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文檔簡介
1、遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)第九章 重點(diǎn)內(nèi)容提示基因操作,重組DNA技術(shù),原理,步驟限制性內(nèi)切酶:命名、識(shí)別順序、切口(平末端,粘末端)基因載體(vector),條件,常用載體基因探針,來源克隆(clone)探針標(biāo)記方法:nick translation (缺口平移)、隨機(jī)引物法DNA多態(tài),RFLP ,VNTR,STR ,微衛(wèi)星DNAPCR 方法、原理、應(yīng)用Southern Blot:方法、原理、應(yīng)用 Northern-Blot:方法、原理、應(yīng)用2遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)第九章 重點(diǎn)內(nèi)容提示基因操作,重組DNA技術(shù),原理,步驟 Chapter 9 基因操作 70年代以來,分子生物
2、學(xué)技術(shù)迅速發(fā)展起來,使人們有可能進(jìn)行人類基因組及單個(gè)基因的結(jié)構(gòu)研究,分析其功能特征,了解其變化規(guī)律。分子生物學(xué)技術(shù)為揭示人類遺傳病的本質(zhì)起著重要作用。下面就一些分子生物學(xué)技術(shù)予以介紹。3遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí) Chapter 9 基因操作 70年代以來,分子生物學(xué)1946 1950 1955 1960 19651970 1975 1980 1985 1990 19951944DNA是遺傳物質(zhì)1949Hbs貧血1953雙螺旋1956HbsGlu-Val1966遺傳密碼第一個(gè)R酶1972重組質(zhì)粒1975DNA雜交1977DNA測(cè)序1981轉(zhuǎn)G小鼠1983HD病G定位1985PCR1986位置克隆1
3、987G剔除小鼠1989位置克隆1990第一個(gè)基因治療1995細(xì)菌G組序列1996酵母基因組序列現(xiàn)代分子遺傳學(xué)發(fā)展重要事件4遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)1946 1950 1955 第一節(jié) 重組DNA技術(shù)基因工程 重組DNA技術(shù)是現(xiàn)代分子生物技術(shù)發(fā)展中最重要的成就之一。即是基因工程(Gene Engineering)的核心技術(shù)。重組DNA技術(shù)(Recombinant DNA Technique)是人類根據(jù)需要選擇目的基因(DNA片段)在體外與基因運(yùn)載體重組,轉(zhuǎn)移至另一細(xì)胞或生物體內(nèi),以達(dá)到改良和創(chuàng)造新的物種和治療人類疾病的目的。這一技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用,關(guān)鍵在于限制酶的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用。 5遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)
4、知識(shí) 第一節(jié) 重組DNA技術(shù)基因工程 重組DNA技術(shù)是現(xiàn)代 一、限制酶 限制性內(nèi)切核酸酶(restrictive endonucle-ases),又稱限制酶。是特異性地切斷DNA鏈中磷酸二酯鍵的核酸酶。(“分子手術(shù)刀”)發(fā)現(xiàn)于原核生物體內(nèi),現(xiàn)已分離出100多種,幾乎所有的原核生物都含有這種酶。是重組DNA技術(shù)和基因診斷中重要的一類工具酶。6遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí) 一、限制酶 限制性內(nèi)切核酸酶(restrictive 1、限制酶的命名 根據(jù)其來源命名。如: 屬名 菌株名 E co R I 種名 編號(hào)EcoRI來源于大腸桿菌E.coli的RY13菌株,I指在該菌株中分離的第一個(gè)限制酶。7遺傳學(xué)醫(yī)用
5、主題醫(yī)學(xué)知識(shí)1、限制酶的命名 根據(jù)其來源命名。如:7遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知2、限制酶識(shí)別序列和切割形式 每種限制酶能識(shí)別和切割的通常48個(gè)核苷酸序列,稱為限制性位點(diǎn)(restriction sites)或切點(diǎn)。 如:Hare III 5-GGCC- 3 3-CCGG- 5 Bam HI 5-GGATCC-3 3-CCTAGG- 5 平末端(blunt end) 對(duì)稱軸切,連接效果差切割形式 粘性末端(sticky end)交錯(cuò)切8遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)2、限制酶識(shí)別序列和切割形式 每種限制酶能識(shí)別和切割的通常49遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)9遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)5 C T G C A G 33 G
6、A C G T C 55 G G A T C C 33 C C T A G G 55 G A T C 33 C T A G 55 G G 3 C CC C 3G G 55 G G C C 33 C C G G 5HaeMboBamHPst5 3 C T A G 55 G A T C 3 55 G3 C C T A G 55 G A T C C 3G 55 C T G C A 33 GG 33 A C G T C 5限制性內(nèi)切核酸酶10遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)5 C T G C A G 35 G G 互補(bǔ)末端連接11遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)互補(bǔ)末端連接11遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)12遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)
7、知識(shí)12遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)產(chǎn)生相同序列的突出末端的不同片段可有三種方式:1)用同一種限制酶切割;2)用識(shí)別相同靶序列的不同限制酶切割;3)用識(shí)別不同靶序列但可產(chǎn)生一致的粘性末端的限制酶切割。13遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)產(chǎn)生相同序列的突出末端的不同片段可有三種方式:1)用同一3、特點(diǎn): 根據(jù)上述限制酶的特點(diǎn),在基因工程和基因診斷中的重要用途:不論DNA的來源如何,同一種限制酶切割后產(chǎn)生的粘性末端容易重新連接。因此可將不同種屬的DNA重組。如人和質(zhì)粒DNA等。用于人類基因組的DNA分析,具特定的酶切位點(diǎn)。Gene突變改變酶切位點(diǎn)的消失或新產(chǎn)生將改變酶切片段長度。應(yīng)用于限制性片段多態(tài)性分析。14遺
8、傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)3、特點(diǎn): 根據(jù)上述限制酶的特點(diǎn),在基因工程和基因診斷中二、基因運(yùn)載體及其選擇 載體(Vector):將外源目的DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞,并能自我復(fù)制和增殖的工具。15遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)二、基因運(yùn)載體及其選擇 載體(Vector):將外源目的DN載體具以下特征: 1)分子量小,便于攜帶較大的DNA片段,能進(jìn)入宿主細(xì)胞并在其中增殖; 2)有多種限制酶切點(diǎn),每種限制酶最好只有單一切點(diǎn); 3)被切割后的載體,插入外源DNA后,不影響其復(fù)制能力,并有可選擇的標(biāo)記基因(如,抗藥基因)。常用的載體:質(zhì)粒,噬菌體,粘粒,BAC,YAC,PI等。16遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)載體具以下特征:16
9、遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)(一)質(zhì)粒 plasmid Plasmid 獨(dú)立于細(xì)菌染色體外的雙鏈環(huán)DNA分子。 PBR322 大腸桿菌 pSC101 Plasmid chromosome COIEI plasmid 革蘭氏陰性菌 pc194 scp12 真核生物-酵母質(zhì)粒 17遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)(一)質(zhì)粒 plasmid Plasmid 獨(dú)立于細(xì)菌染 常用的質(zhì)粒如pUC19,多連接子MCS。插入外源基因片段長度約10kb。將外源基因插入到MCS中,隨質(zhì)粒的表達(dá)而表達(dá),增殖而擴(kuò)增。外源基因插入到MCS后,-半乳糖苷酶的活性喪失而不顯蘭色-白色菌落。如果不插入外源基因,則產(chǎn)生蘭色色。從而篩選陽性菌落
10、。EcoRIHindIIIOri復(fù)制起點(diǎn)LacZAPRpUC1918遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí) 常用的質(zhì)粒如pUC19,多連接子MCS。插入外源基因片(二).-噬菌體(phage)是一種可在體外包裝的細(xì)菌病毒,可高效感染大腸桿菌.-噬菌體DNA是線狀雙鏈DNA分子,全長約50kb,每條鏈各帶12bp長的單鏈互補(bǔ)末端-粘末端(COS序列)。進(jìn)入宿主細(xì)胞后不久,COS序列堿基配對(duì)環(huán)化??砂b3752kb DNA分子.改建后的噬菌體發(fā)展了多種較大型的克隆載體,如:19遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)(二).-噬菌體(phage)是一種可在體外包裝的細(xì)菌置換載體 溶解途徑 載體和外源DNA整合到宿主菌DNA中。可克
11、隆23kb的外源DNA。插入載體 裂解途徑 DNA在宿主細(xì)胞中復(fù)制,然后包裝成噬菌體,裂解宿主,釋放噬菌體??煽寺?kb的cDNA。 20遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)置換載體 溶解途徑20遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)裂解途徑21遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)裂解途徑21遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)(三).粘粒(cosmid vector)(3050kb) 是將質(zhì)粒和噬菌體改建的一種載體.它含COS序列,插入一小plasmid 而得名Cosmid。改建后的粘粒含有噬菌體的復(fù)制起點(diǎn)和cos 末端。全長8kb。大片段外源DNA插入后,在體外包裝進(jìn)而被克隆??砂b3050 kb長的DNA片段,多用于基因文庫構(gòu)建。 22遺傳學(xué)醫(yī)
12、用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)(三).粘粒(cosmid vector)(3050kb)(四) 大片段DNA克隆載體 人類和哺乳動(dòng)物的基因組很大,甚至許多單個(gè)基因也相當(dāng)大(如:DMD gene 2300kb) ,克隆分析就需要更大的基因載體。如近年來構(gòu)建的一些載體:BAC,PI,YAC等。23遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)(四) 大片段DNA克隆載體 人類和哺乳動(dòng)物的基因組很大,甚1、細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial chromosome,BAC) 優(yōu)點(diǎn):能攜帶大片段DNA,約300kb。 在每個(gè)細(xì)胞中,一個(gè)載體分子能繁殖多個(gè)拷貝,高產(chǎn)DNA。缺點(diǎn):會(huì)出現(xiàn)插入片段在結(jié)構(gòu)上的不穩(wěn)定,導(dǎo)致克隆DN
13、A部分的缺失或重排。為克服上述缺點(diǎn),人們采用低拷貝數(shù)復(fù)制子載體,如,E coli中的F因子。此質(zhì)粒含有2種基因(part A, part B)。每個(gè)E coli能接受 300kbDNA片段。24遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)1、細(xì)菌人工染色體(bacterial artificial2、噬菌體PI載體和PAC PI噬菌體與噬菌體一樣,外有蛋白質(zhì)殼。內(nèi)含相當(dāng)大的(110115kb)線性DNA,并在體外包裝于PI殼內(nèi)。PI進(jìn)入宿主細(xì)胞后環(huán)化,擴(kuò)增。1994年,有人將PI和F因子克隆結(jié)合產(chǎn)生PI人工染色體克隆系統(tǒng)PAC。25遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)2、噬菌體PI載體和PAC PI噬菌體與噬菌體一樣,外有蛋3、
14、酵母人工染色體(yeast artificial chromosome, YAC)適用于克隆大片段DNA,0.22Mb。26遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)3、酵母人工染色體(yeast artificial ch27遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)27遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)YAC 的主要功能成份有三: 著絲粒:mitosis姊妹染色單體和減I同源染色體分離之必需。端粒:保護(hù)染色體末端免受核酸酶的侵襲。自主復(fù)制序列(ARS)元件:是染色體自主復(fù)制的復(fù)制起點(diǎn)。構(gòu)建YAC需要4個(gè)短序列:2個(gè)端粒,著絲粒,ARS元件,與外源DNA連接成線性DNA分子,導(dǎo)入酵母細(xì)胞克隆。 28遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)YAC 的主要功能成份
15、有三: 著絲粒:mitosis姊妹染色三、DNA重組與分子克隆化 為獲得所需的基因或特異序列,需從細(xì)胞中分離得到目的基因與載體DNA重組,并用適當(dāng)方法在宿主細(xì)胞中表達(dá),擴(kuò)增得到大量相同的DNA片段,稱為DNA克隆,亦稱分子克隆。29遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)三、DNA重組與分子克隆化 為獲得所需的基因或特異序列,需 基本原理與過程: 1、構(gòu)建重組DNA:分離純化目的基因 目的基因 + vector =重組DNA分子2、轉(zhuǎn)化:重組DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞,并在其內(nèi)增殖。 3、細(xì)胞克隆的篩選: 篩選含有重組DNA的細(xì)胞細(xì)胞克?。╟ell clone),將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞至于瓊脂表面,以刺激細(xì)胞克隆生長,這些細(xì)
16、胞是由單個(gè)細(xì)胞形成的遺傳相同的細(xì)胞群體,故稱細(xì)胞克隆。再將每個(gè)克隆移至液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)增。4、分離重組DNA克隆:即收獲擴(kuò)增的培養(yǎng)細(xì)胞,并選擇分離重組DNA。 30遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí) 基本原理與過程: 1、構(gòu)建重組DNA:分離純化目的基因30分離純化目的基因目的基因 + vector =重組DNA分子31遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)分離純化目的基因目的基因 + vector =重組DNA分vectorrestriction endonuclease重組DNA技術(shù)流程簡圖foreign DNAbacterial cell32遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)vectorrestriction endonuc
17、leaseligase重組DNA技術(shù)流程簡圖vectorrestriction endonucleaseforeign DNAbacterial cellhost33遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)ligase重組DNA技術(shù)流程簡圖vectorrestric重組DNA 和分子克隆 34遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)重組DNA34遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)重組DNA和分子克隆的幾種方法:1、從基因組中分離目的基因在細(xì)胞中克隆;2、由特定mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后再進(jìn)行 克隆3、化學(xué)合成目的基因進(jìn)行克隆4、PCR體外擴(kuò)增目的片段進(jìn)行克隆35遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)重組DNA和分子克隆的幾種方法:1、從基因組中分離目的基
18、因篩選含有重組DNA的細(xì)胞細(xì)胞克?。╟ell clone) 36遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)篩選含有重組DNA的細(xì)胞細(xì)胞克?。╟ell clone)篩查含有目的基因的細(xì)胞克隆37遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)篩查含有目的基因的細(xì)胞克隆37遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)從基因組中分離目的基因在細(xì)胞中克隆 38遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)從基因組中分離目的基因在細(xì)胞中克隆 38遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知39遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)39遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)四、目的基因表達(dá) 上述細(xì)胞的克隆系統(tǒng)可直接導(dǎo)入的目基因擴(kuò)增,獲得足夠量的目的基因來進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能的研究。 重組DNA技術(shù)的另一目的是獲得基因重組后的產(chǎn)物RNA,蛋白質(zhì)。就是將目的基
19、因與表達(dá)載體重組(含激動(dòng)子),導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)而表達(dá)出相應(yīng)的基因產(chǎn)物(蛋白)。如胰島素,干擾素;生產(chǎn)疫苗的抗原和特異的抗體等。此類克隆系統(tǒng)稱為表達(dá)克?。╡xpression cloning).40遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)四、目的基因表達(dá) 上述細(xì)胞的克隆系統(tǒng)可直接導(dǎo)入的目基因擴(kuò)增,目的基因表達(dá) 41遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)目的基因表達(dá) 41遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)(一)真核細(xì)胞的基因在原核細(xì)胞(細(xì)菌)中表達(dá) 原核細(xì)胞中缺乏真核基因表達(dá)裝置(如,RNA剪接因子等),因此不能直接表達(dá)。通常采用大腸桿菌為宿主。 真核多肽的表達(dá)要求: 1)適當(dāng)?shù)腸DNA(完整的編碼序列); 2)適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體,提供特定多肽信息
20、; 3)外部進(jìn)行表達(dá)調(diào)控,表達(dá)系統(tǒng)設(shè)計(jì)有啟動(dòng)子。 產(chǎn)物特征: 1)真核細(xì)胞的蛋白由于不能羥基化而不穩(wěn)定; 2)活性受限或無活性。42遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)(一)真核細(xì)胞的基因在原核細(xì)胞(細(xì)菌)中表達(dá) 原核細(xì)胞(二)、真核細(xì)胞基因在真核細(xì)胞中表達(dá) 真核宿主細(xì)胞提供一個(gè)相似但又不相同的環(huán)境。常采用酵母或昆蟲細(xì)胞作為宿主。應(yīng)用于真核細(xì)胞蛋白質(zhì)的大量制備,研究特定基因的表達(dá)。產(chǎn)物翻譯后羥基化,羧基化等,有加強(qiáng)蛋白的穩(wěn)定和功能活性。43遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)(二)、真核細(xì)胞基因在真核細(xì)胞中表達(dá) 真核宿主細(xì)胞提供一個(gè)相第二節(jié)、基因文庫 基因文庫(gene library) 應(yīng)用DNA重組技術(shù)構(gòu)建的含有基因
21、組的全部基因的克隆。44遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)第二節(jié)、基因文庫 一、 構(gòu)建基因組DNA文庫45遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)一、 構(gòu)建45遺傳學(xué)醫(yī)用Construction of a genomic library of human DNA in a bacteriophage vector 46遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)Construction of a genomic lib二、染色體特異的基因文庫 ( chromosome specific library) 單個(gè)染色體: 細(xì)胞克隆 (流式C儀) 細(xì)胞 染色體 染色體文庫 染色體區(qū)帶: 區(qū)帶特異 (顯微切割 ) DNA文庫 47遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)
22、二、染色體特異的基因文庫 ( chr 三、cDNA文庫(cDNA library) cDNA文庫構(gòu)建: 特定組織細(xì)胞一定發(fā)育階段 總 mRNA48遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí) 三、cDNA文庫(cDNA library) cDNA文第三節(jié) 分子雜交及相關(guān)技術(shù) 分子雜交(molecular hybridization),標(biāo)記的探針DNA變性后與變性后的靶DNA/RNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合,形成雜種分子的過程。 分子雜交包括:DNA-DNA雜交,DNA-RNA雜交及蛋白雜交等。 49遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)第三節(jié) 分子雜交及相關(guān)技術(shù) 分子雜交(molec分子雜交的目的就是運(yùn)用特異的探針鑒定復(fù)雜的靶DNA中
23、同源的DNA片段。 雙鏈probe或DNA解鏈,主要取決于: 1鏈的長度:鏈越長,需要的 能量多才能解鏈; 2堿基成分:GC含量高,較難變性; 3化學(xué)環(huán)境:單價(jià)陽離子穩(wěn)定雙鏈,甲酰胺,尿素破壞雙鏈50遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)分子雜交的目的就是運(yùn)用特異的探針鑒定復(fù)雜的靶DNA中同源的D一、基因探針(gene probe)是指與一段目的基因或DNA/RNA片段特異雜交的核苷酸序列。Probe可以是整個(gè)基因,或是基因的一部分,是DNA,也可以是RNA。DNA探針(DNA probe)RNA探針(RNA probe)寡核苷酸探針(oligonucleotide probe)單一EST探針(unique
24、EST probe)51遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)一、基因探針(gene probe)是指與一段目的基因或DN(一). 探針的種類與制備 1、基因組探針:從已建立的基因組文庫中篩選和分離所需的目的基因??寺?擴(kuò)增 大量的DNA探針52遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)(一). 探針的種類與制備 1、基因組探針:52遺傳學(xué)醫(yī)用主DNA克隆53遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)DNA克隆53遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)2、cDNA probe :從已構(gòu)建的cDNA文庫中篩查和分離目的基因探針。 54遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)2、cDNA probe :從已構(gòu)建的cDNA文庫中篩查和3、寡核苷酸probe: 克?。╟lone):是指用無
25、性繁殖的方法獲得同一個(gè)體、細(xì)胞或分子的大量復(fù)制品。根據(jù)已知基因序列合成一段互補(bǔ)的DNA片段。一般長約1550個(gè)bp。多數(shù)探針的制備都通過分子克隆的方法獲得。 55遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)3、寡核苷酸probe: 克?。╟lone):是指用無性繁殖(二)探針的標(biāo)記 將探針標(biāo)記上一種標(biāo)識(shí)物以便雜交后檢測(cè)。 常用于標(biāo)記探針的標(biāo)識(shí)物: 同位素:32P , 35S , 3H-dNTP等; 非同位素:地高辛-dNTP ,生物素-dNTP。 常用的標(biāo)記方法:56遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)(二)探針的標(biāo)記 將探針標(biāo)記上一種標(biāo)識(shí)物以便雜交后檢1、缺口平移法 (Nick Translation)原理及過程:反應(yīng)體系中D
26、NA酶I隨機(jī)在探針DNA上打開缺口,然后利用DNA聚合酶I 5 3外切酶活性,在缺口處按5 3方向切除單核苷酸;同時(shí)DNA聚合酶I有5 3的聚合酶活性,在缺口處3端加入底物中的單核苷酸,彌補(bǔ)缺口處的核苷酸鏈。隨著反應(yīng)的進(jìn)行底物中被標(biāo)記單核苷酸,并被隨機(jī)摻入。DNA聚合酶I的兩種作用交替進(jìn)行,探針即被標(biāo)記。 57遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)1、缺口平移法 (Nick Translation)原理及過Nick TranslationOHpOH+PPDNAdNTP ,DNA酶I,DNA聚合酶I32P-dNTP Bio-dNTP58遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)Nick TranslationOHpOH+PPDNA
27、dNT2、隨機(jī)引物法(6核苷酸引物標(biāo)記法) 原理及過程:利用E.coli DNA聚合酶I的Klenow亞單位,合成含有標(biāo)記核苷酸的DNA鏈。Klenow具有5 3聚合酶活性。被標(biāo)記的DNA(探針)變性成單鏈,引物與模板結(jié)合。在Klenow的催化下,以引物3端為起點(diǎn),沿模板3 5方向合成DNA新鏈。反應(yīng)體系中含有標(biāo)記的dNTP,隨機(jī)摻入新合成的DNA鏈中,探針即被標(biāo)記。59遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)2、隨機(jī)引物法(6核苷酸引物標(biāo)記法) 原理及過程:利用E.c隨機(jī)引物標(biāo)記探針53553DNA32p-dNTP,Bio-Dntp6bp primerKlenow,dNTP變性-復(fù)姓60遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)
28、隨機(jī)引物標(biāo)記探針53553DNA32p-dNTP,3、DNA末端標(biāo)記61遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)3、DNA末端標(biāo)記61遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)二、DNA雜交常用的方法 (一).Southern blot 1975年,英國科學(xué)家Southern首創(chuàng),是指DNA-DNA雜交,是經(jīng)典的基因分析方法。 1、原理和步驟: 提取T 、Cell DNA 限制酶消化 DNA片段 電泳分離 變性轉(zhuǎn)移至尼龍膜 變性、雜交 洗膜、放射自顯影、結(jié)果分析62遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)二、DNA雜交常用的方法 Southern Blot63遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)Southern Blot63遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)-+Southe
29、rn blot探針64遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)-Southern blot探針64遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)2、應(yīng) 用: (1).基因組結(jié)構(gòu)分析: 如缺失、插入、倒位等的檢測(cè)(2)RFLP連鎖分析65遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)2、應(yīng) 用: 65遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)(二).斑點(diǎn)雜交(dot and slot hybridization) 鑒定核酸序列的簡便方法。1、原理及步驟:提取T、Cell DNA 點(diǎn)樣品至膜、干燥、固定 探針、DNA變性、雜交 洗膜、放射自顯影 結(jié)果分析66遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)(二).斑點(diǎn)雜交(dot and slot hybridizDNA 樣品2、應(yīng)用:1)混合樣品DNA鑒定
30、2)基因缺失檢測(cè)3)基因表達(dá)分析 點(diǎn)樣Probe-32P檢測(cè)AB1 2 3 467遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)DNA 樣品2、應(yīng)用:點(diǎn)樣Probe-32P檢測(cè)A1 (三)等位基因特異性寡核苷酸探針雜交(allele-specific-oligonucleatide,ASO) 該技術(shù)應(yīng)用于當(dāng)基因的突變部位和性質(zhì)已完全明確,可以合成ASO探針。探針通常為20bp左右,標(biāo)記后用于雜交檢測(cè)。檢測(cè)點(diǎn)突變時(shí)一般需合成兩種探針: 設(shè)計(jì):正常探針 5-AGT-3 與正?;蛐蛄须s交 穩(wěn)定; 突變探針 5-AAT-3 與突變基因序列雜交 穩(wěn)定; PCR技術(shù)可結(jié)合ASO,即PCR-ASO技術(shù),以ASO探針檢測(cè)擴(kuò)增后的產(chǎn)
31、物突變基因檢測(cè)。68遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)(三)等位基因特異性寡核苷酸探針雜交(allele-spec例:PKU產(chǎn)前診斷正常探針突變探針12122進(jìn)行產(chǎn)前基因診斷結(jié)果分析2為正常個(gè)體69遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)例:PKU產(chǎn)前診斷正常探針突變探針12122進(jìn)行產(chǎn)前基三、Northern blot 是指DNA-RNA分子雜交,應(yīng)用特異性基因探針分 析基因的轉(zhuǎn)錄水平。1. 原理及步驟:提取 T、Cell 總 RNA 提純分離mRNA 瓊脂糖凝膠電泳分離RNA 轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜 雜交檢測(cè)70遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)三、Northern blot 是指DNA-RNA分子雜交,Norther Blot71遺
32、傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)Norther Blot71遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)2、應(yīng)用:(1)檢測(cè)mRNA長度分子量大小(依電泳遷移率估計(jì));(2)mRNA的含量,即基因表達(dá)高低。(密度掃描儀,定量分析) 72遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)2、應(yīng)用:(1)檢測(cè)mRNA長度分子量大?。ㄒ离娪具w移率四、Western blot 是蛋白水平檢測(cè),研究基因表達(dá)與功能的一種方法。 原理及步驟 T or cell 提取蛋白 聚丙烯酰胺凝膠電泳,分離蛋白 (SDS) 轉(zhuǎn)移(印跡)于硝酸纖維素膜 加抗體檢測(cè)某種特異性蛋白質(zhì)73遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)四、Western blot 是蛋白水平檢測(cè),研究基因表達(dá)與West Blot
33、 74遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)West Blot 74遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)Western blot生物素HRP化學(xué)顯色復(fù)合物ABC復(fù)合物組織抗原抗生物素一抗生物素化二抗抗HRP75遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)Western blot生物素HRP化學(xué)顯色復(fù)合物ABC復(fù)合五、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR) PCR是模擬體內(nèi)DNA復(fù)制條件,應(yīng)用DNA聚合酶反應(yīng),特異性擴(kuò)增某一DNA片段的技術(shù)。體外程序化的DNA合成技術(shù)。Kary B. Mullis76遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)五、聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reac77遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)77
34、遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)PCR78遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)PCR78遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)ACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCTTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAAStep3 : Extension 延伸72CCGTAGTAGCAGCTGCTACGTAGTaq PolymeraseTaq PolymeraseTAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATCGCATC
35、ATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGA79遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)ACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAG原 理:1) 合成待擴(kuò)增區(qū)域兩端已知序列,與模板DNA互補(bǔ)的寡核苷酸特異性引物,引物的序列決定擴(kuò)增片段的長度;2) 反應(yīng)體系:DNA模板,dNTP,Taq DNA聚合酶,buffer3) 反應(yīng)程序: 變性 ( 9495oC) 復(fù)性 延伸 ( 3755 oC) ( 7072 oC ) 72 oC延伸10min 30-35cycles DNA擴(kuò)增100萬倍80遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)原 理:1) 合成待擴(kuò)增區(qū)域兩端已知序列,與
36、模板DPCR擴(kuò)增81遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)PCR擴(kuò)增81遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)PCR特點(diǎn)及應(yīng)用:優(yōu)點(diǎn):(1)特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定可靠、快速; (2)微量的模板DNA即可擴(kuò)增大量產(chǎn)物。應(yīng)用:(1)基因組DNA分析; (2)遺傳物質(zhì)的鑒定; (3)遺傳病的診斷。缺點(diǎn):(1)需靶DNA序列的信息; (2)產(chǎn)物短小,DNA復(fù)制不精確。82遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)PCR特點(diǎn)及應(yīng)用:82遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)PCR相關(guān)技術(shù): 1)增效PCR(booster PCR) 當(dāng)擴(kuò)增少于1000拷貝的模板DNA時(shí)會(huì)遇到兩個(gè)問題: 一是形成引物二聚體,一是非特異擴(kuò)增.消耗了引物和酶,而特異擴(kuò)增片段產(chǎn)量降低。 對(duì)于這
37、種情況,可設(shè)置二步PCR,先用較低濃度的引物進(jìn)行初級(jí)PCR,此時(shí)由于引物少,形成產(chǎn)物二聚體的可能減少,但它并不影響靶序列的擴(kuò)增,只是由于引物少產(chǎn)量不高。約經(jīng)1520個(gè)循環(huán)后補(bǔ)充引物量,以初級(jí)PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行擴(kuò)增,靶序列的產(chǎn)量將相應(yīng)增加。83遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)PCR相關(guān)技術(shù): 1)增效P2)巢式PCR(nest PCR) 此時(shí)也是進(jìn)行二步PCR,與上面不同的是,第二級(jí)PCR需另行設(shè)置反應(yīng)體系,并應(yīng)用另外的PCR引物,此時(shí)引物的位置位于初級(jí)PCR引物的內(nèi)側(cè),用初級(jí)PCR產(chǎn)物做模板,進(jìn)行第二步PCR,這樣只有初級(jí)PCR中特異的擴(kuò)增片段才能被二級(jí)引物擴(kuò)增。 除了達(dá)到增效PCR同樣的目的外,還提
38、高了最終產(chǎn)物的特異性。84遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)2)巢式PCR(nest PCR)84遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)在同一PCR體系中加入若干對(duì)PCR引物,如果這些引物的退火溫度相近,并且所覆蓋的區(qū)域不重疊,這樣的反應(yīng)體系可同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)DNA片段。多重PCR常用來檢測(cè)同一基因的多個(gè)外顯子的缺失,或在檢測(cè)缺失設(shè)置內(nèi)對(duì)照。3)多重PCR85遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)在同一PCR體系中加入若干對(duì)PCR引物,如果這些引物的退火溫4)RT-PCR RT-PCR是以mRNA為模板,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶作用合成cDNA。使微量的mRNA(pg水平)迅速擴(kuò)增(達(dá)ngg水平),大大提高mRNA的檢出靈敏度。應(yīng)用于基因表達(dá)與調(diào)控的研究
39、。86遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)4)RT-PCR RT-PCR是以mRNA為模板RT-PCR87遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)RT-PCR87遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)RT-PCRcDNA88遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)RT-PCRcDNA88遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)六、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP) 是指單鏈DNA由于堿基序列不同可引起構(gòu)象差異,這種差異將造成相同或相近長度的單鏈DNA電泳遷移率不同。據(jù)此,可用于DNA中單個(gè)堿基的替代,微小的缺失或插入的檢測(cè)。通常與PCR技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用,稱為PCR-SSCP技術(shù)。在疑有突變的DNA片段附近設(shè)
40、計(jì)一對(duì)引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其產(chǎn)物經(jīng)甲酰胺等變性,并在聚丙烯酰胺凝膠中電泳(中性膠),突變所引起的DNA構(gòu)象差異將表現(xiàn)為電泳帶位置的差異,從而作出判斷。89遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)六、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single Strand ConforPCR-SSCP過程: primer 32P-dNTP摻入 PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物 變性 單鏈DNA 中性聚丙烯酰胺凝膠電泳 1 2 3 4 5 自顯影 1.為正常 結(jié)果分析 2、4、5純合患者 3.為雜合子 . 解鏈構(gòu)像DAN原 理過 程90遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)PCR-SSCP過程: PCR-SSCP過程91遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)PCR-SSCP過程91遺傳學(xué)醫(yī)
41、用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)七、DNA測(cè)序(Sequencing)Sanger法92遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)七、DNA測(cè)序(Sequencing)Sanger法92遺傳93遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)93遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)94遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)94遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)95遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)95遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)96遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)96遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)第三節(jié) DNA多態(tài)DNA多態(tài)(DNA Polymorphism): DNA區(qū)域中等位基因(或片段)存在兩種或兩種以上形式,對(duì)基因沒有影響,稱為DNA 多態(tài)。 群體中每個(gè)個(gè)體(體細(xì)胞)的兩套單倍體DNA是不完全相同的,一般每100500bp就
42、有一個(gè)是不相同的,它們多位于內(nèi)含子序列中,表型并沒有改變,這種表現(xiàn)稱為DNA多態(tài)。除一卵雙生子外,沒有兩個(gè)個(gè)體的基因組DNA是完全相同的。 常用做遺傳分析中的標(biāo)記遺傳標(biāo)記97遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)第三節(jié) DNA多態(tài)DNA多態(tài)(DNA PolymoDNA分析中常用的多態(tài)性標(biāo)記有3類:1)RFLP:稱限制性片段長度多態(tài)性,為第一代多態(tài)性標(biāo)記;2)重復(fù)序列多態(tài)性:短串聯(lián)重復(fù)序列(STR),為第二代多態(tài)性標(biāo)記;3)單堿基多態(tài)性(SNP):DNA序列的單個(gè)核苷酸的差別,為第三代多態(tài)性標(biāo)記。98遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知識(shí)DNA分析中常用的多態(tài)性標(biāo)記有3類:98遺傳學(xué)醫(yī)用主題醫(yī)學(xué)知一、序列多態(tài)(或點(diǎn)多態(tài))限制性片段長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Polymorphism ,RFLP )。 由于堿基的變異可能導(dǎo)致限制酶切點(diǎn)的消失或新的酶切點(diǎn)出現(xiàn),從而引起不同個(gè)體的DNA在用同一限制酶切割時(shí),產(chǎn)生DNA片段長度的差異。這種由于酶切位點(diǎn)變化導(dǎo)致的DNA片段長度的差異稱為RFLP。解釋RFLP分析時(shí)應(yīng)記住三項(xiàng)事件: 1) RFLP按孟德爾(共顯性)方式遺傳; 2)RFLP堿基改變本身不是致病基因原因(中
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