NQAD檢測原理及應用

1、從基礎(chǔ)到最新應用先端科學事業(yè)推進部 技術(shù)中心北京經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)景園北街2號BDA國際企業(yè)大道31號(100176)TEL： FAX：資色譜知識講座1新的通用型檢測器是什么檢測器（Nano Quantity Analyte Detector）納克級（水凝粒子）激光計數(shù)檢測器一般來說，選澤性和靈敏度是檢測器最重要的兩個要素。NQAD是通用型、高靈敏度檢測器，適用于幾乎所有物質(zhì)（揮發(fā)性物質(zhì)除外）的檢測。 FL ECDUV (PDA)MS適用于：1) 沒有紫外吸收的物質(zhì)2) 離子化比較難的物質(zhì)3) 沒有電化學活性的物質(zhì)4) 性質(zhì)不明的物質(zhì)等能夠檢測所有不揮發(fā)性及半揮發(fā)性物質(zhì)ng級的高靈敏度從ng到g，

2、寬的動態(tài)響應范圍使用干燥空氣，更加環(huán)保操作簡便、外觀設(shè)計更加緊湊2的檢測原理検出凝縮噴霧汽化使用空氣（或氮氣）通過霧化器進行噴霧。流動相和其他揮發(fā)性成分在蒸發(fā)器中汽化剩下的不揮發(fā)、難揮發(fā)物質(zhì)顆粒進入到WCPC。在水蒸氣飽和環(huán)境下，以該顆粒為核，水分凝聚體生成，并長大到微米水平。激光計數(shù)器計數(shù)水分凝聚體。核物質(zhì)的性質(zhì)對靈敏度影響不大，信號響應基本只與質(zhì)量濃度相關(guān)。（Water-based Condensation Particle Counter）（水凝聚粒子計數(shù)器）3摩爾濃度 0.05 mmol/mL質(zhì)量濃度 10 mg/mL甘氨酸精氨酸甘氨酸精氨酸 甘氨酸 （分子量 76） 精氨酸 （分子量

3、 175）摩爾濃度0.05 mmol/L質(zhì)量濃度10 mg/mLMinutes2.02.53.03.54.0mVolts0204060Minutes2.02.53.03.54.00204060摩爾濃度0.05 mmol/L質(zhì)量濃度10 mg/mL峰面積隨分子量增加而增大與分子量無關(guān)，峰面積幾乎不變峰面積與濃度的關(guān)系4檢測凝結(jié)噴霧汽化檢測荷電噴霧汽化檢測噴霧汽化激光電散射與同類（氣溶膠型）檢測器的比較-原理直接計數(shù)粒子CAD檢測粒子的電荷量（電霧式檢測器）ELSD檢測粒子造成的光散射量（蒸發(fā)光散射檢測器）5與同類檢測器的性能比較 NQAD v.s. ELSD1 = Lauric Acid, (月

4、桂酸)2 = Palmitic Acid （棕櫚酸）3 = Stearic Acid （硬脂酸）4 = Arachidic Acid （花生四烯酸）靈敏度：NQAD的靈敏度較ELSD高12個數(shù)量級 線性 ：NQAD基本可達線性響應(y=kx+b)；ELSD對數(shù)線性響應(y=klgx+b)重現(xiàn)（穩(wěn)定）性：NQAD的粒子擴大效應帶來重現(xiàn)性和穩(wěn)定性的大幅提高6與同類檢測器的性能比較 NQAD v.s. CADVS7Application 堿性化合物、酸性化合物 高分子（多糖：分子量103106） 蛋白多肽（分子量103105） 糖蛋白 生物樣品 親水性化合物（單糖，二糖，糖醇） 和LC-MS/MS的

5、比較8堿性化合物【min】HPLC ConditionsColumn: CAPCELL AK C18 MGIII S5 ; 4.6 mm i.d. x 150 mmM.Phase: 20 mmol/L HCOONH4，0.1vol% HCOOH / CH3OH = 50 / 50 Flow rate: 1.0 mL/minTemp.: 40 Detector: NQAD 5600 (Evap. 35，Neb. 30）Inj.vol.: 10 mLSample: 100 ng each.普魯卡因奎寧地芬尼多維拉帕米地布卡因1. 普魯卡因2. 奎寧3. 地芬尼多4. 維拉帕米5. 地布卡因 約CV

6、15%峰面積的響應檢出下限 （LOD）： 1.55 ng標準曲線的相關(guān)系數(shù) （） ： 0.9900.999 (0.15 mg)0123456789101112131415161718192012345通過比較峰面積，可看出響應幾乎一定9酸性化合物低級脂肪酸HPLC ConditionsColumn: CAPCELL AK C18 MGIII S5 ; 4.6 mm i.d. x 150 mm M.Phase: 0.1vol% HCOOH / CH3OH = 90 / 10 Flow rate: 1.0 mL/minTemp.: 40 Detector: NQAD 5600 (Evap.35，N

7、eb.30）Inj.vol.: 10 mLSample: 500 ng each.500 ng each on column對小分子化合物展示了與UV相同的檢測能力。對于衣康酸，和UV相比，NQAD的靈敏度更高。1. 富馬酸2. 沒食子酸3. 衣康酸4. 對羥基苯甲酸5. 香草酸12345PDA(Max plot)衣康酸10對于GPC用標準物質(zhì)（pullulan）的響應 (M.W.5800853000）高分子多糖分子量85萬以上時，響應有減少的趨勢111. 核糖核酸酶A(13.7 kDa)2. 細胞色素C(12.4 kDa)3. 溶菌酶(14.3 kDa)4. 牛血清白蛋白 (69.0 kDa

8、)5. 肌紅蛋白 (17.0 kDa)6. 卵清蛋白 (45.0 kDa)標準蛋白 （分子量萬）min024681012141618202224mV-50050100150200250300350400450Minutes024681012141618202224mAU-600-400-20002004006008001000HPLC ConditionsColumn: Proteonavi ; 4.6 mm i.d. x 150 mmM.Phase: A) 0.1 vol% TFA , B) CH3CN B 20% (0 min) 70% (25 min) 20% (25.1 min) 20

9、% (40 min) Flow rate: 1.0 mL/minTemp.: 40 Detector: NQAD5600, UV220nm Inj.vol.: 10 mLSample: 10 mg123456裝置構(gòu)成：NQAD，PDA分別檢測PDA理論塔板數(shù)理論塔板數(shù)理論塔板數(shù)約2倍因為沒有樣品池容積這一概念使用NQAD，揮發(fā)性雜質(zhì)消失檢測限約500 ng12多肽標準品PDAHPLC ConditionsColumn: Proteonavi ; 4.6 mm i.d. x 150 mmM.Phase: A) 0.1 vol% TFA , B) CH3CN B 15% (0 min) 30% (

10、20 min) 15% (20.1 min) 15% (35 min) Flow rate: 1.0 mL/minTemp.: 40 Detector: NQAD5600, UV220nm Inj.vol.: 10 mLSample: 100 ng each.裝置構(gòu)成：NQAD+PDA串聯(lián)1234561. 蛋氨酸腦啡肽 (M.W.574)2. 緩激肽 (M.W.1064)3. 亮氨酸腦啡肽 (M.W.556)4. 血管緊縮素II (M.W.1046)5. 神經(jīng)緊張素 (M.W.1673)6. 血管緊縮素I (M.W.1296)基線漂移的影響減少與PDA靈敏度相當100 ng each on c

11、olumnPDA漂移13多肽翻譯后修飾的識別 根據(jù)S/ N，統(tǒng)一了縱軸Minutes051015202530354045505560mV0500100015002000HPLC ConditionsColumn: Proteonavi ; 4.6 mm i.d. x 150 mmM.Phase: A) 0.1 vol% TFA , B) CH3CN B 10% (0 min) 50% (70 min) 10% (70.1 min) 10% (85 min) Flow rate: 1.0 mL/minTemp.: 40 Detector: NQAD5600, PDA 214nm Inj.vol.

12、: 10 mLSample: Fetuin Minutes051015202530354045505560mAU0500100015002000PDA糖蛋白的糖鏈部分UV吸收弱，使用NQAD比PDA靈敏度高 NQAD更容易識別糖蛋白裝置構(gòu)成：NQAD+PDA串聯(lián)靈敏度改善胎球蛋白 （糖蛋白）的胰蛋白酶分解產(chǎn)物的PDA比較14HPLC ConditionsColumn: CAPCELL PAK MF Ph ; 4.6 mm i.d. x 100 mmM.Phase: 100 mmol/L HCOONH4 / CH3CN = 80 / 20Flow rate: 1.0 mL/minTemp.: 5

13、0 Detector: NQAD 5600 (Evap.50，Neb.30） Inj.vol.: 10 mLSample: Std. 50 mg/mL, (Carbamazepin, Fenitoin)生物樣品（血清）MF色譜柱在血清樣品中添加卡馬西平和苯妥英后直接進樣分析Minutes在流動相中添加高濃度鹽并使用MF色譜柱的分析條件下，也可以檢出Std. 500 ng each.血清Std.500 ng each.S/N 16S/N 1102468101214蛋白卡馬西平苯妥英15親水性化合物單糖二糖HPLC ConditionsColumn: Asahipak NH2P-40 3E 4 m

14、m ; 3.0 mm i.d. x 250 mm (Shodex）M.Phase: 2O / CH3CN = 20 / 80 Flow rate: 500 mL/minTemp.: 30 Detector: NQAD 5600 (Evap.35，Neb.30）Inj.vol.: 5 mLSample: 50 ng each.1. 鼠李糖2. 果糖3. 葡萄糖4. 蔗糖5. 麥芽糖一水化合物50 ng each on column檢出下限（LOD）： 2030 ng12345Glucose16Column： CAPCELL CORE AQ S2.7 ; 4.6 mm i.d. x 100 mmM

15、.phase： H2O / CH3CN = 85 / 15Flow rate： 1 mL/minTemp.： 40 Detector： NQAD 5600 (Evapo.45，Neb.30Filter 1.3s) Inj.vol.： 10 mLSample： H2ORI10 ng on column（S/N = 5）NQAD靈敏度約是RI的100倍SucraloseM.W. 397.63111000 ng on column（S/N = 5）三氯蔗糖（二糖）與RI的比較17HPLC ConditionsColumn: Asahipak NH2P-40 3E 4mm; 3.0 mm i.d. x

16、 250 mm (Shodex）M.Phase: 2O / CH3CN = 15 / 85 Flow rate: 500 mL/minTemp.: 30 Detector: NQAD 5600 (Evap.35，Neb.30）Inj.vol.: 5 mLSample: 50 ng each.123412.5 mg5 mg0.5 mg1. 赤蘚糖醇2. 木糖醇3. 山梨醇4. 甘露醇123450 ng each親水性化合物糖醇 檢出下限 510ng標準曲線的相關(guān)系數(shù)（） 0.9900.999 18Fig. 1 LC-MS/MS of pretreated serum samplespiked w

17、ith reserpine at 500 ng/mLLC-MS/MSFig. 2 Signal response observed with NQADfor the same sample as that of Fig.1預計在日本質(zhì)量分析綜合討論會發(fā)表可以作為LC-MS的輔助檢測器利血平 609195通過MSNQAD的并聯(lián)，容易把握基質(zhì)和共存物質(zhì)的影響利血平檢測出基質(zhì)及共存物質(zhì)19總結(jié)NQAD可以適用于幾乎所有不揮發(fā)及半揮發(fā)物質(zhì)的檢測NQAD對揮發(fā)性物質(zhì)無響應這一性質(zhì)可以加以利用（蛋白、多肽的梯度分析）NQAD可以分析幾個ng的糖在把握樣品質(zhì)量組成信息方面，和質(zhì)譜儀可以相互補充。20P-1P

18、-2【HPLC條件】Column： CAPCELL PAK C18 MGIII S3 ; 2.0 mm i.d. 50 mmM.Phase： A) 0.1 vol% HCOOH, B) CH3CN B% 10%(0min)70%（3min)70%（4min)10%（4.1min）Flow rate： 0.4 mL/min Temp.： 50 Detector： NQAD 5600 (Evap.35 ，Neb.30 ，F(xiàn)ilter OFF)Inj.Vol： 3 mL參考：梯度條件6種磺胺類B 10%B 70%Gradient curve梯度條件下，增加有機溶劑量，峰強和峰面積有增大的趨勢1.Sulfadiazine2.Sulf