實驗?zāi)[瘤學基本概念培訓課件

1、實驗?zāi)[瘤學基本概念實驗?zāi)[瘤學基本概念腫瘤發(fā)生發(fā)展的一般過程正常細胞 癌細胞 原位癌 浸潤癌 轉(zhuǎn)移癌 休 眠 預(yù)防 診斷 治療實驗?zāi)[瘤學基本概念2腫瘤發(fā)生發(fā)展的一般過程正常細胞 癌細胞 原位癌 腫瘤細胞的生物學特點自我滿足的生長信號 對生長抑制信號不敏感 逃避凋亡 無限增殖的潛能 血管生成 浸潤和轉(zhuǎn)移實驗?zāi)[瘤學基本概念3腫瘤細胞的生物學特點自我滿足的生長信號實驗?zāi)[瘤學基本概念3實驗?zāi)[瘤模型的要求忠實地重現(xiàn)人類腫瘤的生物學特性實驗?zāi)[瘤學基本概念4實驗?zāi)[瘤模型的要求忠實地重現(xiàn)人類腫瘤的生物學特性實驗?zāi)[瘤學基實驗?zāi)[瘤學的研究方法實驗?zāi)[瘤學基本概念5實驗?zāi)[瘤學的研究方法實驗?zāi)[瘤學基本概念5直接研究建立細

2、胞系建立動物模型實驗?zāi)[瘤學基本概念6直接研究實驗?zāi)[瘤學基本概念6細胞系的基本概念組織培養(yǎng)和細胞培養(yǎng)：模擬體內(nèi)環(huán)境在體外培養(yǎng)機體組織和細胞，使之生存和生長。原代培養(yǎng)（primary culture）:從體內(nèi)取出組織和細胞的第一次培養(yǎng)。傳代（passage）：細胞長滿培養(yǎng)瓶后，細胞分成2-3瓶繼續(xù)培養(yǎng)。細胞系（cell line）:原代培養(yǎng)細胞首次傳代成功后的細胞，稱細胞系。Finite cell line, continuous cell line, established cell line細胞株(cell strain):通過選擇或克隆，從親代細胞系選出的帶有特定標志的細胞群。瘤株：在動物體

3、內(nèi)可傳代的腫瘤細胞系。ATCC American Type Culture Collection 美國模式培養(yǎng)物收集中心, 美國菌種保存中心實驗?zāi)[瘤學基本概念7細胞系的基本概念組織培養(yǎng)和細胞培養(yǎng)：模擬體內(nèi)環(huán)境在體外培養(yǎng)機培養(yǎng)細胞的生長方式貼附生長型細胞：細胞附著于支持物表面生長。 上皮細胞型：來源于外胚層和內(nèi)胚層的細胞，細胞為扁平多角形，細胞之間緊密相靠成片。 成纖維細胞型：來源于中胚層的細胞，細胞呈梭形，排列成漩狀、放射狀、柵欄狀。懸浮生長型：造血系統(tǒng)的細胞實驗?zāi)[瘤學基本概念8培養(yǎng)細胞的生長方式貼附生長型細胞：細胞附著于支持物表面生長。培養(yǎng)細胞的生長特點貼附生長：支持物可為玻璃、塑料、膠原、

4、其他細胞等。 停泊或貼壁依賴性細胞（anchorage-dependent cell)接觸抑制(contact inhibition)：正常細胞相互接觸后，細胞將向另一個方向移動，從而使細胞不會重疊生長。密度抑制(density inhibition)：正常細胞匯合成片后細胞分裂停止，在靜止狀態(tài)下細胞存活一段時間 匯合 confluent實驗?zāi)[瘤學基本概念9培養(yǎng)細胞的生長特點貼附生長：支持物可為玻璃、塑料、膠原、其他培養(yǎng)條件基本營養(yǎng)成分 RPMI1640 DMEM (Dulbeccos modified Eagle medium) 谷氨酰胺生長因子 小牛血清 胎牛血清 滅活補體 56 30mi

5、n 環(huán)境 37 pH 7.2-7.4 滲透壓 無污染無毒 細菌、支原體 實驗?zāi)[瘤學基本概念10培養(yǎng)條件基本營養(yǎng)成分 RPMI1640 DMEM (Du體外培養(yǎng)的優(yōu)點優(yōu)點：1.活細胞， 2.對象均勻，易控制實驗條件，易于觀察和紀錄實驗結(jié)果 3.易研究單個細胞的結(jié)構(gòu)和功能，易于進行分子生物學水平研究， 4.實驗周期短，成本低，細胞系可長期保存。實驗?zāi)[瘤學基本概念11體外培養(yǎng)的優(yōu)點優(yōu)點：1.活細胞，實驗?zāi)[瘤學基本概念11體外培養(yǎng)的缺點 1.在體外細胞生物學行為與在體內(nèi)不完全一樣， G1 G0 終末分化腫瘤細胞 M S介質(zhì)細胞 G2實驗?zāi)[瘤學基本概念12體外培養(yǎng)的缺點 1.在體外細胞生物學行為與在體內(nèi)

6、不完全一樣，2.轉(zhuǎn)化（transformation）: 在體外培養(yǎng)過程中細胞的遺傳性狀發(fā)生變化。分為一般轉(zhuǎn)化和惡性轉(zhuǎn)化。 一般轉(zhuǎn)化：指細胞獲得不死性。 惡性轉(zhuǎn)化：指出現(xiàn)在軟瓊脂培養(yǎng)基中浸 潤生長；在動物體內(nèi)成瘤；血清依賴性降低；生長密度依賴性降低。3. 體外實驗結(jié)果不能外推到體內(nèi)實驗實驗?zāi)[瘤學基本概念132.轉(zhuǎn)化（transformation）: 在體外培養(yǎng)過程中細胞培養(yǎng)的應(yīng)用研究細胞與環(huán)境的相互作用細胞間的相互作用細胞內(nèi)胞質(zhì)活動細胞質(zhì)與細胞核之間的流動實驗?zāi)[瘤學基本概念14細胞培養(yǎng)的應(yīng)用研究細胞與環(huán)境的相互作用實驗?zāi)[瘤學基本概念14建立細胞系的基本要求細胞在體外培養(yǎng)半年以上，生長穩(wěn)定，保持細

7、胞特征并能傳代。實驗?zāi)[瘤學基本概念15建立細胞系的基本要求細胞在體外培養(yǎng)半年以上，生長穩(wěn)定，保持細建系方法1.原代培養(yǎng)：無菌操作， 取腫瘤組織，切成小片，小于0.5毫米，進行培養(yǎng)， 或用胰酶、膠原酶消化成單細胞懸液，血清滅活酶，培養(yǎng)2.傳代：待細胞長滿培養(yǎng)瓶，胰酶消化，按1：2-3傳代3.去除雜細胞4.凍存細胞 10%DMFO+90%胎牛血清， 4 30min, -20 2hrs, -70 過夜, 液氮，長期保存。登記，定期復(fù)蘇細胞。復(fù)蘇：37 水浴，加培養(yǎng)基洗一次，培養(yǎng) 5.鑒定實驗?zāi)[瘤學基本概念16建系方法1.原代培養(yǎng)：無菌操作， 取腫瘤組織，切成小片，小于鑒 定細胞形態(tài)觀察 癌細胞多角型

8、，重疊生長， 核漿比例失調(diào)，多核巨細胞染色體分析 數(shù)量和核型、核帶，標記染色體細胞生長曲線和細胞周期集落形成率動物接種 成瘤， 組織形態(tài)學與原發(fā)腫瘤相似污染 無病毒、支原體污染、細胞間交叉污染 Hela cell: 1951年 Henrietta Lack 宮頸癌 實驗?zāi)[瘤學基本概念17鑒 定細胞形態(tài)觀察 癌細胞多實驗動物基礎(chǔ)知識實驗?zāi)[瘤學基本概念18實驗動物基礎(chǔ)知識實驗?zāi)[瘤學基本概念18法 規(guī)1988年 中華人民共和國實驗動物管理條例1989年 醫(yī)學實驗動物管理實施細則1994年 關(guān)于在全國醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)實行實驗動物合格證制度得通知 （醫(yī)學實驗動物合格證書，醫(yī)學實驗動物環(huán)境設(shè)施合格證書，醫(yī)學實

9、驗動物全價營養(yǎng)飼料合格證書，醫(yī)學實驗動物飼料生產(chǎn)條件合格證書）1988年 廣東省實驗動物管理辦法實驗?zāi)[瘤學基本概念19法 規(guī)1988年 中華人民共和國實驗動物管理條例基本概念 實驗動物（laboratory animal）:指人工培育的、對其攜帶微生物實行控制、來源清楚、遺傳背景清晰、可用于科學實驗得動物。 實驗用動物（animal for research）:能用于科學實驗的動物，包括實驗動物、野生動物、經(jīng)濟動物和觀賞動物。 標準化實驗動物：有明確的遺傳背景、繁殖方法、飼養(yǎng)環(huán)境、飼料成分均達到標準的實驗動物。在科學研究中必須使用標準化實驗動物。實驗?zāi)[瘤學基本概念20基本概念 實驗動物（lab

10、oratory animal實驗動物的分類(遺傳背景)近交系（純系）：連續(xù)20代以上兄妹交配或親子交配 而獲得的遺傳上達到一致的動物群。如BLAB/c小鼠。雜交群: 兩個近交系動物間有計劃進行交配獲得的第一代動物。封閉群：由同一血緣品系進行自由交配，在固定場所保存繁殖5年以上得動物群，如Wistar 大鼠、SD大鼠。突變系：正常染色體基因突變導致遺傳缺陷的動物，如裸鼠實驗?zāi)[瘤學基本概念21實驗動物的分類(遺傳背景)近交系（純系）：連續(xù)20代以上兄妹按微生物控制分類一級：普通動物，不攜帶人畜共患疾病病原體的動物。二級：清潔動物，不攜帶人畜共患疾病病原體和動物傳染病病原體的動物。三級：無特定病原體

11、的動物（specific pathogen free,SPF）, 動物體內(nèi)不存在特定病原微生物和寄生蟲的實驗動物。四級：無菌動物，不存在微生物和寄生蟲的實驗動物。 一級動物只能用于教學和某些研究的預(yù)實驗，衛(wèi)生部以上課題和研究生課題必須使用二級以上動物實驗?zāi)[瘤學基本概念22按微生物控制分類一級：普通動物，不攜帶人畜共患疾病病原體的動免疫缺陷動物實驗?zāi)[瘤學基本概念23免疫缺陷動物實驗?zāi)[瘤學基本概念23裸小鼠（ nude mice）1962年英國發(fā)現(xiàn)。鼠11號染色體裸基因nu是隱性突變基因。裸基因純合子（nu/nu）鼠的特征:1. 全身無毛，裸體外表。2. 胸腺上皮細胞不能增殖，T細胞發(fā)育受阻，T細

12、胞免疫缺陷。3.B 細胞形態(tài)正常，功能較差，免疫球蛋白以 Ig M 為主，少量Ig G ，類似于人原發(fā)細胞免疫缺陷。 隨著鼠齡增加， T細胞增加，移植實驗一般用4-8周鼠。4. 裸小鼠抵抗力差，易患病毒性肝炎和肺炎，應(yīng)飼養(yǎng)在SPF 環(huán)境。5. 純合型雌鼠不能生育，/nu/+和/nu/nu交配可獲 1/2 純合子鼠。 常用BALB/c nu/nu, Swiss nu/nu, NC nu/nu 。實驗?zāi)[瘤學基本概念24裸小鼠（ nude mice）1962年英國發(fā)現(xiàn)。鼠11號染應(yīng) 用建立人腫瘤的裸鼠移植瘤模型 研究致癌機理：1在裸鼠體內(nèi)誘發(fā)人類腫瘤：EBV 2生物因素的致瘤性：多瘤病毒只在新生鼠或

13、幼鼠誘發(fā)腫瘤，而在成年裸鼠也可在遠離注射部位誘發(fā)腫瘤，在雌鼠為乳腺癌，雄鼠為骨肉瘤。實驗?zāi)[瘤學基本概念25應(yīng) 用建立人腫瘤的裸鼠移植瘤模型 裸大鼠(nude rat)1953年蘇格蘭在遠交系hooded大鼠中發(fā)現(xiàn)，因飼養(yǎng)不當而絕種。1975年重新發(fā)現(xiàn)純合子大鼠。純合子 rnu/rnu 鼠無胸腺，缺乏功能性T細胞，抵抗力低下。實驗?zāi)[瘤學基本概念26裸大鼠(nude rat)1953年蘇格蘭在遠交系hoode嚴重聯(lián)合免疫缺陷鼠 (severe combined immune deficiency mice, SCID)1982年美國發(fā)現(xiàn)于C.B-17/ICR品系。Scid位于16號染色體，是隱性突

14、變基因。純合子scid/scid T細胞和B細胞功能缺陷，血清中無免疫球蛋白，外周血淋巴細胞數(shù)量明顯減少。NK 細胞功能正常。接受單克隆抗體雜交瘤移植后易形成腹水瘤，可獲得高純度的單克隆抗體。SCID 鼠被毛發(fā)正常，雌雄可生育。實驗?zāi)[瘤學基本概念27嚴重聯(lián)合免疫缺陷鼠 (severe combined imm動物腫瘤模型實驗?zāi)[瘤學基本概念28動物腫瘤模型實驗?zāi)[瘤學基本概念28自發(fā)腫瘤：動物自然發(fā)生的腫瘤，發(fā)病過程與人類腫瘤相似，但發(fā)病時間早晚不一，不易在短期內(nèi)得到實驗結(jié)果。實驗?zāi)[瘤學基本概念29自發(fā)腫瘤：動物自然發(fā)生的腫瘤，發(fā)病過程與人類腫瘤相似，但發(fā)病誘發(fā)腫瘤：用化學、物理、生物等因素在動物

15、體內(nèi)誘發(fā)的腫瘤。物理、生物因素誘發(fā)腫瘤的潛伏期長，發(fā)生率不穩(wěn)定，常用化學因子誘發(fā)腫瘤。常用于腫瘤病因、化學預(yù)防的研究實驗?zāi)[瘤學基本概念30誘發(fā)腫瘤：用化學、物理、生物等因素在動物體內(nèi)誘發(fā)的腫瘤。物理誘發(fā)腫瘤模型的基本要求簡單易行、易重復(fù)選擇對特定致癌物敏感的動物種系： 多環(huán)方香烴-皮膚/小鼠； 甲基卞肼亞硝胺-食道癌/大鼠； 甲基氨基偶氮苯-肝癌/大鼠恰當?shù)闹掳┪飫┝浚?動物存活率高，誘發(fā)周期短。誘發(fā)的腫瘤類似于人類腫瘤實驗?zāi)[瘤學基本概念31誘發(fā)腫瘤模型的基本要求簡單易行、易重復(fù)實驗?zāi)[瘤學基本概念31原位誘發(fā)：如：0.25二已基亞硝胺 0.251 ml 灌胃6月， 70發(fā)生肝癌異位誘發(fā)：將與致

16、癌物作用過的器官或組織移植于自體或同系、同基因正常動物皮下，誘發(fā)所需的腫瘤。如：甲基膽蒽穿線法穿入幼鼠子宮頸，將子宮頸切除，移植于同系成年小鼠皮下，3個月后誘發(fā)異位子宮頸癌實驗?zāi)[瘤學基本概念32原位誘發(fā)：如：0.25二已基亞硝胺 0.251 ml 灌可移植性腫瘤 腫瘤組織在同種或異種動物體內(nèi)傳代后獲得的生物學特性學相對穩(wěn)定的腫瘤。實驗?zāi)[瘤學基本概念33可移植性腫瘤 腫瘤組織在同種或異種動物體內(nèi)傳代后獲得的生實驗?zāi)[瘤學基本概念培訓課件移植部位原位移植（orthotopic implantation）異位移植(ectopic implantation) 皮下、腎包膜下、腹腔實驗?zāi)[瘤學基本概念35移

17、植部位原位移植（orthotopic implantati可移植性腫瘤的參考標準傳15-20代以上接種成活率100%，自發(fā)消消退率2年)的狀態(tài),此時腫瘤細胞處于G0期或增殖和凋亡相平衡。微小轉(zhuǎn)移灶（micro-metastasis）:在原發(fā)灶以外用常規(guī)臨床檢查方法不能發(fā)現(xiàn)的腫瘤病灶微小殘留灶：治療后在原發(fā)灶遺留的小量腫瘤細胞實驗?zāi)[瘤學基本概念41腫瘤休眠（tumor dormancy）腫瘤細胞在機體內(nèi)持續(xù)轉(zhuǎn)基因動物腫瘤模型理論基礎(chǔ)：1 腫瘤是癌基因突變/抑癌基因失活的結(jié)果 2 基因功能在進化中是保守的 實驗?zāi)[瘤學基本概念42轉(zhuǎn)基因動物腫瘤模型理論基礎(chǔ)：1 腫瘤是癌基因突變/抑癌基因失轉(zhuǎn)基因動物

18、外源基因在動物染色體穩(wěn)定整合并遺傳給后代的動物。用途：生物醫(yī)藥 基因表達調(diào)控 單基因表達調(diào)控 多基因表達調(diào)控 基因敲除（knock out)實驗?zāi)[瘤學基本概念43轉(zhuǎn)基因動物外源基因在動物染色體穩(wěn)定整合并遺傳給后代的動物。實轉(zhuǎn)基因方法 DNA 逆轉(zhuǎn)錄病毒/DNA轉(zhuǎn)染 胚胎干細胞 顯微注射受精卵 四細胞胚胎 囊胚 原腸胚 轉(zhuǎn)基因動物 顯微注射 逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA DNA實驗?zāi)[瘤學基本概念44轉(zhuǎn)基因方法 纖維注射與逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染的比較轉(zhuǎn)基因方式 顯微注射 逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染DNA導入 50kb,單細胞受精卵 10-15kb,46細胞卵培養(yǎng)液 M16 高營養(yǎng)液移卵 輸卵管 子宮整合 隨機整合，多拷貝 隨機整合，嵌合