SDS-PAGE蛋白凝膠電泳

1、 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)SDS測定蛋白質(zhì)分子量的原理掌握垂直板電泳的操作方法。運(yùn)用SDS測定蛋白質(zhì)分子量及染色鑒定。實(shí)驗(yàn)流程配膠樣品制備電泳（1.52h）染色（20min）脫色（30min2h）分析配分離膠(下膠)配濃縮膠(上膠)實(shí) 驗(yàn) 過 程1.裝配裝置BG-verMINI型迷你垂直電泳槽 (北京百晶)2.凝膠配制 實(shí) 驗(yàn) 過 程*Acr有神經(jīng)毒 性下膠(分離膠)10%上膠(濃縮膠)5%H2O3.9ml3.4ml30%Acr-Bis3.3ml0.83mlBuffer(含SDS)(1.5M Tris-Cl pH8.8) 2.6ml(1M Tris-Cl pH6.8)

2、0.68ml10%APS200ml100mlTEMED10ml10mlTOTAL10ml5ml實(shí) 驗(yàn) 過 程3.灌膠凝膠配制過程要迅速, 催化劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝結(jié)無法注膠.注膠過程最好一次性完成,避免產(chǎn)生氣泡.1cm下膠高度，距齒下1cmAB 水封平齊，排氣泡加速聚合C棄水層凝固D灌上膠，插梳子梳需平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平加入分離膠溶液 pH 8.8封水或飽和正丁醇溶液出現(xiàn)明顯界面時，分離膠凝聚完成（ 1020min）倒出水或正丁醇，并用加樣槍/濾紙吸干制備分離膠(下膠) 封水的目的是使分離膠上表面平直，并排除氣泡。 凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面

3、。分離膠pH 8.8加入濃縮膠溶液 pH 6.8制備濃縮膠(濃縮膠)樣梳需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平。插入樣品梳1. SDS2. - mercaptoethanol 3. bromophenol blue4. GlycerolSample buffer樣品處理ssSHSH金屬浴(100)中15minSample buffer實(shí) 驗(yàn) 過 程4.上樣、電泳A. 樣品加熱，上樣B. 電泳+（1）上膠 恒壓80V (8V/cm)（2）下膠 恒壓120V (12V/cm)加入電極緩沖液pH 8.3濃縮膠pH 6.8通電分離膠pH 8.8加入樣品上樣及電泳開始電壓恒定在80V，當(dāng)進(jìn)入分離膠

4、后改為120V，溴酚藍(lán)距凝膠邊緣約5mm時，停止電泳。Staking gelSeparating gel電 流 路 徑負(fù)極正極內(nèi)槽外槽凝膠外槽實(shí) 驗(yàn) 過 程5. 染色、脫色染色20分鐘B. 脫色30分鐘至2小時考馬斯亮蘭R250蛋白質(zhì)的染色方法氨基黑 血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳考馬斯亮蘭R-250，G250 G250測定蛋白含量銀染 敏感度最高，常應(yīng)用于蛋白質(zhì)雙向電泳聚 合 原 理( )n( )n( )n( )n( )n+*Acr有神經(jīng)毒 性n決定了交聯(lián)度與濃度一起決定孔徑的大小過硫酸銨是催化劑TEMED是加速劑蛋白質(zhì)是29：1核酸是19：1實(shí) 驗(yàn) 原 理1、帶電質(zhì)點(diǎn)在電場中向帶有異相電荷的電極

5、移動，這種現(xiàn)象稱為電泳。電荷 分子大小 分子形狀實(shí) 驗(yàn) 原 理濃縮效應(yīng)Cl-Gly-Cl-Gly-Cl-Gly-PH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Gly-Gly-主要離子氯離子甘氨酸離子(pI5.97)蛋白質(zhì)離子Gly-Gly-Pr-Pr-Pr-PH8.8Pr為什么帶負(fù)電加 樣 緩 沖 液二硫鍵鹽鍵疏水作用氫鍵巰基乙醇斷二硫鍵SDS斷化學(xué)鍵帶負(fù)電荷甘油SDS：Pr=1.4:1NC氨基酸側(cè)鏈SO43-SO43-SO43-SO43-SO43-SO43-促沉溴酚蘭Tris?實(shí) 驗(yàn) 原 理濃縮效應(yīng)Cl-Cl-Cl-pH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-主要離子氯離子甘氨酸離子(pI

6、5.97)蛋白質(zhì)離子Pr-Pr-Pr-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-pH8.8快慢離子的產(chǎn)生高的電壓梯度Pr-運(yùn)動加速實(shí) 驗(yàn) 原 理濃縮效應(yīng)Cl-Cl-Cl-pH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-主要離子氯離子甘氨酸離子 (pI 5.97)蛋白質(zhì)離子Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-pH8.85%10%快慢離子的產(chǎn)生高的電壓梯度Pr-運(yùn)動加速濃縮效應(yīng)實(shí) 驗(yàn) 原 理分子篩效應(yīng)pH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-主要離子氯離子甘氨酸離子(pI5.97)蛋白質(zhì)離子pH8.85%10%甘氨酸解離增加無快慢離子Pr-根據(jù)分子量運(yùn)動分子篩

7、效應(yīng)Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-實(shí) 驗(yàn) 原 理分子篩效應(yīng)pH6.8主要離子氯離子甘氨酸離子(pI5.97)蛋白質(zhì)離子pH8.85%10%甘氨酸解離增加無快慢離子Pr-根據(jù)分子量運(yùn)動分子篩效應(yīng)Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-實(shí) 驗(yàn) 原 理分子篩效應(yīng)pH6.8pH8.85%10%lgMw電泳遷移率lgMw=-bx+KPr Mw在11.7-165Kd實(shí) 驗(yàn) 原 理分子篩效應(yīng)pH6.8pH8.85%10%遷移率=蛋白質(zhì)

8、移動的距離脫色后的膠長染色前膠長指示劑移動的距離實(shí) 驗(yàn) 原 理遷移率=“蛋白質(zhì)移動的距離”指示劑移動的距離染色前染色后蛋白質(zhì)的帶在哪呢？L1L2L3L4LxL1 X L3L2 X L4PageRuler Prestained Protein Ladder A prestained SDSMW marker with contrasting colored reference bands at 10 and 70kDa.注意事項(xiàng)采用此法測蛋白質(zhì)分子量時，必須完全打開二硫鍵。多亞基蛋白問題有些蛋白質(zhì)不能用SDS測定分子量。如電荷異?；驑?gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)

9、蛋白，如膠原蛋白等。思考題在不連續(xù)體系SDS中,當(dāng)分離膠加完后,需在其上加一層水,為什么?電極緩沖液中甘氨酸的作用?在不連續(xù)體系SDS中,分離膠與濃縮膠中均含有TEMED和AP,試述其作用?樣品液為何在加樣前需在沸水中加熱幾分鐘?976644292014MarkerTanon-1600數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)GIS 1D 圖像分析軟件(Ver. 4.00)誘導(dǎo)前后蛋白表達(dá)差異IPTG誘導(dǎo)表達(dá)His-GFP融和蛋白（31.9kD）。1為誘導(dǎo)前，26分別為誘導(dǎo)0.5, 1, 1.5, 2, 2.5hrs。 電泳過程中的不正?，F(xiàn)象1 “微笑”現(xiàn)象指示劑前沿呈現(xiàn)兩邊向上的曲線形，主要是由于凝膠的中間部分凝

10、固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。 處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2 皺眉現(xiàn)象 由于垂直電泳槽的裝置不合適引起的，特別是當(dāng)明膠和玻璃板組成的“三明治底部有氣泡”或靠近隔片的凝膠聚合不完全處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。 3 “拖尾”現(xiàn)象樣品溶解不佳引起或分離膠濃度過大 解決辦法：加樣前離心選擇合適的樣品緩沖液和凝膠緩沖液加增溶試劑降低凝膠濃度4 “紋理”現(xiàn)象樣品中的不溶性顆粒引起的解決辦法：增加溶解度離心除去不溶性顆粒5 偏斜現(xiàn)象電極放置不平行或加樣位置偏斜引起6-2 整塊膠分離的條帶太寬 主要是未濃縮好的原因 處理辦法：適當(dāng)增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的 pH 正

11、確 （6.7） ；適當(dāng)降低電壓； 6-1 某一條泳道條帶太寬加樣量太多或者加樣孔泄露引起7. “鬼帶” “鬼帶”就是在跑大分子、構(gòu)象復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子時，常會出現(xiàn)在泳道頂端（有時在濃縮膠中）的一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要由于還原劑在加熱的過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標(biāo)條帶大，有時不能進(jìn)入分離膠。但它卻與目標(biāo)條帶有相同的免疫學(xué)活性， WB 反應(yīng)中可見其能與目標(biāo)條帶對應(yīng)的抗體作用。 處理辦法： 在加熱煮沸后， 再添加適量的 DTT 或 Beta 巰基乙醇， 以補(bǔ)充不足的還原劑；或可加適量 EDTA 來阻止還原

12、劑的氧化。 謝謝!附：蛋白質(zhì)的提取與定量方法蛋白質(zhì)提取不同來源，不同的方法提 取 原 則細(xì)胞的破碎合適的裂解液一般在冰上進(jìn)行加入適當(dāng)?shù)牡鞍酌敢种苿┎溉轭惣?xì)胞的裂解液-RIPA50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM NaCl, 1% NP-40（乙基苯基聚乙二醇，常用非離子性去垢劑 ）, 0.1% SDS蛋白酶抑制劑抑制劑靶蛋白酶PMSF 苯甲基磺酰氟絲氨酸蛋白酶EDTA金屬蛋白酶Leupeptin 亮肽素絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶Aprotinin 抑肽酶胰蛋白酶及糜蛋白酶Pepstatin 抑肽素天冬氨酸蛋白酶定量方法紫外吸收法BCA法Lowry法Bradford法以雙縮脲為基礎(chǔ)的方法1. BCA法bicinchoninic acid二奎啉甲酸法以雙縮脲為基礎(chǔ)的方法2. lowry法 folin酚法 磷鎢酸和磷鉬酸 鎢藍(lán)、鉬藍(lán)BCA和Lowry法比雙縮脲靈敏高100倍 0.005 - 0.10 mg/ml Bradford法考馬斯亮藍(lán)G250染色法此法根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合的原理設(shè)計(jì)的。與蛋白質(zhì)結(jié)合后，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，反