等電聚焦電泳精品課件

1、等電聚焦電泳第1頁，共21頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)39分，星期二背景介紹 等電聚焦電泳技術(shù)（isoelectric focusing，IEF）是1980年慕尼黑工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)和化學(xué)分析研究所的Radola B J發(fā)展起來，并經(jīng)國(guó)外一些種子檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室改進(jìn)的一種非常實(shí)用的電泳技術(shù)，廣泛應(yīng)用于生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。 該方法是利用蛋白質(zhì)具有兩性解離及等電點(diǎn)的特征，加入有pH梯度的凝膠介質(zhì)中，在電場(chǎng)內(nèi)經(jīng)過一定時(shí)間后，各組分將分別聚焦在各自等電點(diǎn)相應(yīng)的pH位置上，形成分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶。主要特點(diǎn)是：靈敏度及分辨率高、重復(fù)性好，特別適用于大批量純度檢測(cè)和真實(shí)性鑒定以及遺傳多樣性等群體生物學(xué)領(lǐng)域的研究。第

2、2頁，共21頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)39分，星期二基本原理 等電聚焦電泳(IEF)是利用兩性電解質(zhì)載體形成一個(gè)連續(xù)而穩(wěn)定的線性pH梯度，將兩性電解質(zhì)加入盛有pH梯度緩沖液的電泳槽中，當(dāng)其處在低于其本身等電點(diǎn)的環(huán)境中則帶正電荷，向負(fù)極移動(dòng)；若其處在高于其本身等電點(diǎn)的環(huán)境中，則帶負(fù)電向正極移動(dòng)。當(dāng)泳動(dòng)到其自身特有的等電點(diǎn)時(shí)，其凈電荷為零，泳動(dòng)速度下降到零，具有不同等電點(diǎn)的物質(zhì)最后聚焦在各自等電點(diǎn)位置 ，形成一個(gè)個(gè)清晰的區(qū)帶，分辨率極高。第3頁，共21頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)39分，星期二 如果在電泳系統(tǒng)中建立一個(gè)由陽極至陰極，pH由低到高（即環(huán)境由酸到堿）的連續(xù)而穩(wěn)定的pH梯度，則

3、處于一個(gè)系統(tǒng)的各種蛋白質(zhì)分子，將根據(jù)各自的pI值與所處位點(diǎn)的oH值的差別帶上正電或負(fù)電。第4頁，共21頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)39分，星期二第5頁，共21頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)39分，星期二載體兩性電解質(zhì)pH梯度(carrier ampholyte pH gradient)等電聚焦，即在電場(chǎng)中通過兩性緩沖離子建立pH梯度。固相pH梯度(immobilized pH gradients,IPG)等電聚焦，是利用一系列具有弱酸或弱堿性質(zhì)的丙烯酰胺衍生物滴定時(shí)，在滴定終點(diǎn)附近形成pH梯度并參與丙烯酰胺的共價(jià)聚合，形成固定的、不隨環(huán)境電場(chǎng)條件變化的pH梯度，分辨率可達(dá)0.001pH。

4、載體兩性電解質(zhì)/固相pH梯度混合技術(shù)，即在固相pH梯度凝膠中加入載體兩性電解質(zhì)作為添加劑，被稱為“雜交等電聚焦”。 固相pH梯度等電聚焦與載體兩性電解質(zhì)等電聚焦的區(qū)別在于前者不是兩性分子，在凝膠聚合時(shí)便形成pH梯度.后者是兩性分子，在電場(chǎng)中兩性分子遷移到自己的等電點(diǎn)而形成pH梯度。IEF的分類第6頁，共21頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)39分，星期二pH梯度的形成 等電聚焦也是在電場(chǎng)下進(jìn)行的一種精密分離技術(shù)，但由于必須在電場(chǎng)的方向附加一個(gè)pH場(chǎng)，利用各溶質(zhì)遷移到pH等于其等電點(diǎn)的位置時(shí)便停止在那里而被分離。故技術(shù)的關(guān)鍵是如何形成穩(wěn)定的pH場(chǎng)以及減小對(duì)流、擴(kuò)散、散熱以及電滲的影響。對(duì)于制備型的

5、分離設(shè)備，解決以上諸問題的難度更大。 多種建立pH梯度的方法：在電場(chǎng)下利用不同pH值緩沖溶液相互擴(kuò)散，在混合區(qū)間形成pH梯度，稱人工pH梯度。但這種pH梯度易受緩沖溶液離子的遷移和擴(kuò)散而變動(dòng)，重復(fù)性差，已不被采用。利用溫度梯度建立pH梯度。因?yàn)闇囟瓤梢杂绊懢彌_液的解離度，從而使pH值改變。由于每差別一個(gè)pH單位溫度約50，故這種方法只能建立范圍很窄的pH梯度，而且不易穩(wěn)定。第7頁，共21頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)39分，星期二加入附加物質(zhì)建立pH梯度。通過把一些有機(jī)溶劑如乙醇、甘油等加到緩沖液中，利用附加物的介電常數(shù)的變化，改變了緩沖液一些組分的解離常數(shù)，可以形成1.5pH單位的pH梯度

6、。如在硼酸鹽溶液中加05%甘油和03%蔗糖，可以形成pH為78.6范圍的梯度，可分離血紅蛋白。在電極間放入含多種不同等電點(diǎn)電解質(zhì)的溶液，通電后在電極間便會(huì)形成pH梯度。這些兩性電解質(zhì)大多是一些多胺基多羧酸化合物。為了防止對(duì)流對(duì)pH梯度的干擾，可以采用加入不同濃度的中性或惰性物質(zhì)形成密度梯度的方法，也可以采用在電極間加入凝膠的方法。利用固定化兩性載體形成pH梯度。就是把具有緩沖能力的基團(tuán)或化合物用共聚或接枝的方法固定在載體上形成兩性載體。載體可以是聚丙烯酞胺凝膠或葡聚糖等。被固定的化合物可以是帶羧基的酸或帶叔胺基的堿。采用這種方法可以形成穩(wěn)定的pH梯度。但成本太高。第8頁，共21頁，2022年，

7、5月20日，5點(diǎn)39分，星期二固定化兩性載體和兩性緩沖液相結(jié)合。利用離子交換劑建立pH梯度。Sluyterma(1978)利用離子交換劑建立一個(gè)有pH梯度的柱進(jìn)行等電聚焦，稱為色譜聚集。由外循環(huán)建立的pH梯度，Rilbe(1978)在兩電極室把溶液進(jìn)行循環(huán)，以在電泳分離室中建立一個(gè)穩(wěn)定的pH梯度，稱為流動(dòng)電解。緩沖液更新的方法。在電泳過程中，溶液的離子會(huì)產(chǎn)生電遷移。在兩個(gè)電極室中離子的消耗或積累，可由外部加和或取出加以平衡，以維持電泳池中緩沖液的組成和pH等流量泵不變。流動(dòng)電解第9頁，共21頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)39分，星期二兩性介質(zhì)載體的選擇易溶于水，理想的兩性電解質(zhì)載體應(yīng)在pI處

8、有足夠的緩沖能力及電導(dǎo)，前者保證pH梯度的穩(wěn)定，后者允許一定的電流通過。不同pI的兩性電解質(zhì)應(yīng)有相似的電導(dǎo)系數(shù)從而使整個(gè)體系的電導(dǎo)均勻。兩性電解質(zhì)的分子量要小，易于應(yīng)用分子篩或透析方法將其與被分離的高分子物質(zhì)分開，而且不應(yīng)與被分離物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)或使之變性?；瘜W(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物質(zhì)不起化學(xué)反應(yīng)，也無變性作用。pH梯度制作利用的兩性電解質(zhì)是脂肪族多胺和多羧類的同系物，他們具有相近但不同的pKa和pI值。在外電場(chǎng)作用下，自然形成pH梯度。 第10頁，共21頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)39分，星期二電場(chǎng)下載體兩性電解質(zhì)的變化 在沒有電場(chǎng)時(shí),載體兩性電解質(zhì)溶液的pH值大約是該溶液pH范圍的平均值(如

9、pH3-10的載體兩性電解質(zhì)溶液,其pH約為6.5左右)。所以載體兩性電解質(zhì)分子都帶有電荷，只是在溶液中的正電荷和負(fù)電荷數(shù)目相等，凈電荷為零。 引入電場(chǎng)時(shí)，載體兩性電解質(zhì)分子分別向陰極和陽極移動(dòng)，最終在分子凈電荷為零的位置停止遷移。(1)靠近陽極端的載體兩性電解質(zhì)，電負(fù)性最強(qiáng),具有較強(qiáng)的緩沖氫離子的能力，使環(huán)境的pH等于載體兩性電解質(zhì)的pI,一直向陰極順延;(2)靠近陰極端的載體兩性電解質(zhì)，電正性最強(qiáng)，具有較強(qiáng)的緩沖氫氧根離子的能力，使環(huán)境的pH等于載體兩性電解質(zhì)的pI，一直向陽極順延。第11頁，共21頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)39分，星期二第12頁，共21頁，2022年，5月20日，5

10、點(diǎn)39分，星期二pH梯度支持介質(zhì) 常用的pH梯度支持介質(zhì)是凝膠，主要有聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠等，其中聚丙烯酰胺凝膠最為常用。第13頁，共21頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)39分，星期二循環(huán)流動(dòng)等電聚焦示意圖 循環(huán)等電聚焦 這里表示了兩個(gè)流程。一個(gè)是用虛線連接的A、C室抽出的液體經(jīng)冷卻后回到A、C室。消耗掉的電解質(zhì)由V補(bǔ)充。另一個(gè)流程是從A室抽出的液體經(jīng)冷卻后回到C室，V0。為了防止對(duì)流作用，腔室厚度不宜超過5mm.目前多采用2mm或更小。等電聚焦電泳裝置第14頁，共21頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)39分，星期二分段固定化pH梯度裝置示意圖2. 分段固定化pH梯度裝置 A、

11、B是固定化兩性電解質(zhì)段，C段為充滿載體液段，用一泵把液體循環(huán)。最后雜質(zhì)都收集到正、負(fù)極上，只余下等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)在循環(huán)。利用這個(gè)設(shè)備可以處理大量液體和分離大量的蛋白質(zhì)，而且收率很高，存在的缺點(diǎn)是固定化兩性電解質(zhì)能夠水解，使pH場(chǎng)破壞。第15頁，共21頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)39分，星期二常用電泳儀 第16頁，共21頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)39分，星期二簡(jiǎn)單操作步驟 配膠：膠液組成為載體兩性電解質(zhì)，凝膠貯液，蒸餾水，混合樣品，染色物質(zhì)等。 灌膠：注意不要產(chǎn)生氣泡。冷卻2h后可接入電泳池。 加電極液 電泳 樣品收集檢測(cè)第17頁，共21頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)39分，星期二等電

12、聚焦電泳的優(yōu)缺點(diǎn)準(zhǔn)確度和精確度較高，操作簡(jiǎn)單。IEF分離在較低的工作電壓下(20 V/cm)進(jìn)行，可以避免蛋白質(zhì)上專一結(jié)合（以共價(jià)鍵等強(qiáng)作用力結(jié)合，一定程度上依賴于蛋白質(zhì)的構(gòu)象)的金屬在電場(chǎng)作用下的丟失，這部分金屬大多構(gòu)成蛋白質(zhì)的活性中心或結(jié)構(gòu)中心，比非專一結(jié)合金屬具有更重要的生物學(xué)意義。在樣品分離方面，載體兩性電解質(zhì)pH梯度的重現(xiàn)性仍然是難以解決的問題。選用固態(tài)pH梯度可以提高分辨率，加大上樣量，受到樣品中鹽的干擾小，無邊緣效應(yīng)，并有很好的重現(xiàn)性，這對(duì)建立微量元素種態(tài)分布數(shù)據(jù)庫這樣的工作是必需的分辨率高。等電聚焦電泳屬于非變性蛋白質(zhì)分離分析技術(shù)，其分辨率至少可達(dá)0.01 pH單位。第18頁，

13、共21頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)39分，星期二pH梯度不穩(wěn)定現(xiàn)象 IEF實(shí)驗(yàn)技術(shù)不斷進(jìn)步的同時(shí)，卻一直存在著pH值梯度不穩(wěn)定的現(xiàn)象，即存在著pH梯度的陰極和陽極漂移現(xiàn)象。陰極漂移是指在IEF實(shí)驗(yàn)中pH梯度的堿性端逐漸消失的過程；反之，如果其酸性端逐漸消失則稱為陽極漂移。 為了闡明IEF中pH值梯度不穩(wěn)定的機(jī)制，出現(xiàn)了各種假說：載體兩性電解質(zhì)向陰、陽極的等速電泳（ITP）遷移；在陰極因CO2的吸附而引起陰極液組分和濃度的變化；在pH梯度的中性區(qū)域生成一段純水，水的IEF導(dǎo)致水在電泳管中的聚集并向兩端反流；不同等電點(diǎn)載體兩性電解質(zhì)的選擇性缺陷而引起的不穩(wěn)定；兩性電解質(zhì)帶電配體的進(jìn)行性地結(jié)合或分離引起的不穩(wěn)定；載體兩性電解質(zhì)相互反應(yīng)的存在而引起的不穩(wěn)定性；相對(duì)遷移的氫離子和氫氧根離子濃度的不平衡。第19頁，共21頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)39分，星期二等電聚焦電泳的應(yīng)用 IEF是一種簡(jiǎn)便、快速、高效的分離分析方法，特別適用于氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、酶類和抗體等的分離分析，能夠滿足組分定量、雜質(zhì)檢出、質(zhì)量控制、臨床診斷等方面的要求。目前等電聚焦電泳主要用于