譯 co

30、mmon mechanism for microRNA, RNAi and heterochromatin formation . Programmed Cell Death (PCD) and development2002 Nobel Prize John Sulston USA Sydney Brenner Japan 田中 耕一 H. Robert Horvitz Switzerland 細胞的“生”發(fā)育、分裂、繁殖、分化、成熟細胞的“死”. ?- 高等生物的誕生發(fā)育成長死亡 即壽命是生物固有的特征- 死亡是生物體不可缺少的生命內容 是生物借以存活的需要 并貫穿壽命的全部

31、周期中PCD gene 的發(fā)現(xiàn)與克隆人類長壽癌癥發(fā)生提高產(chǎn)量- 細胞死亡的發(fā)生及過程是在長期進化中已形 成的遺傳程序（PCD） 這一程序表達的失控個體發(fā)育受阻 、病變、 畸形、蹼趾、有尾.癌癥（白血病）-細胞周期變短, 增殖過快, pcd失控, 細胞死亡速率變低細胞增殖與細胞死亡平衡失調癌癥的發(fā)生-皮膚, 指(趾)甲(細胞從有生命經(jīng)PCD向無生命的轉化)pcd無皮，無鱗，無爪失去保護與防御功能-pcd 白細胞不分化，不死亡，不代換41天51天在細胞自身遺傳程序的控制下，有關基因的正常表達，細胞裂解成apoptotic bodies, 逐漸死亡的現(xiàn)象a) PCD的概念細胞的死亡； necrosi

32、s (accidental cell death) 壞死外因細胞急速死亡，病變死亡 Programmed Cell Death (PCD)或 Apoptosis 凋亡 細胞程序性死亡Apoptosis細胞變園變小與鄰近細胞脫離胞漿濃縮染色質凝集成月牙狀內質網(wǎng)擴張成泡狀并與膜融合PCD的細胞學特征膜內陷，細胞呈沸騰運動，細胞自行解體成若干有膜包圍，內容物不外溢的凋亡小體被巨噬細胞吞噬核內DNA被核酸酶在核小體單位間降解電泳檢測呈 ladder of 180-200bp apoptotic bodiesApoptosis: active cell death; cell suicideNecros

33、is: accidental cell death; cell murder images of nuclei from apoptotic and necrotic cells 促進PCD的基因Ces (cell death specification)細胞凋亡特異基因p53抑癌基因Caspase（半胱氨酸酶家族，蛋白降解途徑）. 抑制PCD的基因LAP (inhibitor of apoptosis) 凋亡抑制劑基因Cystatin.b) 與PCD相關的基因Caspase, p53 pathwaycystatinBI-1植物的PCD表現(xiàn)與機制 植物抗病的過敏性反應Hypersensitiv

34、e Response PCD枯斑的形成 花藥的發(fā)育（CMS？） 木質部的分化 絨氈層的退化 禾本科植物胚乳的發(fā)育 缺氧條件下誘導的玉米根部通氣組織的形成與根冠的形成具有與動物細胞相似的 細胞學表型與生化特征植物PCD的相關基因與機制 半胱氨酸酶家族（Caspase） 衰老葉片，果實，花器發(fā)育中木質部的形成Caspase 乙烯在PCD中起重要作用 缺氧條件下，乙烯誘導玉米根部胞內Ca+增加 氣生組織的形成 小麥胚乳形成中，乙烯調節(jié)DNA降解 acd1,acd2（accelerated cell death）基因 Acd負控制Arabidopsis HR誘導的 PCD過程-植物抗病的PCD表現(xiàn) A

35、cd (Accelerates Cell Death) Lsd (Lesions Stimulating Disease Resistance)Programmed Cell Death Neg. controlConstitutivePathogenPlantPCD 負調控關閉PCD系統(tǒng)表達Oxidative burstH2O2 , -OH , O-22 升高NADPHoxidaseAcd/Lsd repressor 失活枯斑停止擴大高濃度H2O2 消失枯斑形成限制病原物擴展H2O2 induced cytoplasm shrinkage, a typical marker of plant

36、 PCD.在發(fā)育進程中，PCD何時啟動？如何決定 某一細胞執(zhí)行PCD?機體內是否存在真正殺手基因（killer gene）?Killer只在PCD細胞中表達！其產(chǎn)物可使細胞走向死亡！PCD的信號，傳遞？ Prok.與Euk.基因結構及表達的差異 Repetitive gene Overlapping gene Retro-transposon Non-coding region (function?) Splitting geneEukaryote ProkaryoteDNA，RNA, protein DNA + histone chromatin Naked DNA and chromati

37、n Remodeling Enhancer & Silencer Attenuater Monocistron polycistron (operon) m5C gene off acetylationphosphorylationmathylation glucosylationT.Factive formEukaryote Prokaryote Post-transcription Transcription & translation RNA processing Synchronizely Housekeeping gene(constitutive)Basic promoter +

38、T.F. Luxury gene (inducible) 多種組合的Trans-Factor Multiple gene familyCluster gene Quantitative Trait loci Positive control 嚴謹性，?；?，復雜性single gene(cAMP + CAP) site +UPE + pribnow box 單一類型保險性 Negative controlEukaryote Prokaryote 多細胞生物單細胞生物 細胞分化, 組織特化, 個體發(fā)育結構簡單 遺傳，代謝復雜遺傳，代謝簡單 線粒體，葉綠體質粒（plasmid）Eukaryote

39、 ProkaryoteCell 細胞膜外界信息的感知與傳遞細胞信號傳遞細胞核第7 章 基因突變與交換 Gene Mutation &Crossing-Over7.1. Point mutation 的類型 7.2. 突變發(fā)生的機理7.3. 保證遺傳穩(wěn)定的機制7.4. 基因重組交換的分子生物學7.1. Point mutation 的類型 dNt insertion or deletion Indel = 3 dNt n Amino acid = 3 dNt Framshift conversion (取代)transition(轉換) Py Py Pu Pu transvertion(顛換)

40、Py Pu conversion effect -Samesense mut. GAA(E) GAG(E) -Missense mut. GAA(E) AAA(K) -Nonsense mut. GAA(E) TAA(stop) 南京大學田大成等發(fā)現(xiàn)的遺傳突變新效應 Nature，doi:10.1038/nature07175，Dacheng Tian，Jian-Qun Chen第一，基因組各區(qū)域的突變率很不相同， Indel的數(shù)量和密度是度量自發(fā)突變發(fā)生位點的重要標準；第二，生物多樣性的最初變異主要源自Indel；第三，自然選擇在很大程度上是通過對Indel的選擇而實現(xiàn); 突變的表達類型 -

41、獲得突變型是遺傳學研究的重要前提 -非條件型突變； allele in DNA level (RFLP, RAPD) allele in phenotype (紅花/白花，糯/非糯) 條件型突變； 突變的表現(xiàn) = 突變基因型 + 誘導條件 （光，溫敏感不育，Ts, su-） 突變的表達類型 無效突變 Null mutation： 完全消除了基因功能的突變（缺失） 功能喪失型突變（loss-of-function mutation） 無效突變或其他阻止基因功能的突變 功能獲得型突變（gain-of-function mutation） 突變使蛋白質獲得新的功能 沉默突變（silent mutat

42、ion） 沒有明顯表型效應改變的突變 突變的表達類型 DNA level RAPD F1 ? RFLP F1 ? Protein level F1 ? 7.2. 突 變 發(fā) 生 的 機 理 (自發(fā)突變，誘發(fā)突變) 7.2.1. 自發(fā)突變 . 堿基異構式引起DNA復制過程的錯誤 a) 堿基異構式 A(amino) A(imino) C(a) C(i) G(keto) G(enol) G(k) G(e,i) T(keto) T(enol-2) or T(enol-4) A(a)A(i)C(a)C(i)G(k)G(e)G(e,i)T(k)T(2e)T(4e)b) 堿基異構式引起DNA復

43、制的錯配 堿基異構式引起DNA復制的錯配 堿基異構式引起DNA復制的錯配 A(a) T(k) G(k) C(a) 正確配對 錯誤配對 G(k) T(e) A(a) C(i) A(i, anti) A(a, syn) A(i, anti) G(k, syn) G(e,i, anti) G(k, syn) G(e,i, anti) A(a, syn) A(i) C(a) G(e) T(k) C(i) A(a) T(k) A(a, anti) T(k, anti) C (a, anti) A(a) A (a, anti) 堿基異構式引起DNA的錯配突變 C(i)C(a)G (k, syn) G (k