蜈蚣多糖對Hela細胞的增殖抑制作用研究

1、蜈蚣多糖對Hela細胞的增殖按捺作用研究李興暖韓雅莉余衛(wèi)國【摘要】目的研究蜈蚣多糖對人宮頸癌細胞Hela細胞的按捺作用及作用機制。要領(lǐng)用TT法檢測蜈蚣多糖對Hela細胞生長的按捺作用；流式細胞儀和AnnexinV-FIT/PI雙熒光染色別離檢測蜈蚣多糖對Hela細胞周期及凋亡環(huán)境的影響。結(jié)果在必然濃度范疇內(nèi)蜈蚣多糖可明顯按捺Hela細胞的增殖，改變Hela細胞的細胞周期，使細胞停滯于G2/期，并能誘導(dǎo)細胞凋亡。結(jié)論蜈蚣多糖大概通過改變Hela細胞的細胞周期，誘導(dǎo)細胞凋亡，從而對Hela細胞的增殖有必然的按捺作用?！娟P(guān)鍵詞】蜈蚣多糖；細胞周期；細胞凋亡Keyrds:PlysaharidefrSl

2、pendrasubspinipesutilans;ellyle;ellapptsis少棘蜈蚣SlpendrasubspinipesutilansL.Kh別名百足,屬節(jié)肢動物門，多足綱，唇足目，螟蚣科動物，為?中國藥典?紀(jì)錄的正品藥材，為我國傳統(tǒng)的鎮(zhèn)痙、通絡(luò)類藥物。故國醫(yī)學(xué)紀(jì)錄和臨床理論均已證實其具有平靜熄風(fēng)、通絡(luò)止痛、解毒散結(jié)等藥用成果1。當(dāng)代藥理實行也證實白蜈蚣具有抗腫瘤和抗動脈粥樣硬化等作用2,3，臨床用于治療腫瘤以及心腦血管病等癥。傳統(tǒng)中藥均以整蟲入藥，但蜈蚣體內(nèi)身分龐大，且有用身分尚不明白，無法對其藥理作用做進一步研究。為了探究蜈蚣抗腫瘤作用，本文以少棘蜈蚣為質(zhì)料，對其體內(nèi)多糖舉行了分

3、散純化，并進一步對其舉行了Hela細胞增殖的作用的研究，為進一步探究蜈蚣抑瘤作用機制奠基基矗1質(zhì)料1.1質(zhì)料少棘蜈蚣SlpendrasubspinipesutilansL.Kh購自汕頭市恒青藥店，由廣東產(chǎn)業(yè)大門生藥研究室對其舉行種類斷定。人宮頸癌Hela細胞，由汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子病理實行室提供，微血管內(nèi)皮細胞VE，由汕頭大學(xué)多學(xué)科研究中央提供。1.2試劑與儀器DEAE-52為hantan公司產(chǎn)物；1640造就基、胰卵白酶、噻唑蘭TT、碘化丙啶PI均購自Siga公司；AnnexinV-FIT/PI凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技能；新生牛血清購自杭州四序青生物。TherLabsystes酶標(biāo)儀T

4、her公司；ShelLab二氧化碳造就箱；EpisXL流式細胞儀Bakanulter公司；倒置顯微鏡、熒光顯微鏡lypus公司；Niknlpix4500數(shù)碼相機。2要領(lǐng)2.1蜈蚣多糖(plysaharidesfrSlpendrasubspinipesutilansL.Kh,SSP)的制備少棘蜈蚣87g研缽磨碎，參加1000l蒸餾水90恒溫水浴攪拌4h，過濾，殘渣參加500l蒸餾水，重復(fù)上述步調(diào)，過濾，歸并濾液，濃縮濾液。取上清液，加5倍體積95乙醇4靜置留宿，離心，去上清液，沉淀用少許蒸餾水溶解。Sevag法去卵白數(shù)次4，將去卵白溶液透析枯燥，過DEAE-52離子互換纖維素色譜柱，以0.05，

5、0.1，0.2，0.4和1lL-1Nal舉行階段洗脫，共得到3個糖峰，此中濃度0.05lL-1的Nal洗脫峰糖含量最高，網(wǎng)絡(luò)此組分透析枯燥，待用。2.2Hela和人微血管內(nèi)皮細胞(Huanirvasularendthelialell,VE)的造就取對數(shù)生恒久的Hela和VE細胞接種于含10小牛血清的1640造就基中，接種濃度為5105個/l，置37，52濃度，飽和濕度的二氧化碳造就箱中造就24h。去原造就基，參加含有SSP濃度別離為0，0.5，1，1.5，2，4g/l的維持液含1.5小牛血清的1640造就基，置造就箱中繼承造就24h和48h后舉行實行。2.3蜈蚣多糖SSP對Hela細胞增殖的影

6、響取對數(shù)生恒久Hela細胞按上述要領(lǐng)接種于96孔板中，貼壁造就24h，去原造就基，參加含有0.5，1，1.5，2，4g/lSSP維持液，總體積為200l，別離造就24，48h后取出，每孔參加TT20l繼承孵育4h，吸去上清，參加200l二甲基亞砜，振蕩15in，酶標(biāo)儀檢測570n波長下各孔吸光值A(chǔ)，按以下公式盤算細胞增殖按捺率。細胞增殖的按捺率%1實行組A值/比較組A值100取VE細胞作為正常細胞比較，實行要領(lǐng)同上。2.4蜈蚣多糖SSP對Hela細胞周期的影響取對數(shù)生恒久Hela細胞，接種到50l造就瓶中，按上述要領(lǐng)造就，貼壁造就24h后取出，參加含有SSP濃度別離為0.5，1，1.5g/l維

7、持液中，造就24，48h后通例消化網(wǎng)絡(luò)細胞，用PBS洗濯3次，參加70預(yù)冷乙醇4結(jié)實留宿，離心去乙醇，用PBS洗濯兩次，RNaseA50g/l37消化30in，PI染色后上機檢測細胞周期變革5。2.5蜈蚣多糖對SSPHela細胞凋亡的影響將蓋玻片切成4塊，參加12孔板中，取100l5104個/l的細胞懸液加到玻片上，4h后待細胞貼壁后再參加900l造就基，繼承貼壁造就20h。去掉原造就液，用PBS洗濯3次后，參加含0.5，1，1.5g/lSSP維持液，24h后，將玻片取出放入AnnexinV-FIT/PI染液中染色15in，熒光顯微鏡下不雅察并照相6。2.6統(tǒng)計學(xué)要領(lǐng)實行所得數(shù)據(jù)均表現(xiàn)s的情勢

8、,數(shù)據(jù)用SPSS11.0軟件統(tǒng)計，差異濃度處置懲罰組之間舉行t查驗，當(dāng)P0.05為差異明顯，P0.01為差異極明顯。3結(jié)果3.1蜈蚣多糖SSP對腫瘤細胞增殖的影響見表12。實行結(jié)果表白，在必然劑量范疇內(nèi)SSP對Hela細胞增殖有按捺作用。由表1所示，作用24h時，0.5，1，1.5和2g/lSSP對Hela細胞增殖有顯著按捺作用；而SSP為4g/l時，對Hela細胞增殖有促進作用；作用48h時，0.5，1和1.5g/lSSP對Hela細胞增殖有必然按捺作用，2和4g/lSSP對Hela細胞有促進作用。表白SSP在24h內(nèi)對Hela細胞按捺作用較強，且在低劑量下按捺作用顯著。表1SSP對Hela

9、細胞的影響略表2為同樣條件下SSP對正常細胞VE增殖的影響。作用24h時，0.5，1，1.5g/lSSP對VE細胞增殖按捺作用不顯著；作用48h，各劑量SSP對VE細胞均具有促進增殖作用。說明SSP對腫瘤細胞的按捺作用較正常細胞顯著。表2SSP對VE細胞的影響略3.2蜈蚣多糖SSP對Hela細胞周期的影響流式細胞儀檢測結(jié)果表現(xiàn)，作用24h時，各劑量SSP組G2/期細胞所占比例均顯著多于比較組，但各劑量SSP處置懲罰48h時各時相細胞所占比率與比較組比力差異不明顯。說明在24h范疇內(nèi)SSP對Hela細胞作用明顯。表3SSP對Hela細胞周期的影響略3.3蜈蚣多糖SSP對Hela細胞凋亡的影響細胞

10、凋亡早期細胞膜上產(chǎn)生PS磷脂酰絲氨酸外翻，標(biāo)識表記標(biāo)幟了FIT的AnnexinV能與PS外翻的細胞結(jié)合產(chǎn)生綠色熒光，PI可以透過凋亡晚期細胞或殞命細胞的細胞膜，使其細胞核染成赤色。實行結(jié)果見圖1，空缺比較組僅有少量細胞著綠色熒光，說明PS外翻很少，細胞沒有出現(xiàn)凋亡的特性。而3個SSP處置懲罰組均有較多細胞著綠色熒光和少量細胞著赤色熒光，說明細胞PS外翻嚴(yán)峻，均產(chǎn)生了必然程度的細胞凋亡和殞命。4討論已有資料報道蜈蚣油性提取物可以或許按捺肝癌細胞的增殖7，蜈蚣含有類組胺物質(zhì)的構(gòu)造提取物對胃癌、肝癌細胞有按捺作用8，而對SSP組分按捺腫瘤的研究如今尚未見有報道。細胞增殖實行結(jié)果表現(xiàn)，SSP對Hela

11、細胞增殖有顯著按捺作用。為進一步分析SSP按捺Hela細胞增殖的機制，我們從細胞周期角度深化研究。由流式細胞儀檢測結(jié)果表現(xiàn)，SSP可使G0/G1和S期細胞淘汰，而G2/期細胞增多，提示SSP可改變Hela細胞增殖生長周期，使細胞停滯于G2/期，按捺細胞周期歷程。凋亡是細胞固有的自動滅亡歷程，在維持構(gòu)造穩(wěn)態(tài)中起著極緊張的作用，細胞凋亡受阻是導(dǎo)致腫瘤發(fā)病和耐藥的重要病理學(xué)底子之一，腫瘤細胞周期的改變通常和細胞的凋亡有關(guān)，AnnexinV-FIT/PI雙熒光染色檢測結(jié)果表現(xiàn)SSP可使Hela細胞的凋亡增長，表現(xiàn)了SSP誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的作用。TT法檢測細胞增殖和流式細胞術(shù)檢測細胞周期均表現(xiàn)SSP對H

12、ela細胞的影響，在藥物處置懲罰24h較48h結(jié)果顯著，說明SSP對Hela細胞的有用作用時間短；SSP對Hela細胞的按捺作用濃度僅在必然范疇內(nèi)其作用1.5g/l擺布，濃度過高會促進細胞增殖，其機理如今尚不明晰，有待于進一步實行證實?！緟⒖嘉墨I】1王賢純.蜈蚣的藥用研究希望J.動物學(xué)雜志,2002,37(3):88.2周永芹,韓莉.中藥蜈蚣的研究希望J.中藥材,2022,31(2):315.3張艷慧,司秋菊,王鑫國.蜈蚣抗家兔動脈粥樣硬化的實行研究J.中藥藥理與臨床，2022，21(1):26.4董英,張艷芳,孫艷輝.水飛薊粗多糖脫卵白要領(lǐng)的比力J.食品科學(xué),2022,28(12):82.5BenP,ytetry.Ahighthrughputapprahte